pcrelise定量檢測方法

1. 定量PCR的檢測模式

PCR過程的監測有多種檢測模式。最常用的有三種檢測模式：
⑴R Green I 檢測模式。溫度循環為94—55—72°C三步法，只有引物，無探針，熒光染料鑲嵌在雙股螺旋鏈中間。通過對特定方向的強熒光檢測獲得信號，這種試劑檢測模式易產生非特異信號，且本底光較大。
⑵解探針模式（Taqman）Hydrolysis Probe。溫度循環為94—60°C二步法，不僅有引物，還有另外一個特異針對擴增模板的探針在引物對之間。在探針相鄰兩個鹼基上分別結合兩個熒光染料，一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料，接受能量的第二個染料通過發射特徵光子回到穩定態。當Taq酶在60°C延伸擴增鏈時，遇到探針，利用Taq酶5`—3`外切酶活性將探針水解成單個鹼基，單個鹼基之間距離較遠，第一個染料的能量無法傳給第二個染料，只好通過發射特徵光子回到穩定態，通過對溶液中第一個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式增加了檢測信號的特異性，但是由於利用了Taq酶5`—3`外切酶活性，一般試劑廠家只給Taq酶的聚合酶活性定標，沒有同時給Taq酶5`—3`外切酶活性定標，不同批號試劑之間會給定量帶來差異。另外對探針的熔點溫度（Tm）僅要求其高於60°C，這就使不同試劑盒之間的特異性參差不齊，而且無法做質控檢測。
⑶雜交探針（Hybridization Probes）模式。溫度循環為94—55—72°C三步法，有引物，二個特異針對擴增模板相鄰的探針在引物對之間，在一個探針3`鹼基上結合一個熒光染料，在另一個探針5`鹼基上結合第二個熒光染料。在55°C時，兩個探針都剛好接合在模板上，第一個染料接受激發光得到的能量傳給了第二個染料，接受能量的第二個染料通過發射特徵光子回到穩定態，通過對結合在擴增模板上雙探針中第二個染料的熒光檢測獲得信號。這種試劑檢測模式中熒光信號與特定雜交溫度相關，探針的濃度始終保持不變，因此可以在擴增後檢測熔解曲線作為信號的特異性質控。另外這種試劑檢測模式可以用於點突變檢測。

2. 熒光定量PCR步驟

博凌科為-為你解答：如果lz確實已經確定該基因SNP位點以及突變型，你可以選擇熒光定量PCR進行檢測，檢測方法是：1、探針設計在突變位置，有幾個突變點設計幾個（不同突變型需要不同的熒游標記：例如，野生型探針用FAM、其中一個突變點探針用VIC或者HEX、另外的一個突變探針用TET等等）；2、然後在突變點兩端設計引物（大概100－150bp就可以了。如果用MGB探針，可以小於100bp）；3、然後就是用能進行GenoTyping的熒光定量PCR儀器了（ABI的7700、7900等都可以）；實驗操作么就是常規的熒光定量（Realtime）＋讀取分型（Allelic Discrimination）兩個操作，按照不同PCR儀器的說明書操作即可；4、分析，就可以用軟體分析擴增曲線和分型圖譜，兩者聯合判斷該樣本的基因型就好了。

3. 簡述定量PCR的原理和過程

半定量反轉錄－聚合酶鏈反應（semi-,sqrt-pcr）是近年來常用的一種簡捷、特異的定量rna測定方法，通過mrna反轉錄成cdna，再進行pcr擴增，並測定pcr產物的數量，可以推測樣品中特異mrna的相對數量。以半定量rt-pcr為基礎建立起來的mrna含量測定技術，較含內標化的rt-pcr定量測定的mrna的方法更為簡便可行。這種方法不另設『內標准',排除了倆對不同引物之間的相互抑制和靈敏讀差異，而且具有明顯的劑量－效益關系和良好的重復性。步驟：1.抽提rna，2.反轉錄獲得cdna，3.以cdna為模板做pcr注意：步驟1，rna抽提質量一定要好，注意污染。內參的選擇，常用的有βactin和gapdh倆中。步驟3，半定量rt-pcr應該再兩管中進行，既內參和目的基因各一管，這樣便於控制，做圖的時候可以放在一各泳道里跑！指數期和平台期一定要摸清楚！

4. 熒光定量 PCR 方法：探針法 VS 染料法

熒光定量 PCR 又稱 qPCR，是一項非常常見的分子生物學實驗技術。熒光定量 PCR 熒光為基礎對核酸進行定量分析，其應用非常廣泛，可以用於檢測基因的表達量（RNA 的豐度），驗證表達譜晶元或轉錄組測序的數據，確定病原體的載量，對片段的拷貝數（CNV）進行分析，對基因進行分型等等。

