⑴ 葡聚糖是陰性好還是陽性好我是<10
陰性好!
深部真菌感染患者血漿1-3-β-D葡聚糖
檢測的臨床意義
摘要:
目的:探討深部真菌感染血漿1-3--β-D葡聚糖檢測的臨床意義。
方法:應用MB-80微生物動態快速檢測系統及GKT-5M Set動態真菌檢測試劑盒定量檢測血漿中1-3--β-D葡聚糖的含量。結果 正常對照組血漿1-3-β-D葡聚糖含量為2.83±2.57pg/ml;深部真菌感染組為54.06±36.13 pg/ml。經T-檢驗分析,對照組與深部真菌感染組1-3-β-D葡聚糖平均值差異非常顯著(t=7.741,P<0.001)。結論 血漿葡聚糖檢測可在擬診早期為臨床醫生提供機體是否感染真菌的可*信息,是一種實用的真菌感染早期診斷方法。
⑵ 葡聚糖有多少種
β-葡聚糖是用獨特的工藝開發的一種新的產品,其來源於新鮮的食品啤酒酵母。它是一種多糖,主要化學結構β-1,3 葡聚糖和β-1,6葡聚糖,其中前者具有抗腫瘤性質,而且能夠極大地提高人體自然免疫力。
⑶ 測定糖的含量的方法有哪些
糖的測定方法
一般有四種方法:
1、 直接滴定法。
原理為 糖還原天藍色的氫氧化銅為紅色的氧化亞銅。缺點:水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響。
2、 高錳酸鉀滴定法。
所用原理同直接滴定法。缺點:水樣中的還原性物質能對糖的測定造成影響,過程較為復雜,誤差大。
3、硫酸苯酚法。
糖在濃硫酸作用下,脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物,在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比,且在485nm波長下有最大吸收峰,故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定,方法簡單,靈敏度高,實驗時基本不受蛋白質存在的影響,並且產生的顏色穩定160min以上。
缺點:如果水樣呈橙紅色(大部分水樣為黃色),會對比色法造成較大的干擾。
4、蒽酮法
糖在濃硫酸作用下,可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛,生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物,在一定范圍內,顏色的深淺與糖的含量成正比,故可用於糖的測定。
缺點:,不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同,果糖顯色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖較淺,五碳糖顯色更淺。
綜合比較;採用蒽酮法能將最為准確地測定尾水中糖的含量。
(一) 直接滴定法
Ⅰ、原理
v 一定量的鹼性酒石酸銅甲、乙液等量混合,立即生成天藍色的氫氧化銅沉澱,這種沉澱很快與酒石酸鈉反應,生成深藍色的可溶性酒石酸鉀鈉銅絡合物。在加熱條件下,以次甲基藍作為指示劑,用標液滴定,樣液中的還原糖與酒石酸鉀鈉銅反應,生成紅色的氧化亞銅沉澱,待二價銅全部被還原後,稍過量的還原糖把次甲基藍還原,溶液由藍色變為無色,即為滴定終點。根據樣液消耗量可計算出還原糖含量。
樣品經除去蛋白質後,在加熱條件下,以次甲基藍做指示劑,滴定標定過的鹼性酒石酸銅溶液(用還原糖標准溶液標定鹼性酒石酸銅溶液),根據樣品溶液消耗體積計算還原糖量。
Ⅱ、儀器和試劑
1.儀器
酸式滴定管,可調電爐(帶石棉板),250ml容量瓶。
2.試劑
1. 鹽酸。
2. 鹼性酒石酸銅甲液:稱取15g硫酸銅(CuSO4·5H2O)及0.05g次甲基藍,溶於水中並稀釋至1000mL。
3. 鹼性酒石酸銅乙液:稱取50g酒石酸鉀鈉與75g氫氧化鈉,溶於水中,再加入4g亞鐵氰化鉀,完全溶解後,用水稀釋至1000 ml,貯存於橡膠塞玻璃瓶內。
4. 乙酸鋅溶液:稱取21.9 g乙酸鋅,加3ml冰乙酸,加水溶解並稀釋至100ml。
5. 亞鐵氰化鉀溶液:稱取10.6g亞鐵氰化鉀,用水溶解並稀釋至100ml。
6. 葡萄糖標准溶液:准確稱取1.0000g經過96℃±2℃乾燥2h的純葡萄糖,加水溶解後加入5ml鹽酸,並以水稀釋至1000L。此溶液相當於1mg/ml葡萄糖(註:加鹽酸的目的是防腐,標准溶液也可用飽和苯甲酸溶液配製)。
7. 果糖標准溶液:按⑹操作,配製每毫升標准溶液相當於1mg的果糖。
8. 乳糖標准溶液:按⑹操作,配製每毫升標准溶液相當於1mg的乳糖。
9. 轉化糖標准溶液:准確稱取1.0526g純蔗糖,用100ml水溶解,置於具塞三角瓶中加5ml鹽酸(1+1),在68℃~70℃水浴中加熱15min,放置至室溫定容至1000ml,每ml標准溶液相當於1.0mg轉化糖。
Ⅲ、實驗步驟
1.樣品處理
