A. 一文讀懂腫瘤精準用葯基因檢測
一文讀懂腫瘤精準用葯基因檢測
根據世界衛生組織（WHO）統計數據，全世界約有60%的人死於癌症、糖尿病、心血管疾病、慢性呼吸系統疾病這4大類疾病，而癌症則是最主要的死因之一。2008年全球死於癌症的患者達760萬人，佔全球死亡人數的13%，我國衛生部第三次全國死因調查結果也顯示，癌症已成為我國僅次於心腦血管疾病的第二大死亡原因，占死亡總數的22.32%，並成為我國城市的首位死因。
目前，惡性腫瘤逐年升高的發病率及其巨大的醫療費用等因素，使得大家「談癌色變」。好在治療手段發展快速，包括手術和放療的局部治療和抗腫瘤葯物的全身治療類。其中，葯物治療已成為當今臨床治療腫瘤的重要手段之一。而提到腫瘤葯物治療，就不免會提到基因檢測技術。對於醫生和患者來說，基因檢測是「既熟悉又陌生」的高科技！如何能讓醫生或患者通俗易懂地了解腫瘤基因檢測，那可真是一門技術活。 今天，我就針對腫瘤用葯的相關基因檢測為大家做一期干貨分享。
○ 為什麼要做腫瘤基因檢測？
○ 腫瘤用葯基因檢測到底檢測了什麼？有哪些抗腫瘤葯物需要做基因檢測？
○ 是不是檢測的基因越多越好？
○ 基因檢測的方法有哪些？哪一種是最好的？
○ 腫瘤基因檢測選取什麼樣本才是最好的？
1. 為什麼要做腫瘤基因檢測？
腫瘤基因檢測的主要原因在於腫瘤是一類高度異質性疾病。也就是說，哪怕患的是同一種腫瘤，不同的患者也需要根據其實際情況採用不同的治療方案，尤其是抗腫瘤用葯的選擇。不同患者對不同抗腫瘤葯物的敏感程度差異巨大，故腫瘤臨床治療需要制定個體化的精準方案。而基因檢測是評估患者使用葯物效果非常重要的一環，能從分子層面給醫生用葯予精確的指導。
2. 腫瘤用葯基因檢測到底檢測了什麼？有哪些抗腫瘤葯物需要做基因檢測？
實際上，不同類型抗腫瘤葯物的基因檢測項目是不同的。所以， 首先我為大家全面介紹一下抗腫瘤葯物的類別，再介紹各種類抗腫瘤葯物的基因檢測項目。
目前，國際上臨床常見的抗腫瘤葯物大致可分為以下六類： 細胞毒類葯物、激素類葯物、靶向葯物、免疫檢驗點抑制劑、生物反應調節劑及輔助葯 。
細胞毒類葯物
簡介： 通常被稱為「化療」葯物，此類葯物主要是根據癌細胞增殖過快等生長特性殺死癌細胞，因此對具有類似特性的健康細胞也會無差別攻擊，種類很多包括：
（1）作用於DNA化學結構的葯物，如鉑類化合物等；
（2）影響核酸合成的葯物，如甲氨蝶呤、培美曲塞等；
（3）作用於核酸轉錄的葯物，如阿黴素、表阿黴素等；
（4）作用於DNA復制的拓撲異構酶Ⅰ抑制劑，如伊立替康等；
（5）主要作用於有絲分裂M期干擾微管蛋白合成的葯物，如紫杉醇等；
（6）其他細胞毒葯。
基因檢測目的： 評估葯物對患者的有效性或安全性（毒副作用）。
基因檢測類型： 基於患者對葯物的代謝相關基因的多態性，評估不同化療葯物在患者體內代謝反應情況。
基因檢測必要性： ⭐⭐⭐
【由於沒有涉及對腫瘤細胞基因突變的分析，化療葯物基因檢測還不能算是完全意義上的精準醫療，但在其他外界條件相同的情況下，化療葯物基因檢測可為患者從葯物受益或毒副作用兩個方面提供選擇參考。】
激素類葯物
