報告基因檢測方法原理

❶ 如何獲取目的基因的原理及方法

目的基因片段的獲取：目的基因的組成：一個能轉錄翻譯的結構基因應包括轉錄啟動區、核糖體識別區、編碼區、和轉錄終止區。獲得途徑：1限制性內切酶酶切法2利用pcr技術直接擴增目的基因3目的基因的化學合成4通過構建基因組文庫或cdna文庫分離目的基因5反向轉錄法分離目的基因目的基因導入受體細胞：原核生物最理想受體細胞：大腸桿菌、枯草桿菌、藍藻、棒狀桿菌。真核生物應用最廣的受體細胞：酵母細胞途徑：1電穿孔法2基因槍法3激光微束穿孔法4顯微注射法5多聚物介導法6脂質體介導轉化法克隆子的篩選鑒定:克隆子的篩選方法：1根據載體選擇標記基因2根據報告基因3根據pcr擴增片段4根據限制性核酸內切酶圖譜分析5採用dna雜交法6應用dna晶元7dna核苷酸序列測定

❷ 什麼是luciferase報告基因系統

Luciferase報告基因系統是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(fireflyluciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物熒光(bioluminescence)。然後可以通過熒光測定儀也稱化學發光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光。熒光素和熒光素酶這一生物發光體系，可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。是檢測轉錄因子與目的基因啟動子區DNA相互作用的一種檢測方法。
轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。
其原理簡述如下：
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

❸ 基礎實驗重新認識（3）——熒光素酶互補（Luc）實驗

【導入】
基於熒光素酶（Luciferase）的發光原理，形成了雙熒光素酶報告基因檢測系統。該系統包括螢火蟲熒光素酶（Firefly luciferase）和海參熒光素酶（Renilla luciferase）。兩者可與各自的底物發生氧化作用產生生物熒光，產生的熒光值即表示兩種酶的表達量多少。

圖片來源[1]

Firefly luciferase和Renilla luciferase被稱為報告基因，是因為在表達調控研究時，利用兩者表達產生的熒光比值可監控微觀層面上的分子間相互作用。

具體做法：將靶基因的的轉錄調控元件或5'啟動子區融合在Firefly luciferase基因的上游，把3『-UTR區或IncRNA序列融合在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用，或miRNA對目的基因/IncRNA的調控作用。

該系統中引入Renilla luciferase基因的TK載體作為內參，以消除細胞轉染等因素帶來的組間誤差。

其中luciferase來源於細菌、螢火蟲和發光海洋生物等，可以在哺乳動物細胞和植物細胞中直接表達，無需表達後修飾，直接具備完全酶活性。

與GFP不同之處在於luciferase的發光檢測不需要激發光激發，且發光穿透力更強，這使得Luc實驗具備可定量、高靈敏度及背景低等特點。

【利用熒光素酶互補實驗驗證植物蛋白互作】

基本原理

在驗證植物蛋白互作時，熒光素酶互補實驗 (Luciferase Complementation Assay, LCA) 因其高靈敏度、可定量化、操作簡單高效被廣泛應用於植物學和動物學蛋白質互作研究[2]。

圖片來源[2]

目前, 應用最為廣泛的熒火素酶基因來源於北美螢火蟲 (firefly luciferase), 該基因編碼550個氨基酸組成的熒火素酶蛋白 (大小為62 kDa)。

實驗中, 熒光素酶蛋白被切成 N端 和 C端 2個功能片段, 即 NLuc (2–416AA) 和 CLuc (398–550AA) 。

在一個實驗體系中, 待檢測的2個目標蛋白分別與NLuc和CLuc融合, 如果2個目標蛋白相互作用, 則熒火素酶的NLuc和CLuc在空間上會足夠靠近並正確組裝, 從而發揮熒火素酶活性, 即分解底物產生熒光 。

實驗過程

將含有融合蛋白的植物表達載體轉化農桿菌 (Agrobacterium) 後注射煙草葉片。24–48小時後，加入反應底物熒火素, 利用植物活體分子影像系統 (CCD imaging system) 或luminometer來定性定量檢測熒光強度, 以判定目標蛋白之間是否存在相互作用及互作的程度。

載體圖譜

❹ 檢測基因表達的方法有哪些

基因工程第四步中包括導入檢測，轉錄檢測和翻譯檢測，方法分別是dna分子雜交技術、分子雜交技術、抗原-抗體雜交技術。有的還可在個體水平是進行檢測，如抗性檢測等

❺ 檢測基因表達的方法

主要用探針檢測mRNA或用抗體檢測出表達的蛋白質(轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測)

一、外源基因轉錄水平的鑒定

基因表達分為轉錄及翻譯兩階段，轉錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白質的過程，檢測外源基因的表達就是檢測特異mRNA及特異蛋白質的生成。所以基因表達檢測分為兩個水平。

即轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測。轉錄水平上的檢測主要方法是Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈。和Southern雜交相同，Northern雜交包括斑點雜交和印跡雜交。

也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方法檢測外源DNA在植物體內的轉錄表達。其原理是以植物總RNA或mRNA為模板進行反轉錄，然後再經PCR擴增。

如果從細胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴增條帶，則表明外源基因實現了轉錄。此法簡單、快速，但對外源基因轉錄的最後決定，還需與Northern雜交的實驗結果結合。