⑴ 乳類、乳製品及含蛋白質的食品:稱取約2.50~5.00g固體樣品(吸取25~50ml液體樣品),置於250 ml容量瓶中,加50 ml水,搖勻。邊搖邊慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液,加水至刻度,混勻。靜置30 min,用乾燥濾紙過濾,棄去初濾液,濾液備用。(注意:乙酸鋅可去除蛋白質、鞣質、樹脂等,使它們形成沉澱,經過濾除去。如果鈣離子過多時,易與葡萄糖、果糖生成絡合物,使滴定速度緩慢;從而結果偏低,可向樣品中加入草酸粉,與鈣結合,形成沉澱並過濾。)
⑵ 酒精性飲料:吸取100ml樣品,置於蒸發皿中,用1 mol/L氫氧化鈉溶液中和至中性,在水浴上蒸發至原體積1/4後,移入250ml容量瓶中,加水至刻度。
⑶ 含多量澱粉的食品:稱取10.00~20.00g樣品,置於250ml容量瓶中,加200ml水,在45℃水浴中加熱1h,並時時振搖(注意:此步驟是使還原糖溶於水中,切忌溫度過高,因為澱粉在高溫條件下可糊化、水解,影響檢測結果。)。冷後加水至刻度,混勻,靜置,沉澱。吸取200ml上清液於另一250ml容量瓶中,慢慢加入5ml乙酸鋅溶液及5ml亞鐵氫化鉀溶液,加水至刻度,混勻,沉澱,靜置30 min,用乾燥濾紙過濾,棄去初濾液,濾液備用。
⑷ 汽水等含有二氧化碳的飲料:吸取100ml樣品置於蒸發皿中,在水浴上除去二氧化碳後,移入250ml容量瓶中,並用水洗滌蒸發皿,洗液並入容量瓶中,再加水至刻度,混勻後備用。(注意:樣品中稀釋的還原糖最終濃度應接近於葡萄糖標准液的濃度。)
2. 標定鹼性酒石酸銅溶液:吸取5.0ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0ml乙液,置於150ml錐形瓶中(注意:甲液與乙液混合可生成氧化亞銅沉澱,應將甲液加入乙液,使開始生成的氧化亞銅沉澱重溶),加水10 ml,加入玻璃珠2粒,從滴定管滴加約9 ml葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液,直至溶液蘭色剛好褪去為終點,記錄消耗的葡萄糖標准溶液或其他還原糖標准溶液總體積,平行操作三份,取其平均值,計算每10 ml(甲、乙液各5 ml)鹼性酒石酸銅溶液相當於葡萄糖的質量或其他還原糖的質量(mg)。(注意:還原的次甲基藍易被空氣中的氧氧化,恢復成原來的藍色,所以滴定過程中必須保持溶液成沸騰狀態,並且避免滴定時間過長。)
3. 樣品溶液預測:吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液,置於150 ml錐形瓶中,加水10 ml,加入玻璃珠2粒,控制在2 min內加熱至沸,趁沸以先快後慢的速度,從滴定管中滴加樣品溶液,並保持溶液沸騰狀態,待溶液顏色變淺時,以每兩秒1滴的速度滴定,直至溶液藍色褪去,出現亮黃色為終點。如果樣品液顏色較深,滴定終點則為蘭色褪去出現明亮顏色(如亮紅),記錄消耗樣液的總體積。(注意:如果滴定液的顏色變淺後復又變深,說明滴定過量,需重新滴定。) 當試樣溶液中還原糖濃度過高時應適當稀釋,再進行正式測定,使每次滴定消耗試樣溶液的體積控制在與標定鹼性酒石酸酮溶液時所消耗的還原糖標准溶液的體積相近,約在10ml左右。當濃度過低時則採取直接加入10ml樣品溶液,免去加水10ml,再用還原糖標准溶液滴定至終點,記錄消耗的體積與標定時消耗的還原糖標准溶液體積之差相當於10ml試樣溶液中所含還原糖的量。
4. 樣品溶液測定:吸取5.0 ml鹼性酒石酸銅甲液及5.0 ml乙液,置於150 ml錐形瓶中,加水10 ml,加入玻璃珠2粒,在2 min內加熱至沸,快速從滴定管中滴加比預測體積少1 ml的樣品溶液,然後趁沸繼續以每兩秒1滴的速度滴定直至終點。記錄消耗樣液的總體積,同法平行操作兩至三份,得出平均消耗體積。
5. 計算
樣品中還原糖的含量(以某種還原糖計)按下式計算。
X=〔A/(m×V/250×1000)〕×100
式中:X--樣品中還原糖的含量(以某種還原糖計),單位 g/100g;
A—鹼性酒石酸銅溶液(甲、乙液各半)相當於某種還原糖的質量,單位 mg;
m--樣品質量,單位 g;
V--測定時平均消耗樣品溶液的體積,單位 ml;
計算結果保留小數點後一位。
注意:
滴定結束,錐形瓶離開熱源後,由於空氣中氧的氧化,使溶液又重新變藍,此時不應再滴定。
(二)高錳酸鉀滴定法
v 原理 將樣液與一定量過量的鹼性酒石酸銅溶液反應,還原糖將二價銅還原為氧化亞銅,經過濾,得到氧化亞銅沉澱,加入過量的酸性硫酸鐵溶液將其氧化溶解,而三價鐵鹽被定量地還原為亞鐵鹽,用高錳酸鉀標准溶液滴定所生成的亞鐵鹽,根據高錳酸鉀溶液消耗量可計算出氧化亞銅的量,再從檢索表中查出氧化亞銅量相當的還原糖量,即可計算出樣品中還原糖含量。
(三)硫酸苯酚法
Ⅰ、原理
糖在濃硫酸作用下,脫水形成的糠醛和羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物,在10-100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比,且在485nm波長下有最大吸收峰,故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用於甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定,方法簡單,靈敏度高,實驗時基本不受蛋白質存在的影響,並且產生的顏色穩定160min以上。