簡介： 主要是與激素相關的惡性腫瘤類型（如女性的乳腺癌、男性的前列腺癌等）的激素調節葯物，包括如他莫昔芬、來曲唑、阿那曲唑等；
基因檢測目的： 與細胞毒類葯物相同，激素類葯物基因檢測主要評估的也是葯物對患者的有效性或安全性（毒副作用）。
基因檢測類型： 同化療葯物。
基因檢測必要性： ⭐⭐
靶向葯 物
簡介： 針對癌細胞上特定的「靶點」，比如某個特定的基因突變，抑制癌細胞生長直至殺死癌細胞的葯物。靶向葯物理論上只會抑制癌細胞，而不會對正常細胞造成顯著傷害，因此副作用小很多。對於此類型葯物，如果患者有相應的治療靶點，則靶向葯物有效率高，而且起效快，能迅速緩解腫瘤帶來的症狀，提高患者的生活質量，一定時期內能顯著提高存活率。
靶向葯物目前主要分為兩類：大分子單抗類葯物和小分子靶向葯物。其中小分子靶向葯物主要集中在蛋白酪氨酸激酶劑、蛋白酶和其他種類，典型代表是針對白血病的格列衛（Bcr-Abl 基因突變）和針對肺癌的易瑞沙（EGFR 基因突變）。
基因檢測目的： 評估靶向葯物對患者的療效或耐葯情況。
基因檢測類型： 由於靶向葯物類型較多，通常會檢測每個靶向葯物對應的腫瘤信號通路中特定基因的點突變/插入缺失/拷貝數變異/融合（結構變異）等情況，這些常被統稱為「基因突變」。具體到小分子靶向葯物涉及的主要基因及信號通路包括：
(1) 表皮生長因子受體（EGFR）；
(2) 血管內表皮細胞生長因子受體（VEGFR）家族；
(3) 血小板衍化生長因子受體（PDGFR）家族；
(4) 成纖維細胞生長因子受體（FGFR）家族；
(5) 與惡性腫瘤發生密切相關的非受體酪氨酸激酶四個家族：ABL家族、JAK家族、SRC家族以及FAK家族；
(6) 與mTOR抑制劑相關的PI3K/Akt信號通路。
基因檢測必要性： ⭐⭐⭐⭐⭐
靶向葯物基因檢測是通過患者癌細胞基因檢測，從而選擇對患者有效的特定葯物或方案，是真正意義上的精準醫學。由於很多靶向葯物有明確療效/耐葯靶點，須遵循基因檢測後才可使用！不應在未做相關基因檢測的情況下盲目用！
【 由於腫瘤的異質性和進化，靶向葯物使用一段時間後可能會出現抗葯性，需要換葯，故靶向葯物基因檢測配合葯物療效最好定期檢測。】
免疫檢驗點抑制劑
簡介： 目前此類葯物常被簡稱為「免疫葯物」，主要是通過抑制癌細胞的抑制免疫應答，從而激活T細胞功能，讓患者自身的免疫系統殺死變異的腫瘤細胞，主要包括了近年來大火的PD-1/PD-L1抑制劑以及CTLA-4抑制劑。該類型葯物的很多響應患者會長期受益，一小部分患者甚至被治癒，是目前抗腫瘤葯物的重點研發方向之一。
基因檢測目的： 評估患者對此類葯物可能的受益。
基因檢測類型： 此類葯物的基因檢測主要是評估受益的生物標記，包括：
（1）PD-L1表達，只針對PD-1/PD-L1抑制劑葯物；
（2）MMR/MSI檢測，患者的DNA錯配功能檢測，兩者屬於同一類型檢測，微衛星不穩定性（MSI）可以側面反應MMR系統是否工作良好；
（3）腫瘤突變負荷（TMB）。
基因檢測必要性： ⭐⭐⭐⭐
目前免疫檢測點抑制劑類葯物最大問題是有效率不高，僅在10%~20%，加上其目前費用較高，所以，通過基因檢測評估葯物可能的受益還是很有必要的.