大部分研究者主要的應用是對基因的表達量進行測定，其原理為通過監控反應體系中熒光強度的變化，記錄檢測熒光達到閾值時的循環數（Ct 值）。從理論上說，起始模板量和 Ct 值密切相關，因此我們通過判讀 Ct 值從而對樣本進行定量。

在進行熒光定量 PCR 時，從技術和產品來說，我們往往會有許多選擇，尤其是方法的選擇，對最終結果的准確性至關重要。熒光定量 PCR 從方法上來說可以分為染料法和探針法兩種。

一、染料法

在國內，染料法一般採用 DNA 染料 SYBRGreenⅠ，染料法使用簡單，成本也相對較低，因此會有很多國內研究者會選擇使用染料法進行後續實驗。在染料法熒光定量 PCR 實驗中，染料能夠與雙鏈結合，從而發光，而在游離狀態下，SYBR Green I 發出微弱的熒光。所以，一個反應發出的全部熒光信號與出線的雙鏈 DNA 量呈比列，且會隨擴增產物的增加而增加。但是染料法檢測的是體系中的所有雙鏈 DNA,因此一些非特異性擴增或者引物二聚體的出現，會極大的影響真實結果的准確性。為此，一些廠商提供 ROX 作為內部熒光參考標准，用來校正背景，但是即便如此，染料法特異性的問題依舊無法與探針法相比。另外染料法無法在同一個反應中檢測多個目的片段，對於復雜序列，如果難以擴增的話，也會受到脫靶效應（如引物二聚體）的影響。在這種情況下，就需要在實驗前期進行熔解曲線分析，判斷擴增所得產物是否只有一種。

二、TaqMan 探針法

TaqMan 探針法 PCR 擴增時，在加入一對擴增引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。Taqman 探針為一段線性的寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團（FAM 或 Hex 等）和一個熒光淬滅基團，當探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，PCR 儀檢測不到熒光信號；當 PCR 擴增時（在延伸階段），Taq 酶的 5' -3' 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條 DNA 鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與 PCR 產物形成完全同步，這也就是探針法定量的原理。

探針法與染料法的最大區別在於，理論上探針法中的熒光信號只來源於目標序列，也就是不受非特異性擴增及引物二聚體的影響。除此之外，人們還可以利用不同探針，在一個體系中使用不同的熒游標記同時檢測多種指標，達到節省實驗成本的目的。在樣本量比較大的情況下，成本甚至可以低於染料法。

因此我們可以看到，在選擇熒光定量實驗時，探針法在特異性和准確性方面遠遠優於廉價的染料法，但在實際使用時，TaqMan 探針高昂的價格常常讓人望而卻步。目前，上海捷瑞生物工程有限公司在強大的探針合成能力的前提下，推出了探針法熒光定量 PCR 服務，以染料法的價格，享受探針法的服務，在相同的經費情況下，提高實驗的准確性和特異性。

5. PCR實驗是如何實現定性和定量的其定性和定量的詳細原理是什麼如何區別

定性應該較容易理解，大體是有或無，強和弱，要達到目的做常規PCR，通過產物條帶很容易看出。
定量現在一般分為半定量PCR和real-time PCR（實時定量PCR）兩種。半定量做法就是通過常規PCR，跑膠得到產物條帶，然後通過軟體對條帶進行分析，將條帶的強弱進行量化。real-time PCR定量更准確，它需要特定的儀器與試劑。原理是在PCR進行延伸的過程中其產物加上特定的熒游標記，然後通過機器讀出熒光的強度來反應檢測的樣本中c-DNA的豐度。

6. 熒光定量pcr原理

熒光定量pcr原理如下：

熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環產物熒光信號的實時檢測,最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。

以探針法熒光定量PCR為例：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。

開始時，探針完整地結合在DNA任意一條單鏈上，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，檢測不到熒光信號；PCR擴增時，Taq酶將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成同步。

Ct值最大的意義就是用來計算目的基因的表達量，此時就有兩個概念容易被提及，那就是絕對定量和相對定量，絕對定量的目的是測定目的基因在樣本中的分子數目，即通常所說的拷貝數。相對定量的目的是測定目的基因在兩個或多個樣本中的含量的相對比例，而不需要知道它們在每個樣本中的拷貝數。