多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,並迅速脫水生成糖醛衍生物,然後與苯酚生成橙黃色化合物。再以比色法測定。
Ⅱ、試劑
1. 濃硫酸:分析純,95.5%
2. 80%苯酚:80克苯酚(分析純重蒸餾試劑)加20克水使之溶解,可置冰箱中避光長期儲存。
3. 6%苯酚:臨用前以80%苯酚配製。(每次測定均需現配)
4. 標准葡聚糖(Dextran,瑞典Pharmacia),或分析純葡萄糖。
5. 15%三氯乙酸(15%TCA):15克TCA加85克水使之溶解,可置冰箱中長期儲存。
6. 5%三氯乙酸(5%TCA):25克TCA加475克水使之溶解,可置冰箱中長期儲存。
7. 6mol/L 氫氧化鈉:120克分析純氫氧化鈉溶於500ml水。
8. 6mol/L 鹽酸
Ⅲ、操作。
1.製作標准曲線:准確稱取標准葡聚糖(或葡萄糖)20mg於500ml容量瓶中,加水至刻度,分別吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml,各以蒸餾水補至2.0ml,然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻,室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度,以2.0ml水按同樣顯色操作為空白,橫坐標為多糖微克數,縱坐標為光密度值,得標准曲線。
2.樣品含量測定:
①取樣品1克(濕樣)加1ml 15%TCA溶液研磨,再加少許5%TCA溶液研磨,倒上清液於10毫升離心管中,再加少許5%TCA溶液研磨,倒上清液,重復3次。最後一次將殘渣一起到入離心管。注意:總的溶液不要超出10毫升。(既不要超出離心管的容量)。
②離心,轉速3000轉/分鍾,共三次。第一次15分鍾,取上清液。後兩次各5分鍾取上清液到25毫升錐形比色管中。最後濾液保持18毫升左右。(測肝胰腺樣品時,每次取上清液時應過濾。因為其脂肪含量大容易夾帶殘渣。)
③水浴,在向比色管中加入2毫升6mol/L 鹽酸之後搖勻,在96℃水浴鍋中水浴2小時。
④定容取樣。水浴後,用流水冷卻後加入2毫升6mol/L 氫氧化鈉搖勻。定容至25毫升的容量瓶中。吸取0.2 ml的樣品液,以蒸餾補至2.0ml,然後加入6%苯酚1.0ml及濃硫酸5.0ml,搖勻冷卻室溫放置20分鍾以後於490nm測光密度。每次測定取雙樣對照。以標准曲線計算多糖含量。
Ⅳ、注意
(1)此法簡單、快速、靈敏、重復性好,對每種糖僅製作一條標准曲線,顏色持久。
(2)製作標准線宜用相應的標准多糖,如用葡萄糖,應以校正系數0.9校正μg數。
(3)對雜多糖,分析結果可根據各單糖的組成比及主要組分單糖的標准曲線的校正系數加以校正計算。
(4)測定時根據光密度值確定取樣的量。光密度值最好在0.1——0.3之間。比如:小於0.1之下可以考慮取樣品時取2克,仍取0.2ml樣品液,如大於0.3可以減半取0.1ml的樣品液測定。
(四)蒽酮法
Ⅰ、實驗原理
糖在濃硫酸作用下,可經脫水反應生成糠醛和羥甲基糠醛,生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物,在一定范圍內,顏色的深淺與糖的含量成正比,故可用於糖的測定。
該法的特點是幾乎可以測定所有的碳水化合物,不但可以測定戊糖和己糖,而且可以測所有的寡糖類和多糖類,其中包括澱粉、纖維素等(因反應液中的濃硫酸可以把多糖水解成單糖而發生反應。所以,用蒽酮法測出的碳水化合物含量,實際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。在沒有必要細致劃分各種碳水化合物的情況下,用蒽酮法可以一次測出總量。此外,不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同,果糖顯色最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖較淺,五碳糖顯色更淺。故測定糖的混合物時,常因不同糖類的比例不同造成誤差,但測定單一糖類時,則可避免此種誤差。
Ⅱ、試劑:
蒽酮試劑,0.20 g蒽酮溶入100 mL 95%濃硫酸中,冰箱保存;
Ⅲ、方法:
樣品2.0 mL加5.0 mL蒽酮試劑,混勻,然後水浴煮沸10 min,取出冷卻至室溫,在620 nm處測定其吸光度,根據標准曲線計算水樣中糖的濃度。(標線以葡萄糖為標樣)
⑷ G-實驗和真菌葡聚糖檢測的關系是什麼
"葡聚糖廣泛存在於真菌細胞壁,特別是β-D葡聚糖占真菌細胞壁質量的90%以上,是真菌細胞壁上的特有成分。通過對真菌β-D葡聚糖的檢測,可逆向判斷真菌的感染情況。
使用「海浪」牌真菌(1,3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒,對血液標本中(1,3)-β-D葡聚糖檢測,可了解機體是否感染侵襲性真菌。