【免疫葯物的以上三個類型生物標記的基因檢測，目前實際應用中僅可以選擇其中之一。一般來說，如果是肺癌患者，由於目前上市的針對肺癌的此類葯物基本都是PD-1/PD-L1抑制劑，建議選擇PD-L1表達檢測；如果是結直腸癌患者，則建議選擇MSI檢測，當然也可以根據實際情況選擇同時檢測綜合評估或盲用葯。】
生物反應調節劑
簡介 ：主要通過機體免疫功能抑制腫瘤，如干擾素、白細胞介素-2、胸腺肽類。
基因檢測目的： 目前此類葯物基本不需要做基因檢測。
基因檢測類型： 無。
基因檢測必要性： 無。
輔助葯
簡介： 腫瘤治療中，輔助其他葯物療效或減輕其他葯物帶來副作用的葯物，如
（1）升血葯（如G-CSF、GM-CSF、白細胞介素-11、EPO等）；
（2）止嘔葯（如恩丹西酮、鹽酸格拉司瓊等）；
（3）鎮痛葯（如阿司匹林、撲熱息痛、可待因、曲馬多、嗎啡、芬太尼等）；
（4）抑制破骨細胞葯（如氯膦酸二鈉、帕米磷酸二鈉等）。
基因檢測目的： 目前此類葯物基本不需要做基因檢測。
基因檢測類型： 無。
基因檢測必要性： 無。
3. 是不是檢測的基因越多越好？
答案是否定的，要根據實際需要評估的葯物，選擇相對應的基因檢測項目，尤其是靶向葯物，每個葯物的療效/耐葯靶點基因是比較固定的。
隨著高通量測序技術（NGS）技術的崛起，商業市場將幾個到成百上千個基因打包檢測，即測序Panel 或「基因套餐」，但是由於目前已上市的靶向葯物比較固定，當測序基因數量覆蓋足夠靶點基因後，再增加基因數量未必能進一步提供更多的靶向葯物指導，這些Panel 提供的往往是一些額外的評析，如遺傳評估；此外，大Panel 基因測序還可以用來進行擬合計算TMB。但目前基於大Panel 的TMB計算方法沒有統一的標准，也沒有統一的定論。
此外，Panel的測序結果還和其測序覆蓋度（可覆蓋的目前基因區域）、測序深度（可使用測序數據量衡量）等相關。基於以上幾點， 對於NGS的測序Panel 大小選擇應根據實際需求判斷，而非單一按照基因量多少選擇。
4.基因檢測的方法有哪些？
哪一種是最好的？
基因檢測的方法是直接與基因檢測類型相關聯的，每種基因檢測類型都有較為合適基因檢測方法。由於基因檢測體系比較復雜，最好的方法是根據需要評估的葯物選擇相應的檢測項目。下面我為大家簡單總結一下各個基因檢測類型對應的常見檢測方法：
(1) 基因多態性：PCR；
(2) 相對表達檢測：熒光定量PCR；
(3) 點突變/小片段插入缺失：PCR；
(4) 大片段插入缺失/拷貝數變異/融合（結構變異）：FISH；
(5) 多基因多類型突變（相對表達檢測除外）：NGS；
(6) 多肽和蛋白質檢測：免疫組化（IHC）。
5 . 腫瘤基因檢測選取 什麼
樣本才是最好的？
目前對於腫瘤基因檢測，組織樣本仍是金標准，且部分基因檢測項目僅組織樣本才可以實現。因此， 有條件的情況下，應優先選擇組織樣本 。 若無法取得組織樣本，最好是臨床處於中晚期（臨床III期後）的患者再選用外周血進行ctDNA基因檢測 。同時，外周血靶向葯物ctDNA基因檢測最好是在沒有經過任何治療之前進行，因為放化療和靶向治療均會對外周血ctDNA檢測結果產生影響。 按照檢出率，新鮮組織>石蠟切片>胸腹水上清>胸腹水細胞>外周血。
此外，由於外周血ctDNA在外周血cfDNA中的比率與腫瘤的大小和進展呈正相關，所以，ctDNA檢測（腫瘤液態活檢）目前在臨床上除了腫瘤用葯指導外，還有另一項更為重要的應用可能—— 腫瘤進展監控 ，具體的應用包括：