Ct值誠然可以被利用來計算這兩種定量結果，但是絕對定量實驗必須使用已知拷貝數的絕對標准品，必須做標准曲線。相對定量可以做標准曲線，也可以不做標准曲線。絕對標准品製作困難難以獲取，實驗室基本都是選擇相對定量的方法來計算相對基因表達量。

7. 科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前，PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析，提高了普通PCR技術的特異性和准確性，被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。

一、常規PCR

利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈，然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合，接著再升高溫度到72°C左右，即DNA聚合酶最適反應溫度，DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖（5'-3'）的方向合成相應的互補鏈，如此循環往復以達到DNA分子擴增的目的，常規PCR技術無法實現精確定量。

二、實時熒光定量PCR

如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究，就需要採用實時熒光定量PCR，根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同，實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。

1.  DNA 結合染料法

原理 ：應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。

應用於核算定量和基因表達驗證。

優缺點： 它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量，不需要探針，具有相對高的靈敏度和可靠性，並且成本低，簡單易用，缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈，其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。

染料法一般使用的是SYBR Green I染料，這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料，不會與單鏈DNA結合，並且在游離狀態下幾乎無熒光，只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光，因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯，產生實時監測的效果。

2.  基於探針的化學法

原理： 應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物；依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。

優缺點： 探針法的鑒別能力遠遠大於DNA結合染料法，因為它們只與目的產物結合，從不與引物二聚體或其他非特異產物結合，缺點是它的合成價格高。

探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5』末端，而淬滅基團則在3』末端，PCR擴增時在加入引物的同時加入探針，探針完整時，熒光信號被淬滅基團吸收，PCR擴增時，5』→3』外切酶活性將探針酶切降解，使熒光基團和淬滅基團分離，從而檢測器可以接收到熒光信號。

3.  淬滅染料引物法

原理： 採用熒游標記引物擴增，從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中，依賴熒光能量共振傳遞。

應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR

優缺點：探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號，因此減少了背景熒光和假陽性，還可進行多重PCR擴增，缺點是原料成本價格高

三、實時熒光PCR儀

實時熒光PCR系統包括熱循環儀，用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光數據和管理分析的計算機軟體，數據通過實時分析軟體以圖表的形式顯示。

8. 熒光定量PCR技術的熒光定量PCR的方法

接下來我們就來了解一下熒光定量的主要方法，我們如何選擇合適的方法？熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈後，發射出熒光信號。前者由於增加了探針的識別步驟，特異性更高，但後者則簡便易行。

非特異性SYBR Green I染料法
SYBR Green I是一種結合於所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料（結合示意圖），在游離狀態下，SYBR Green I發出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合後，熒光大大增強（作用機理圖）。因此，SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關，可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。
特異性Taqman水解探針法
Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎，Taqman熒光探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；
PCR擴增時，Taq酶的5』－3』外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。從而實現定量（如下圖）。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。

9. 熒光定量PCR的操作步驟

熒光定量PCR實驗步驟： ①取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鍾使其完全溶解。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鍾。4℃下12000rpm離心15分鍾。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
③RNA沉澱 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鍾後，於4℃下12000rpm 離心10分鍾。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鍾。
⑤RNA乾燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鍾。
⑥溶解RNA沉澱 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。 1）紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。
① 濃度測定
A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 μg/ml。具體計算如下：
RNA溶於40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中，測得A260 = 0.21
RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 μl，剩餘RNA總量為：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
②純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。
2）變性瓊脂糖凝膠電泳測定
①制膠
1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS電泳緩沖液
濃度 成分
0.4M MOPS，pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA
灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
②准備RNA樣品
取3μgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml。加熱至70℃孵育15分鍾使樣品變性。
③電泳
上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。
④紫外透射光下觀察並拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。 ①反應體系 序號 反應物 劑量 1 逆轉錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鍾，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鍾。
③取出後立即95℃干浴3分鍾，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存於-80℃待用。 管家基因（β-actin）實時定量PCR
①β-actin陽性模板的標准梯度制備 陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。
②反應體系如下：
標准品反應體系 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽性模板上游引物F 0.5μl 3 陽性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
管家基因反應體系： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內參照上游引物F 0.5μl 3 內參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
③制備好的陽性標准品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃2分鍾，然後93℃ 1分鍾，55℃ 2分鍾，共40個循環。 ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系： 序號 反應物 劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
35個PCR循環（94℃1分鍾；55℃1分鍾；72℃1分鍾）； 72℃延伸5分鍾。
②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。 ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下： 序號 反應物 劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。
②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鍾預變性，然後按93℃ 1分鍾，55℃1分鍾，72℃1分鍾，共40做個循環，最後72℃7分鍾延伸。 各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，GoldView染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。