"
⑸ 我想做β-葡聚糖的FITC熒游標記,從百度知道知道你很久前做過的,麻煩介紹交流下。
目的:測定腫瘤組織異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC�dextran)粘附水平是否可作為腫瘤血管密度的量化指標。方法:用endolgin疫苗免疫小鼠後,在同一隻小鼠上同時建立小鼠Meth A纖維肉瘤模型和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗模型,2周後將FITC�dextran注射入小鼠體內,然後手術完整摘取腫瘤組織和藻酸鹽顆粒,取部分腫瘤組織進行免疫組化檢測血管密度的同時,將其他組織和藻酸鹽顆粒勻槳並離心,取上清檢測熒光強度,分析二者之間是否存在直線相關關系。結果:免疫組化和肉眼觀察顯示2種測定方法均有明顯的血管生成效應,用FITC�dextran粘附測定腫瘤組織血管相對密度和藻酸鹽包被試驗均能較好地量化測定抗血管生成效果,直線相關分析表示二者的疫苗免疫實驗組FITC�dextran的測定值之間呈明顯的正性相關關系(r = 0.962,P<0.01)。結論:和藻酸鹽包被試驗相比,FITC�dextran測定腫瘤組織血管相對密度是一種簡單有效的量化測定腫瘤組織血管生成水平的方法。
【關鍵詞】 腫瘤;血管;動物模型;藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗
Quantitative determination of relative tumor vascularity by FITC�dextran adsorption
TAN Guang�hong, HUANG Feng�ying, WANG Hua, et al.
( Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Medicine, Haian Medical College, Hainan, Haikou 571101, P.R. of China)
〔ABSTRACT〕 Objective: To evaluate whether determination of FITC-dextran adsorption in tumor tissues is suitable for quantitative evaluation of tumor angiogenesis. Methods: After inction of antiangiogenic immunity in mice using xenogenic endogin protein, Meth A fibrosarcoma tumor cells were incubated in the conventional method of setting tumor model. Alginate�encapsulate tumor cell assay was performed on the same mouse at the same time, and no immune mice were used as control as well. 14 days later, alginate beads and the whole tumor tissue were removed surgically and quantified the uptake of FITC�dextran, and partial tumor tissues were used for immunohistochemistry determination of the vessel density, using antibody reactive to CD31. In addition, linear correlation analysis was used to evaluate the relationship. Results: The antiangiogenic effects were significantly inced in the two models respectively, and linear correlation analysis of the uptake of FITC�dextran showed significant positive correlations between the two vaccine�immunized treated groups in the two models (r=0.962, P<0.01). Conclusion: Determination of relative tumor vascularity in the tumor tissue using FITC�dextran adsorption can be used as an antiangiogenic model in vivo.