(1) 腫瘤早診（腫瘤早期篩查）
液體活檢（包括ctDNA檢測）可以通過血液等檢測在健康的、無症狀的人群中早期發現癌症，這是一項極具潛力的技術，可以和全基因組測序相結合，實時檢測癌症的發生風險，一個可以實時的檢測癌症發生的情況，一個則可以了解家族遺傳和正常的癌症發生概率（比如原癌基因P53和乳腺癌BRAC基因檢測等），相結合之下將會更好地預防癌症。
(2) 腫瘤治療療效跟蹤
雖然ctDNA水平在不同的患者之間有很大的差異，但隨著時間的推移，單個患者的ctDNA水平與腫瘤負荷和治療效果的變化密切相關。一些研究表明，當腫瘤細胞死亡導致ctDNA釋放增加時，ctDNA水平可能會在治療開始後短暫升高。然而，在治療開始1~2周後，對治療有反應的患者的ctDNA水平急劇下降。在某些方面，ctDNA的變化在預測治療效果方面要優於標准腫瘤標志物。這也是ctDNA可以在臨床上用作癌症治療效果長期跟蹤的一個重要原因。
(3) 腫瘤復發監控
目前來說，實體瘤的主要治療方式依舊是手術，目前還無法在手術後立即確定哪些患者含有殘余病灶，而任何一個殘留的微小癌細胞病灶都可能導致癌症復發。在已有的研究中，術後ctDNA檢測可以預測乳腺癌、肺癌、結直腸癌和胰腺癌的殘留病灶和腫瘤復發。這使得ctDNA成為很有潛力的術後管理策略。 目前來說，ctDNA檢測已經可以幫助癌症患者更好地管理和治療癌症，而在未來，ctDNA必將成為癌症治療中不可或缺的一環。
結語
最後，我想說，腫瘤用葯基因檢測的核心目標是給予用葯指導，且由於技術原因，醫生或者患者很難直接讀懂基因檢測的結果，這就需要基因檢測提供商提供對應的高標准解讀，並根據解讀結果為患者和醫生提供相關用葯評估。所以，醫生或者患者要基於相應的目標抗腫瘤葯物，合理選擇相應的基因檢測項目。
· END ·
B. Duplex UMI-ctDNA測序技術
同一癌種的不同患者，同一個腫瘤患者的不同治療階段、同一腫瘤組織的不同區域，腫瘤的生物學特徵均存在一定的差異。 液體活檢 既可以克服 組織檢測 的 異質性 ，又具有 簡便、安全、無創、實時 等特點，尤其是對於無法進行手術或穿刺，又或者腫瘤位置導致取樣困難的患者而言，液體活檢是一項可以彌補組織檢測局限性的方法，近年來在 腫瘤靶向治療 、 耐葯監測的實時評估 等方面發揮著重要的作用。
目前液體活檢的靶標包括： 游離的循環腫瘤細胞 （CTCs）、 循環腫瘤DNA （ctDNA）、 循環RNA （ctRNA）和 外泌體 （攜帶有細胞來源相關的多種蛋白質，脂類，DNA，RNA等）。
ctDNA 是腫瘤細胞在 壞死 、 凋亡後 釋放的一種游離DNA（ cfDNA ），在血液中的半衰期短，可以實時反映腫瘤的動態變化。
目前用於ctDNA液體活檢的技術主要有 ARMS-PCR 、 數字PCR（ddPCR） 和 第二代測序（NGS） 。
NGS能同時檢測多個基因的多種不同變異形式，是應用最廣泛的的基因檢測技術。但由於NGS的實驗流程技術較為復雜，在 文庫構建 、 目標區域捕獲 及 測序過程中 不可避免的會引入一些擴增和測序的錯誤，這些錯誤我們把它們叫做 背景噪音 ，而ctDNA檢測 往往突變頻率較低 ，受到背景噪音 干擾較大 ，來自ctDNA樣本中的低頻突變往往淹沒在背景噪音之中，造成 假陰性 或 假陽性 結果，這就限制了ctDNA檢測的 靈敏度 和 特異性 。
分子條形碼技術（UMI）