二、外源基因表達蛋白的檢測

表達蛋白的檢測方法有三種：

1、生化反應檢測法：主要通過酶反應來檢測；

2、免疫學檢測法：通過目的蛋白（抗原）與其抗體的特異性結合進行檢測，具體方法有Western雜交、酶聯免疫吸附法（ELISA）及免疫沉澱法；

3、生物學活性的檢測。

Western雜交是將聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離抗原（Antigen）固定在固體支持物上（如硝酸纖維素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白質在凝膠中遷移率不同，據此可確定特定的抗原存在與否以及相對豐度，或者蛋白質是否遭到降解等。

蛋白質電泳後轉到NC膜，放在蛋白質（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，溫育，以封閉非特異性位點，然後用含有放射性標記或酶標記的特定抗體雜交，抗原-抗體結合，再通過放射性自顯影或顯色觀察。

(5)報告基因檢測方法原理擴展閱讀

外顯子與內含子表達過程中的相對性 從內含子與外顯子的定義來看，兩者是不能混淆的，但是真核生物的外顯子也並非都「顯」（編碼氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外顯子完全「不顯」之外，幾乎全部的結構基因的首尾兩外顯子都只有部分核苷酸順序編碼氨基酸，還有完全不編碼基酸的外顯子，如人類G6PD基因的第一外顯子核苷酸順序。

已發現一個基因的外顯子可以是另一基因的內含子，所這亦然。以小鼠的澱粉酶基因為例，來源於肝的與來源於唾液腺的是同一基因。澱粉酶基因包括4個外顯子，肝生成的澱粉酶不保留外顯子1，而唾液腺中的澱粉酶則保留了外顯子1的50bp順序，但把外顯子2與前後兩段內含子一起剪切掉，經過這樣剪接，外顯子2就變成唾液澱粉酶基因中的內含子。

同一基因在不同組織能生成不同的基因產物來源於不同組織的類似蛋白，可以由同一基因編碼產生，這種現象首先是由於基因中的增強子等有組織特異性，它能與不同組織中的組織特異因子結合，故在不同組織中同一基因會產生不同的轉錄物與轉錄後加工作用。

此外真核生物基因可有一個以一的poly(A)位點，因此能在不同的細胞中產生具有不同3』末端的前mRNA，從而會有不同的剪接方式。由於大多數真核生物基因的轉錄物是先加poly(A)尾巴，然後再行剪接，因此不同組織、細胞中會有不同的因子干預多聚腺苷酸化作用，最後影響剪接模式。

❻ 什麼是報告基因檢測法

報告基因（reporter：gene）是指其編碼產物能夠被快速地測定的一類特殊用途的基因，常用來判斷外源基因是否已經成功地導入受體細胞、組織或器官，並可以方便快速檢測其表達活性。

可見報告基因實質是起到了判斷目的基因是否已經成功地導入到受體細胞並且表達的標記基因的作用。作為理想的植物報告基因應具備以下特徵：
1、編碼的產物是惟一的，並且對受體細胞無毒。
2、表達產物及產物的類似功能在未轉化的細胞內不存在，即無背景。
3、產物表達水平穩定，便於檢測等。

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❼ GFP是怎麼報告DNA的基因的

這個和基因的調控有關系了，基因不是自己想表達就表達的，而是由一定的調控元件來控制的，常見的有啟動子，增強子等等，在做報告基因的時候，通常會把報告基因如GFP這種序列加在目的基因的C端或者N端，也有加在中間的做成融合的，或是在啟動子下游獨立讓他表達的。這樣其實這個GFP蛋白的表達也是受到目的基因相同的調控元件調控的，即只有細胞在表達你目的基因的時候，GFP才會以融合蛋白或非融合蛋白的形式表達出來

❽ 轉基因的植株要怎樣檢測

在植物遺傳轉化中，外源基因導入植物細胞的頻率是相當低的。在數量龐大的受體細胞群體中，通常只有為數不多的一小部分細胞獲得了外源DNA，而目的整合到基因組並實現表達的轉化細胞則更少。

因此，必須採用一定的檢測方法，才能篩選和鑒定出含有目的基因的重組體。目前已發展出一系列的轉基因植物的篩選和鑒定方法。在這些鑒定和篩選方法，根據檢測的基因功能來劃分，可分為調控基因（包括啟動子終止子等）檢測、選擇標記基因檢測和目的基因直接檢測。

根據檢測的不同階段區分，有整合水平檢測和表達水平的檢測，基因整合檢測方法主要有Southern雜交、PCR、PCR-Southern雜交、原位雜交和DNA分子標記技術法，表達水平的檢測包括轉錄水平檢測和翻譯水平檢測，轉錄水平的檢測法有Northern雜交和反轉錄PCR（reverse：transcribed：PCR，RT-PCR）檢測，翻譯水平的檢測有酶聯免疫吸附法（enzyme：linked：immuno：sorbent：assay，ELISA）和Western雜交等，其中最簡便和使用廣泛的表達水平的檢測是報告基因檢測法。由於這些方法的具體操作已在其他章節（課程）介紹過，這里只側重介紹基於選擇標記基因和報告基因的篩選和鑒定方法。