〔KEY WORDS〕 Tumor; Blood vessel, Animal model, Alginate�encapsulate tumor cell assay
腫瘤的發生、發展和轉移與血管生成(angiogenesis)密切相關。我們在研究實驗中發現〔1,2〕,如果抗腫瘤血管生成的治療方案確實有效,除了表現為腫瘤體積較小,生存時間延長外,在腫瘤的組織切片中也表現為血管密度明顯減少。藻酸鹽包被腫瘤細胞模型是目前定量測定腫瘤血管生成的標准方法〔3〕,它的主要原理是將異硫氰酸熒光素標記的葡聚糖(FITC�dextran)注射進入體內後,葡聚糖就會粘附於內皮細胞表面、部分可能被內皮細胞吸收而滯留於血管腔中。通過測定藻酸鹽顆粒中的葡聚糖的熒光強度並和標准曲線相比較,就可得到量化的結果。因此我們設想,如果腫瘤組織中血管密度相對較少,腫瘤組織的血管粘附、吸收和滯留葡聚糖的數量也應該相應減少,通過比較不同腫瘤組織吸收FITC�dextran相對熒光強度,就能夠量化了解不同腫瘤組織的血管密度。本研究將FITC�dextran注射於活體荷瘤小鼠中,然後測定腫瘤組織FITC�dextran水平並和藻酸鹽包被模型相比較,了解二者之間是否存在相關關系。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
FITC�dextran購自Sigma Chemical公司,藻酸鈉(Alginic Acid,Sodium Salt)購自Sigma Chemical 公司,苯巴比妥鈉購自上海新亞葯業有限公司,RPMI�1640培養基和胎牛血清(FCS)購自美國GibicoBRL公司。重組豬endoglin蛋白為作者構建表達並純化〔1〕。6~8周齡雌性BALB/c小鼠購自四川大學動物中心,小鼠Meth A 纖維肉癌(Meth A)細胞株由生物治療國家重點實驗室(四川大學)贈送。大鼠抗小鼠CD31(PECAM�1)單克隆抗體購自BD Pharmingen公司,VECTASTAIN Elite ABC Kit 購自Vector Laboratories公司。熒光酶標儀Microplate Fluorescence Reader,FL600,為Bio�Tek公司產品。
1.2 實驗方法
1.2.1 免疫方法 將重組endoglin蛋白凍乾粉劑於無菌條件下稱量,溶於無菌的生理鹽水(NS)中,與滅菌的氫氧化鋁凝膠佐劑〔A〕(OH)3按4∶1(V/V)混勻(氫氧化鋁終濃度約為2 mg/mL),室溫下放置30~60 min。然後將實驗小鼠隨機分兩組,每組各10隻。實驗組小鼠每隻背部皮下注射上述混合好的endgolin蛋白疫苗每次10 μg(100 μL)。對照組每隻小鼠注射NS:佐劑為4∶1的混合液100 μL。每組注射均為1周1次,共4次。
1.2.2 細胞培養 從液氮中取出凍存保種的Meth A細胞,迅速置於37 ℃水浴復溫融化,在超凈工作台內用培養基洗滌1次。然後用完全培養基於37 ℃,5% CO2培養箱中培養。收集對數生長期細胞,1 500 rpm離心3 min,細胞沉澱用無抗生素無血清的培養基洗滌1次,計數細胞數量後用無抗生素無血清的培養基調整細胞濃度至1×107/mL。
1.2.3 藻酸鹽包被模型的建立 按文獻進行〔3〕,略加改進。無菌條件下,首先將藻酸鈉溶於無菌生理鹽水,終濃度為1.5% (W/V);並將收集培養的腫瘤細胞重懸於1.5%藻酸鈉溶液中,然後用1 mL加樣槍將細胞和藻酸鹽混合液緩慢滴入磁力攪拌的250 mM CaCl2溶液中,形成乳白色的小珠。實驗前進行預實驗,使每個小珠約含有2×105個細胞。繼續靜置於250 mM CaCl2中30 min即可使用。此後將第4次免疫7 d後的小鼠用苯巴比妥鈉0.1 mL (100 mg/kg)腹腔注射麻醉。小鼠麻醉後置於解剖台上,切開背部皮膚,在切口左側下方上下不同部位各植入1粒按上述方法制備好的藻酸鹽小珠,縫合皮膚。14 d以後,從尾靜脈注入100 μL(100 mg/kg) FITC�dextran,30 min後斷頸處死,取出藻酸鹽小珠,常溫下加入0.5 mL的生理鹽水,混勻標本,放置1 h, 1 500 rpm離心5 min。取上清液200 μL用熒光酶標儀測定熒光強度,用不同濃度的FITC�dextran制備標准曲線,得出每隻小鼠的測定值。
1.2.4 小鼠腫瘤模型的建立 上述藻酸鹽小珠植入小鼠體內後,同時將Meth A細胞接種到每隻小鼠的右側脅肋部皮下,每隻接種2×106個細胞(0.2 mL)。14 d後斷頸處死,在取出藻酸鹽小珠的同時,用手術器械分離出完整的腫瘤組織,准確稱重後剪碎腫瘤組織,按重量每克腫瘤組織加入生理鹽水2 mL,磨碎成勻漿,在搖床上搖動1 h後1 500 rpm離心5 min,同樣取上清200 μL測定熒光強度,對照相應標准曲線得出各個標本的測定值。