分子條形碼又稱 分子標簽 （Unique Molecular indentifier，UMI），它的 原理 就是給 每一條原始DNA片段 加上一段 特有的 標簽序列，經文庫構建及PCR擴增後一起進行測序。這樣，根據 不同的標簽序列 我們就可以區分 不同來源的DNA模板 ，分辨哪些是PCR擴增及測序過程中的隨機錯誤造成的假陽性突變，哪些是患者真正的攜帶的突變，從而提高檢測靈敏度和特異性。
①2012年5月，Tim Forshew等人率先開發了基於分子標簽的TAm-Seq方法。
②2012年9月，Michael W. Schmitt等利用雙鏈分子標簽技術將錯誤率顯著降低。它的技術原理如下：
C. 什麼是Oseq-ctDNA腫瘤基因檢測
人體外周血中存在循環DNA，來源於細胞壞死、凋亡及分泌等，其中源於腫瘤細胞釋放的循環DNA稱為循環腫瘤DNA（ctDNA）。Oseq-ctDNA腫瘤基因檢測可以從外周血中測定ctDNA，分析腫瘤葯物相關的508個基因點位變異情況，全面、准確解讀88種相關腫瘤葯物與基因的關系，輔助醫生制定個性化用葯診療方案。簡單來說Oseq-ctDNA可以通過基因檢測為接受化療的患者提供靶向用葯指導。
D. ctDNA甲基化檢測在腫瘤診療中的價值
癌症患者血漿或血清中的循環腫瘤DNA（ctDNA）為腫瘤的非侵入性取樣提供了機會。這種"液體活檢"允許對DNA進行拷貝數變異、特異性突變以及表觀遺傳改變的檢測，並可以進行病情實時"跟蹤"，從而指導和改善癌症患者的整個診療過程。與檢測腫瘤特異性突變相比，ctDNA在特定基因區域的異常甲基化具有高度一致的特徵，使得ctDNA甲基化檢測更廣泛地適用於腫瘤的診斷、監測，預測治療反應和預後判斷。因此，ctDNA甲基化檢測被認為是癌症診斷和風險評估最有價值的方法之一。
循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）來源於腫瘤細胞的凋亡、壞死或分泌產生的DNA片段，是循環游離DNA（circulatingcell-free DNA，cfDNA）的一部分。健康人群中大部分cfDNA的長度在70~200 bp，但腫瘤患者的ctDNA長度可能為200 bp甚至超過1000 bp。ctDNA含有與其來源腫瘤DNA同樣的基因缺陷，如點突變、重排、擴增、微衛星改變、表觀遺傳修飾等。當腫瘤DNA進入血液時，這些基因缺陷模式在血漿和血清中也可被檢測到。
甲基化是DNA的一種重要修飾，是指在DNA甲基轉移酶的催化下，以s-腺苷甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為甲基供體，將甲基轉移到特定鹼基上的過程。哺乳動物中DNA甲基化主要發生在CpG雙核苷酸的C上，生成5-甲基胞嘧啶（5mC）。人基因組中60%~90%的（CpG）都被甲基化，未甲基化的CpG成簇地組成CpG島，主要位於基因的啟動子和外顯子區域，長度為300~3 000 bp。靠近或位於啟動子區域的異常甲基化一般會抑制轉錄，沉默相關基因的表達。在腫瘤中，抑癌基因和DNA修復基因啟動子區域的異常高甲基化使得抑癌基因沉默和修復基因失活，從而喪失對腫瘤發生的抑製作用，也是目前腫瘤甲基化研究的主要方向。與其他基因缺陷模式相比，DNA甲基化作為最早發現的表觀修飾途徑之一，其異常甲基化模式在不同腫瘤組織中具有高度特異性。特徵性的甲基化"指紋"圖譜可用於癌症早期診斷與分期、療效評估、復發監測和預後判斷等。
