檢測dna濃度的方法甲基化

⑴ DNA甲基化檢測方法

為什麼要檢測 DNA 甲基化？ 首先，我們為什麼要檢測 DNA 甲基化呢？檢測 DNA 甲基化能回答什麼問題？我們都知道，DNA 甲基化可以調控基因表達，因此檢測 DNA 甲基化至少可以為解釋基因表達的調控提供一些線索。其次，DNA 甲基化參與一系列重要生物學過程，包括早期胚胎發育、基因組印記、X 染色體失活、重復序列的沉默以及癌症的發生發展轉移，DNA 甲基化也有助於闡明這些重要的生命過程背後隱藏的奧秘。此外，DNA 甲基化一個非常重要的應用，是可以作為腫瘤的生物標志物。DNA 甲基化如此重要，我們可能需要時刻想著它。

圖 2. 人類基因組中 DNA 甲基化概況

位點特異性的 DNA 甲基化 剛才我們介紹了總體 DNA 甲基化水平的檢測，但是這些方法都沒有提供序列信息。如果我們需要知道位點特異性的甲基化信息，這個時候需要問第二個問題，我是只檢測感興趣的幾個基因就行了，還是需要知道全基因組每一個基因的甲基化狀態。如果我們只需要檢測特定基因的 DNA 甲基化狀態，緊接著，我們需要問第三個問題，我們只是定性地看看甲基化狀態，還是定量地看甲基化的水平。

圖 13. 四個問題 2.0 版本之第二、三個問題 Methylation-specific PCR，MSP 如果只是定性地看甲基化的狀態，最簡單快捷的是甲基化特異性的 PCR。MSP 可以快速檢測 CpG 島中任意一組 CpG 位點的 DNA 甲基化狀態。

圖 16. 重亞硫酸鹽轉化&克隆測序[7]

基於高通量測序的全基因組 DNA 甲基化檢測方法 接下來，我們看一下第四個問題的另一種答案，我們用高通量測序來檢測全基因組的 DNA 甲基化。之所以最後講這個，是因為這個比較燒錢，而且後續的生物信息學分析比較復雜。 WGBS & RRBS 對於二代測序的方法，WGBS（Whole-Genome Bisulfite Sequencing）是目前的「金標准」。WGBS 想必大家都已經很熟悉了，但是考慮到 WGBS 成本較高，因此還有一種跟 WGBS 十分相似，但是只測基因組中的一部分的方法，即 RRBS（Reced representation bisulfite sequencing）。

圖 21. WGBS & RRBS 的比較[10]兩者的差別在於，WGBS 通常使用超聲打斷整個基因組，並對整個基因組進行重亞硫酸鹽處理和測序；但是 RRBS 使用 MspI 限制性內切酶。RRBS 可以檢測到人類基因組中 85% 的 CpG 島。RRBS 大約需要 100ng-1ug 的 DNA，而對於 WGBS 而言，需要 50-100ng DNA。盡管 WGBS 被譽為檢測 DNA 甲基化的「金標准」，但是依然存在很多的不足。首先，重亞硫酸鹽必須轉化未甲基化的 DNA，否則會造成假陽性，不過目前我們可以通過加入 spike-in 作為對照來克服這個問題；還有，目前測到的 DNA 甲基化是多個細胞的平均甲基化狀態，單細胞的 DNA 甲基化檢測可能克服這個問題；其次，重亞硫酸鹽轉化，會降低基因組的復雜度，造成後續的 mapping 率不高；重亞硫酸鹽轉化還可能造成 DNA 斷裂，這使得擴增長片段比較困難。另外，WGBS 的成本還是非常高的。

參考資料： https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzIxMjA0NzU0OA==&mid=2650983484&idx=1&sn=&scene=21#wechat_redirect

⑵ 如何進行DNA甲基化分析

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發生於胞嘧啶，即在DNA甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5』-端的胞嘧啶轉變為5』-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實現對基因表達的調控。脊椎動物DNA的甲基化狀態與生長發育調控密切相關，比如在腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，導致抑癌基因表達的下降。
1、甲基化特異性的PCR（Methylation-specific PCR，MSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2、亞硫酸氫鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產物克隆至載體後進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3、高解析度熔解曲線法（High Resolution Melting，HRM）
在非CpG島位置設計一對針對亞硫酸氫鹽修飾後的DNA雙鏈的引物，這對引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理後，未甲基化的胞嘧啶經PCR擴增後轉變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發生改變，從而導致熔解溫度的變化（圖1）。
其中，樣品要求：細胞（≥106 個）、組織（≥300mg）、血液（≥1ml）、血清（≥1.5ml）等樣品材料，基因組DNA（體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl）。