1.2.5 腫瘤組織血管免疫組化染色 參考文獻〔1,2〕取各組新鮮腫瘤組織進行冰凍切片。抗CD31免疫組化方法按Vector Laboratories公司試劑盒操作說明書進行。腫瘤組織微血管定量也按相關文獻報道方法進行〔1,2〕。
1.3 統計學分析
模型內腫瘤體積和熒光強度比較用Student's T檢驗,模型間相關性用線性相關分析。
2 結果
2.1 腫瘤生長和免疫組化檢測腫瘤血管密度
用重組豬的endoglin蛋白作為抗腫瘤血管生成疫苗具有明顯的抑制腫瘤生長和抗血管生成的作用,疫苗免疫組腫瘤生長明顯慢於非免疫對照組;疫苗免疫組和非免疫對照組腫瘤重量分別為(0.52±0.13) g和(2.37±0.31) g(P<0.001),(圖1 A)。14 d後處死小鼠,用抗CD31免疫組化染色腫瘤組織血管,和非免疫對照組相比(圖1C),結果發現,疫苗免疫組腫瘤組織血管明顯減少(圖1D),疫苗免疫組和非免疫對照組腫瘤組織血管密度平均每高倍視野分別為(10.82±3.91)和(46.58±8.73)(P< 0.001)(圖 1 B)。
註:A:腫瘤重量;B:微血管密度定量分析;C:疫苗免疫治療組腫瘤組織免疫組化;D:非免疫對照組腫瘤組織免疫組化;Trea:疫苗免疫治療組;Cont:非免疫對照組。
圖1 Endoglin重組蛋白抑制腫瘤血管生成(略)
2.2 FITC�dextran粘附測定腫瘤組織血管生成狀況
腫瘤細胞接種14 d後處死小鼠,經尾靜脈注射FITC�dextran,取出腫瘤組織後測定相對的FITC�dextran粘附數量,疫苗免疫組和非免疫對照組FITC�dextran 的粘附量分別為(2.53±0.82) μg和(7.56±1.27) μg,統計分析表明兩組間具有顯著性差異(P<0.001)(圖2 A)。
2.3 藻酸鹽包被實驗測定腫瘤組織血管生成效應
當14 d後切開植入藻酸鹽顆粒部位的皮膚後,肉眼就可看見疫苗免疫組(圖 2 C)的藻酸鹽顆粒表面幾乎沒有可見的血管,而非免疫對照組的藻酸鹽顆粒(圖 2 D)均見有明顯的血管分布,疫苗免疫組FITC�dextran 的粘附量也明顯低於非免疫對照組,分別為(0.76±0.35) μg和(2.34±0.79) μg,統計分析表明兩組間同樣具有顯著性差異(P<0.001)(圖2 B )。
2.4 腫瘤組織FITC�dextran粘附與藻酸鹽包被實驗測定相關性分析
將腫瘤組織與藻酸鹽包被實驗測定疫苗免疫實驗組的FITC�dextran粘附量數值進行相關性分析,將這兩組數值代入直線相關公式求出相關系數r值,並進行假設檢驗,結果相關系數r=0.962,假設檢驗P<0.001,表明二者之間呈明顯的直線正相關(圖3)。
註:A:腫瘤組織直接測定的FITC�dextran量;B:藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗測定的FITC�dextran量;C:疫苗免疫治療組藻酸鹽小珠;D:非免疫對照組藻酸鹽小珠;Trea:疫苗免疫治療組;Cont:非免疫對照組。
圖2 腫瘤組織直接測定FITC�dextran和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗(略)
圖3 腫瘤組織直接測定和藻酸鹽包被腫瘤細胞試驗測定的FITC�dextran呈直線正相關(略)
3 討論
Endoglin是一種細胞膜表面分子,主要表達於激活的內皮細胞表面;研究證實endoglin是腫瘤血管生成的一個新的標志〔4〕,用抗endoglin抗體在動物腫瘤模型中已取得了良好的抗血管和抑制腫瘤生長的效果〔5,6〕。本研究所應用的豬endoglin是我們從豬胚肝中克隆得到cDNA的基礎上,將其構建於原核表達載體,然後誘導表達並經嚴格純化得到的重組蛋白質。在以往的研究中,我們已經證實用這種重組蛋白作為小鼠endoglin的異種同源蛋白疫苗,免疫小鼠能誘導小鼠產生抗豬和鼠自身endoglin的抗體,並且在多個腫瘤模型中發現具有抗腫瘤血管生成從而明顯抑制腫瘤生長的作用〔1,2〕。本研究用免疫組化和藻酸鹽包被腫瘤細胞實驗都發現用豬的endoglin 重組蛋白作為疫苗免疫小鼠後,確實具有抗小鼠Meth A纖維肉瘤血管生成的作用。