ctDNA甲基化檢測在癌症診療應用中，基於血液標本一定程度上可以克服實體瘤組織標本的局限性，例如：（1）ctDNA在血液中半衰期短，可以實時反映腫瘤的動態變化；（2）可以克服腫瘤組織取樣的異質性；（3）重復活檢可以追蹤腫瘤的克隆演變；（4）可以識別轉移性腫瘤。因此，在過去的30年中，DNA甲基化被認為是有希望檢測癌症的生物標志物[1]。
一、ctDNA甲基化檢測技術方法及研究思路
1．常用檢測方法及技術難點：
目前，ctDNA甲基化標志物的研究思路已經比較明確。首先，通過晶元或二代測序對腫瘤組織和正常組織進行全基因組范圍的甲基化信號掃描，尋找腫瘤特異的甲基化標志物位點；然後再針對這些位點對ctDNA進行性價比更高的靶向測序，驗證標志物性能。雖然研究思路比較清晰，但甲基化檢測技術的諸多局限也一直困擾著研究人員。一方面，血液ctDNA含量很低，某些特定類型的腫瘤或中晚期腫瘤有可能達到20 ng/ml。技術上最大的挑戰是需要從含有不同數量cfDNA的血液樣品中鑒定極少量的ctDNA。另一方面，目前甲基化檢測技術基本上均基於亞硫酸氫鹽（bisulfite，BS）使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶（C）脫氨基轉變成尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）保持不變。目前基於BS的甲基化檢測技術主要包括PCR擴增、測序以及基於雜交的捕獲技術[2]，其中擴增的應用較廣泛。BS處理後未甲基化的C變U，PCR擴增後U配對T，因此擴增後DNA變為富含A和T（AT-rich），與原本具有甲基化修飾的C鹼基區分開來。但是，研究發現擴增過程中甲基化狀態的DNA（GC含量高）易產生擴增偏好，在文庫中富集。所以，需要在高效捕獲BS DNA片段的同時，還要保證甲基化信號在擴增過程中均勻放大，不走樣。
2．近年來研究思路的突破方向：
過去研究多聚焦於單基因啟動子區甲基化，研究發現多基因組合檢測可以進一步提高DNA甲基化特徵的特異性和敏感性。隨著生物信息技術的快速發展，甲基化檢測逐漸由單基因向多基因組合以及全基因組水平拓展。2017年Nature Genetics雜志發表的一篇文章定義了147 888塊緊密耦合的CpG位點，稱為甲基化單倍體塊（CpG methylation haplotypes block，MHB）。經過對61個全基因組BS測序數據集進行分析，並使用101個BS測序數據集和637個甲基化晶元數據集進行驗證，證實大小為95 bp並含有≥3個CpG位點的MHB在大約170 bp的cfDNA中更容易被檢測到。最後使用MHB對59例肺癌或結直腸癌患者的腫瘤組織和循環cfDNA進行了評估，發現藉助腫瘤特異的MHB模式可以進一步提升甲基化指紋的准確性，從痕量檢測中發現甲基化的組織來源[3]。2017年，通過機器學習對全基因甲基化譜進行分析後，發現了4種常見腫瘤的特異性甲基化分子標志物，包括肺癌19個、結直腸癌6個、乳腺癌15個、肝癌3個。這些標志物能夠從正常組織中區分出腫瘤，准確率大於95%。進一步對結直腸癌30例肝轉移灶和34例肺轉移灶進行無監督分層聚類分析，發現高度組織特異性的甲基化特徵可以正確診斷腫瘤起源，診斷正確率分別高達96.7%和94.1%[4]。與上述研究方法類似，研究人員在大樣本肝癌研究中篩選出10個甲基化標志物，建立起血液肝癌的ctDNA甲基化診斷模型。經證實該模型可以區分正常人群、肝病背景（肝炎，肝硬化等）和肝癌患者，並與肝癌的腫瘤負荷、治療反應和臨床分期關聯良好，再次證實了ctDNA甲基化檢測的臨床優勢[5]。