⑶ 誰知道測DNA甲基化的方法

http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多圖片粘貼不過來，還不如你自己看。

一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術

DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。

CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。

近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。

從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。

目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。

研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。

PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96

哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11

⑷ DNA甲基化測序方法介紹

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DNA 甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。

DNA 甲基化及CpG島

DNA 甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一,可能存在於所有高等生物中。DNA 甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶,N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發生於胞嘧啶。DNA 的甲基化是在DNA 甲基化轉移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5'端的胞嘧啶轉變為5'甲基胞嘧啶。這種DNA 修飾方式並沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達。脊椎動物基因的甲基化狀態有三種：持續的低甲基化狀態,如管家基因；去甲基化狀態,如發育階段中的一些基因；高度甲基化狀態,如女性的一條失活的X染色體。

哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1%，遠低於基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島。通常，CpG島大約含有500多個鹼基。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化，CpG島通常位於基因的啟動子區或是第一個外顯子區。健康人中，CpG島中的CpG位點通常是處於非甲基化狀態，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留。當腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，以致於染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。

隨著高通量測序技術（NGS）技術的發展，使我們能夠從全基因組水平來分析5』甲基胞嘧啶及組蛋白修飾等事件，由此能夠發現很多傳統的基因組學研究所不能發現的東西，這就是所謂的「DNA甲基化測序」！

DNA甲基化測序方法按原理可以分成三大類：

一、重亞硫酸鹽測序；

二、基於限制性內切酶的測序；

三、靶向富集甲基化位點測序；

基於以上原理又有數種不同的測序方法，下面，就介紹10種DNA甲基化測序的常用方法及參考文獻：

1) 重亞硫酸鹽測序

該方法可以從單個鹼基水平分析基因組中甲基化的胞嘧啶。首先，利用重煙硫酸鹽對基因組DNA進行處理，將未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基變成尿嘧啶。而發生了甲基化的胞嘧啶未發生脫氨基，因而，可以基於此將經重亞硫酸鹽處理的和未處理的測序樣本進行比較來發現甲基化的位點。

【相關文獻】

Shotgun bisulphite sequencing of theArabidopsis genome reveals DNA methylation patterning

Highly integrated single-base resolutionmaps of the epigenome in Arabidopsis

2）重亞硫酸鹽處理後接頭標記技術(PBAT)

為了避免重亞硫酸鹽處理時模板的丟失，通常會在重亞硫酸鹽處理後進行接頭連接和隨機引物的擴增。

【相關文獻】

Amplification-free whole-genome bisulfitesequencing by post-bisulfite adaptor tagging

3）限制性內切酶-重亞硫酸鹽靶向測序(RRBS)

該技術是指對基因組上CpG島或CpG甲基化較密集的區域進行靶向測序。樣本首先經幾種限制酶進行消化處理，然後經重亞硫酸鹽處理，最後再測序。這種方法可以發現單個核苷酸水平的甲基化。

【相關文獻】

Reced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis

4）氧化-重亞硫酸鹽測序(oxBS-Seq)

5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)是5』甲基胞嘧啶脫甲基成胞嘧啶過程的中間產物，重亞硫酸鹽測序無法對二者進行區分。通過氧化-重亞硫酸鹽測序，5』甲基胞嘧啶保留，而5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)被氧化，進而脫氨基成尿嘧啶。通過將經過氧化處理和未處理的樣本進行測序比較，即可從單個鹼基水平分辨5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)和5』甲基胞嘧啶。

【相關文獻】

Quantitative sequencing of 5-formylcytosinein DNA at single-base resolution.