抗腫瘤血管生成研究是當今腫瘤研究中的一個熱點,幾乎每天都有新的研究成果發表於不同的學術刊物上,因此,一種簡便有效而又能夠定量的抗血管生成模型對腫瘤抗血管生成研究具有十分現實的意義。當前,研究中常用的抗腫瘤血管生成模型主要包括:角膜模型、雞胚內囊膜模型和藻酸鹽包被腫瘤細胞模型等,前者需要在小鼠的角膜上進行微創手術,一般實驗者很難掌握,實驗結果難以量化處理。而雞胚內囊膜模型的操作也比較復雜,許多葯物還不適合用於此模型,同樣也難以進行量化處理。藻酸鹽包被模型盡管能准確量化,並且能從外觀上看出抗血管生成效果,但是需要進行麻醉和手術,在這個過程中實驗小鼠很容易死亡。另外,藻酸鹽濃度控製得不好或是操作過程中出錯都可導致包被於藻酸鹽中的腫瘤細胞死亡,影響實驗結果。在本研究中,我們直接用接種2周的腫瘤組織為研究對象,因為任何有效的抗腫瘤血管生成的治療都會抑制腫瘤血管生成,致使腫瘤生長減慢,除了表現為腫瘤體積減少和重量較輕以外,整個腫瘤組織血管密度和血管腔容積也應該相應減少。因此,當從外周把FITC�dextran灌注進機體後,在相同重量的腫瘤組織中,血管密度和血管容積均減少的腫瘤組織粘附、吸收和滯留FITC�dextran的量也應該相對減少,這樣通過測定相同重量的不同腫瘤組織就可以量化比較出這些差異,本研究的實驗結果完全支持這些觀點。經相關分析,實驗結果和現在文獻常用的藻酸鹽包被腫瘤細胞實驗結果呈顯著的直線正性相關關系。但是,由於直接測定腫瘤組織血管相對密度的操作方法就是常規的建立腫瘤模型的方法,具有過程簡單,易於操作等優點。盡管目前文獻尚未見有實際應用的報道,但是我們認為這一種直接測定腫瘤組織粘附FITC�dextrane進而量化腫瘤血管相對密度的方法實用可行,具有推廣應用的價值。
【參考文獻】
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⑹ G試驗和GM試驗的區別及其臨床應用是什麼
麴黴菌檢測在血清學方面主要有血清麴黴特異性抗原(半乳甘露聚糖)檢測,簡稱GM試驗,也是侵襲性麴黴病的早期診斷指標,在血液系統惡性腫瘤患者應用中具有較好的敏感性和特異性。此外還有血清真菌特異性抗原(1,3-β-D葡聚糖抗原)檢測,簡稱BG試驗,也能對臨床常見的侵襲性真菌感染作出早期判斷,尤其是能很好地將念珠菌的定植與感染區分開。這兩種方法在歐美等國已被批准使用,但也各有一定的局限性,如GM試驗只針對麴黴感染,對其它真菌檢測無效,且敏感性和特異性受諸多因素影響。而BG試驗雖能測得包括麴黴和念珠菌在內的更多致病性真菌,初步的臨床研究顯示有較好的敏感性和特異性,但不能檢出接合菌和隱球菌,也不能鑒定具體菌屬和菌種。 x0dx0aG試驗因為針對真菌表面的3-β-D葡聚糖抗原,而3-β-D葡聚糖抗原為真菌所共有,所以G試驗可用於區分真菌和細菌感染,但卻無法用於具體種屬的鑒定。GM試驗針對的是麴黴菌特異性抗原,且可用於麴黴菌感染的早期診斷,國外報道GM試驗的敏感性和特異性都很高,但似乎還需更多實驗證實。x0dx0aGM試驗其敏感性可達1ng/ml,ELISA檢測血清中半乳甘露聚糖用於診斷麴黴具有良好的靈敏度(64.5%-100%)和特異度(80%-98.7%),可以用於麴黴菌的早期診斷及治療的監測。而且陽性結果出現在臨床症狀或影像學特徵之前。該試驗還可以檢測肺泡灌洗液和尿液標本,是目前國際上一致認可的一項侵襲性麴黴菌病的診斷方法。其缺點是某些葯物和食物可以導致假陽性,假陽性率可以高達18%。因此半乳甘露聚糖常為一過性,建議對於高危人群應進行動態監測,每周採集標本兩次監測。x0dx0a1,3-β-D葡聚糖試驗:又稱為G試驗,可用於對系統性真菌病的診斷篩查,該方法敏感性可達1pg/ml,特異性高,研究顯示1,3-β-D葡聚糖對真菌感染診斷的敏感性和特異性分別為63-100%和74-100%,缺陷在於容易引起假陽性,而且無法區分真菌種類。1,3-β-D葡聚糖是除了結合菌屬外所有真菌(包括念珠菌屬、麴黴菌屬、鐮孢菌屬、酵母菌、毛孢子菌屬、支頂孢屬等)細胞壁的特有成份,而原核生物、病毒和人類細胞壁缺乏此多糖。因此,如果在血液或其他無菌體液中檢測到1,3-β-D葡聚糖,就將可能提示真菌感染的存在。1,3-β-D葡聚糖已經成為真菌感染的有效標幟物。
⑺ 葡聚糖凝膠色譜層析柱圖結果怎麼分析
1.凝膠的預處理
交聯葡聚糖凝膠的市售商品多為乾燥顆粒,使用前必須充分溶脹。方法是將欲使用的干凝膠緩慢地傾倒入5~10倍的去離子水中,參照相關資料中凝膠溶脹所需時間,進行充分浸泡,然後用傾倒法除去表面懸浮的小顆粒,並減壓抽氣排除凝膠懸液中的氣泡,准備裝柱。在許多情況下,也可採用加熱煮沸方法進行凝膠溶脹,此法不僅能加快溶脹速率,而且能除去凝膠中污染的細菌,同時排除氣泡。
2.裝柱