二、ctDNA甲基化檢測的臨床應用
1．ctDNA反映基因啟動子區高甲基化的一致特徵，可以用於腫瘤診斷：
與DNA突變相比，基因特定啟動子區域的異常甲基化可能是癌症的一致特徵，例如，90%的前列腺癌中谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）基因被甲基化[6]，96%的乳腺癌中分層蛋白（stratifin，SFN）基因被甲基化[7]，同源框蛋白A9（homeoboxA9，HOXA9）基因和鋸齒狀同源框蛋白1（engrailed homeobox 1，EN1）基因分別在95%和80%的卵巢腫瘤中被甲基化[8]，73%的肝細胞癌中細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因被甲基化[9]。高度一致的甲基化特徵使得ctDNA甲基化廣泛地適用於腫瘤診斷。用於診斷的商業產品也已經面市，如基於糞便的結直腸癌篩查試驗將N-myc下游調節基因4（N-mycdownstream regulated gene 4，NDRG4）與骨形態發生蛋白3（bone morphogenetic protein 3，BMP3）基因的甲基化改變與突變檢測相結合，在2014年獲得了美國FDA批准，是第一個基於DNA甲基化檢測的診斷試驗[10]。此外，Epi proColon檢測分析Septin 9基因的甲基化用於全結直腸癌篩查[11]，以及Epi proLung檢測分析矮小同源盒蛋白2（short stature homeobox 2，SHOX2）基因甲基化用於肺癌篩查由中國FDA於2015年7月批准[12]。
2．ctDNA甲基化檢測反映腫瘤負荷變化，可用於監測治療反應：
癌症特異性ctDNA甲基化模式可用於定量腫瘤DNA，提供有關腫瘤負荷水平的信息。研究表明周期素依賴性激酶抑制因子2A（cyclin dependent kinase inhibitor 2A，CDKN2A）基因中位甲基化指數（甲基化的循環CDKN2A/總循環CDKN2A）由術前35%下降為術後3.5%[13]。在44%~68%的食管癌患者的腫瘤中檢測到APC基因的甲基化[14]，食管癌患者術後血液中腺瘤性結腸息肉病（adenomatous polyposis coli，APC）基因甲基化水平與術後腫瘤殘余顯著相關[15]。
除了反映手術後腫瘤負荷的下降，ctDNA甲基化還可以反映腫瘤對化療葯物的反應。目前，大多數轉移性惡性腫瘤需要至少3個周期的化療，然後才能根據常規成像和生物標志物來評估治療反應。這種延遲使許多患者暴露於不必要的葯物毒性下，並延誤其他潛在有效的治療時機。早期檢測對治療葯物的反應對於改善腫瘤患者結局是必不可少的，目前常規監測主要通過檢測血液蛋白質生物標志物來進行。ctDNA甲基化檢測反映腫瘤負荷變化的特徵使其有望成為監測治療反應的新方法。一些研究報道了在化療期間多個時間點使用ctDNA甲基化定量來監測腫瘤動態，例如使用血漿中ctDNA甲基化GSTP1來追蹤前列腺癌患者對化療的反應。在35例接受多西他賽或米托蒽醌治療的探索性患者隊列中，首次化療後2~38個月（中位數15個月）內血漿甲基化GSTP1水平升高，隨後前列腺特異性抗原（prostate specificantigen，PSA）水平升高，表明血漿甲基化GSTP1可能是較PSA更好的總生存率預測指標[16]。