5）TET輔助的重亞硫酸鹽測序(TAB-seq)

TAB-seq採用葡萄糖亞胺與5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)作用來保護免受TET蛋白的氧化。5』甲基胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶被脫氨基成尿嘧啶，進而可以從單個鹼基水平鑒定5』羥甲基胞嘧啶(5』hmC)。

【相關文獻】

Base-resolution analysis of5-hydroxymethylcytosine in the Mammalian genome

6）甲基化敏感性的限制酶測序(MRE-Seq)

MRE-Seq將甲基化作用的敏感性和限制酶的特異性結合起來進而鑒定CpG島的甲基化狀態。

【相關文獻】

Genome-scale DNA methylation analysis

7）HELP-Seq

HELP-Seq採用HpaII及其甲基化不敏感的限制性內切酶MSPI處理，來對基因組內及基因組間的甲基化位點進行比較，進而實現甲基化測序。

【相關文獻】

Comparative isoschizomer profiling ofcytosine methylation: the HELP assay

8）甲基化DNA免疫共沉澱測序(MeDIP)

MeDIP是一種採用抗體或甲基化DNA結合蛋白來捕獲富集甲基化DNA的技術，這種技術可以發現基因組中高度甲基化的區域，如CpG島，但不能進行單個鹼基水平的分析。

【相關文獻】

Chromosome-wide and promoter-specificanalyses identify sites of differential DNA methylation in normal andtransformed human cells

9)甲基化結合域捕獲技術(MBD-CAP)

MBD-CAP技術利用甲基化DNA能夠結合蛋白MeCP2,MBD1-2 和 MBD3LI來對甲基化的DNA進行免疫沉澱。與MeDIP技術相似，該技術也是可以發現基因組中高度甲基化的區域，不能從單個鹼基水平分析甲基化。

【相關文獻】

High-resolution mapping of DNAhypermethylation and hypomethylation in lung cancer

10）基於探針的靶向富集技術

甲基化測序靶向富集技術採用合成寡核苷酸探針來捕獲CpG島、基因啟動子區域以及其他一些顯著性甲基化的區域。目前，Agilent 和 Roche Nimblegen公司已有這種商品化的試劑盒。

最後，Pacific Biosciences（Pacbio）公司的這項SMRT DNA測序技術採用動力學原理來直接檢測甲基化的胞嘧啶。

其中三代測序技術針對真核中的5mc檢測需要的深度較深，大概要250x,但是利用特殊的試劑會降低其深度。

⑸ DNA甲基化檢測有哪些方法

DNA甲基化檢測: Southern Blot雜交、 Bisulfite Sequencing and McrBC-PCR

⑹ DNA甲基化的檢測方法主要包括哪些

參考見解：方法概括起來可分為三類：基因組整體水平的甲基化檢測、基因特異位點甲基化的檢測和新甲基化位點的尋找。 1) 基因組整體水平甲基化分析 a) 高效液相色譜柱（HPLC）及相關方法 b) SssI 甲基轉移酶法 c) 免疫化學法 d) 氯乙醛法 2) 特異性位點的DNA甲基化的檢測 a) 甲基化敏感性限制性內切酶(MS-RE)-PCR/Southern法 b) 直接測序法

⑺ 如何檢測 DNA 甲基化

需要去專門的檢測機構或者醫院檢查。

DNA甲基化（DNA methylation）為DNA化學修飾的一種形式，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現。所謂DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的作用下，在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5號碳位共價鍵結合一個甲基基團。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色質結構、DNA構象、DNA穩定性及DNA與蛋白質相互作用方式的改變，從而控制基因表達。

機制

由於Dnmtl和Dnmt3基因家族沒有針對CpG二核苷酸序列的特異性，人們因此提出了DNA甲基化轉移酶發現靶位點的機制。

首先，甲基化轉移酶並不是同等地接近所有染色體區域。具有染色體重構和DNA螺旋酶活性的蛋白質能調節哺乳動物細胞內DNA甲基化，如SNF2家族2個成員ATRX和Lsh;其次，附件因子（蛋白質、RNA等）能召集DNA甲基化轉移酶到特定基因組序列或染色體結構中，如pRB蛋白等能夠與Dnmtl作用，在S期晚期將它召集到高度甲基化的異染色質區。

以上內容參考：網路-DNA甲基化

⑻ 如何進行DNA甲基化分析

基因甲基化的檢測方法主要有以下幾種：
甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。

2、亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)

用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產物克隆至載體後進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3、甲基化敏感擴增多態性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP是利用對DNA甲基化敏感的兩種同裂酶Hpa II和Msp I來對基因組DNA進行酶切和連接。由於兩種酶能夠識別相同的限制性酶切位點，即CCGG位點。當DNA序列中的CCGG位點出現不同程度的甲基化狀態時，會分別被這兩種酶識別，以有無產物的方式體現出來。

4、焦磷酸測序(Pyrosequencing)
通過准確定量單個連續的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序能檢測並定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被准確檢測。由於焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。