層析柱的選擇一般根據分離樣品的種類和樣品的數量而定。純化蛋白質時,柱床體積應為樣品體積的25~100倍。去除鹽及游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短,影響分離效果。柱長一些,分離效果好,但柱太長,則延長分離時間,樣品也稀釋過度。層析柱的內徑也要選擇適當。內徑過細,會發生「器壁效應」,即靠近管壁的流速要大於中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內徑和高度應有一定的比例。對於除鹽來說應為1︰5~1︰25;對於純化蛋白質來說應為1︰20~1︰100。
凝膠柱的裝填方法和要求,基本上與離子交換柱的制備相同。一根理想的凝膠柱要求柱中的填料(凝膠)密度均勻一致,沒有空隙和氣泡。通常新裝的凝膠柱用適當的緩沖溶液平衡後,將帶色的蘭葡聚糖–2000、細胞色素,或血紅蛋白等物質配製成質量濃度為2g/L的溶液過柱,觀察色帶是否均勻下移,以鑒定新裝柱的技術質量是否合格,否則,必須重新裝填。
3.加樣與洗脫
(1)加樣量:加樣量與測定方法和層析柱大小有關。如果檢測方法靈敏度高或柱床體積小,加樣量可小;否則,加樣量增大。例如利用凝膠層析分離蛋白質時,若採用28Onm波長測定吸光度,對一根2cm×6Ocm的柱來說,加樣量需5mg左右。一般來說,加樣量越少或加樣體積越小(樣品濃度高),解析度越高。通常樣品液的加入量應掌握在凝膠床總體積的5%~10%。樣品體積過大,分離效果不好。
對高解析度的分子篩層析,樣品溶液的體積主要由內水體積(Vi)所決定,故高吸水量凝膠如Sephadex G-200,每mL總床體積可加0.3~0.5mg溶質,使用體積約為0.O2倍總體積;而低吸水量凝膠如Sephadex G–75,每mL總床體積加溶質質量為0.2mg,樣品體積為0.Ol倍總體積。
(2)加樣方法:如同離子交換柱層析一樣,凝膠床經平衡後,吸去上層液體,待平衡液下降至床表面時,關閉流出口,用滴管加入樣品液,打開流出口,使樣品液緩慢滲入凝膠床內。當樣品液面恰與凝膠床表面持平時,小心加入數mL洗脫液沖洗管壁。然後繼續用大量洗脫液洗脫。
(3)洗脫:加完樣品後,將層析床與洗脫液儲瓶、檢測儀、分部收集器及記錄儀相連,根據被分離物質的性質,預先估計好一個適宜的流速,定量地分部收集流出液,每組分一至數mL。各組分可用適當的方法進行定性或定量分析。
凝膠柱層析一般都以單一緩沖溶液或鹽溶液作為洗脫液,有時甚至可用蒸餾水。洗脫時用於流速控制的裝置最好的是恆流泵。若無此裝置,可用控制操作壓的辦法進行。樣品體積不宜過多,最好為床體積的1%~5%,最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大,濃度過大粘度大,分離效果差,一般不超過4%。
洗脫液應與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會發生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。
凝膠再生和保存
凝膠層析的載體不會與被分離的物質發生任何作用,因此凝膠柱在層析分離後稍加平衡即可進行下一次的分離操作。但使用多次後,由於床體積變小,流動速率降低或雜質污染等原因,使分離效果受到影響。此時對凝膠柱需進行再生處理,其方法是:先用水反復進行逆向沖洗,再用緩沖溶液平衡,即可進行下一次分離。
對使用過的凝膠,若短時間保存,只要反復洗滌除去蛋白質等雜質,加入適量防腐劑即可;若長期保存,則需將凝膠從柱中取出,進行洗滌、脫水和乾燥等處理後,裝瓶保存。
⑻ (1-3)-β-D-葡聚糖檢測的質控品檢測方法是什麼要步奏
這個我查了點資料,給你地址,參考下吧!!
http://wenku..com/view/96cded4469eae009581becc0.html
http://wenku..com/view/eea402da7f1922791688e8c6.html
⑼ 動態濁度法檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的原理
鱟試劑中含有對葡聚糖敏感的G因子和會形成凝膠的凝固蛋白。當葡聚糖激活G因子形成活化的G因子,會近一步激活凝固蛋白形成凝膠。在凝膠形成的過程中,反應液的OD值逐步升高。反應液OD達到某一預設值的反應時間是和反應液葡聚糖的濃度成反比例關系的。微生物檢測儀Elx808監控反應液中OD值的動態變化,通過TALgent軟體處理數據,做成標准曲線,再根據標准曲線自動計算出反應液中葡聚糖濃度。(廈門..鱟試劑)
⑽ 動態濁度法檢測(1-3)-β-D-葡聚糖的原理
鱟試劑中含有對葡聚糖敏感的G因子和會形成凝膠的凝固蛋白.當葡聚糖激活G因子形成活化的G因子,會近一步激活凝固蛋白形成凝膠.在凝膠形成的過程中,反應液的OD值逐步升高.反應液OD達到某一預設值的反應時間是和反應液葡...