Fackler等[17]通過全基因組甲基化晶元篩選和TCGA數據縮小范圍，最終選擇了10個基因的甲基化標志物用以區別乳腺癌和健康對照，然後通過追蹤使用多西他賽和伊馬替尼或卡培他濱治療的29例乳腺癌患者血清中上述標志物的甲基化水平，發現治療1~2周後上述組合甲基化水平降低，患者疾病穩定或部分緩解，無疾病進展。持續追蹤觀察到在臨床疾病進展之前可以檢測到ctDNA甲基化水平升高。此外，血清Ras相關區域家族1A（rasassociation domain family 1A，RASSF1A）和維甲酸受體β2（retinoicacid receptor beta 2，RARB2）基因甲基化水平還被發現能指示肺癌治療反應[18]。
盡管上述研究將ctDNA甲基化降低與腫瘤體積減小相關聯，從而評估化療敏感性，但考慮到血液中ctDNA的半衰期只有2 h，可以提供非常快速的針對腫瘤狀態變化的測量，2015年Wang等[19]採取了不同的思路，使用甲基化ctDNA的增加來評估化療誘導的腫瘤細胞死亡的程度。結果顯示24 h內循環甲基化RASSF1A或APC1的增加與完全/部分化療響應相關，而治療後兩個標志物沒有變化與腫瘤穩定/進展相關。這些ctDNA甲基化變化的不同方向可以通過化療誘導細胞死亡導致ctDNA的初始水平激增來解釋。與升高時間相比，化療後ctDNA甲基化下降時間的范圍從1周到1年不等，這些波動強調了對化療作出反應時詳細表徵ctDNA動力學的重要性。
3．ctDNA甲基化檢測可反映腫瘤的預後、侵襲和復發：
甲基化可以通過沉默調節細胞生長和轉移潛能的基因來促進腫瘤進展，還可以反映腫瘤亞型，所以其又與腫瘤預後相關聯，許多研究用以指示腫瘤侵襲和復發的可能性。ctDNA甲基化與腫瘤預後的研究中，所選基因在癌症相關過程中功能已知，如細胞增殖，凋亡等，例如胃癌中X連鎖凋亡抑制蛋白相關因子1（X-linkedinhibitor of apoptosis protein associated factor 1，XAF1）基因的甲基化與生存率下降有關，手術後甲基化XAF1患者和非甲基化XAF1患者的中位無病生存期分別為23.4個月和39.6個月[20]。性別決定區Y基因盒17（sexdetermining region Ygene box 17，SOX17）基因通過調節WNT信號傳導途徑發揮抑瘤作用，其表達抑制能夠促進腫瘤發生。兩組研究報道了血液中SOX17甲基化與食管癌和胃癌的預後不良有關。在40例食管癌患者隊列中，使用包括SOX17等在內的8個基因的啟動子和外顯子1區的9個CpG甲基化探針用於預測預後，發現SOX17是多變數分析中的獨立預後因素[21]。在另一組73例胃癌患者隊列中，血清SOX17甲基化與腫瘤分化以及總生存期相關[22]。RARB2是一種視黃酸受體，通常發揮抑瘤作用，其甲基化一直被證明與結直腸癌、乳腺癌和肺癌預後不良相關[18]。在胃癌中，RUNT相關轉錄因子（runt related transcription factor 3，RUNX3）基因術前血清甲基化水平在晚期階段高於早期階段，且復發病例術前血清RUNX3甲基化明顯高於非復發病例，很可能是由於ctDNA甲基化水平反映了腫瘤負荷。此外，評估血清RUNX3甲基化和CEA可改善對結直腸癌的診斷[23]。
綜上，ctDNA甲基化能克服現有腫瘤標志物特異性差，假陽性率高的缺點，在臨床應用方面展現出廣闊前景。但是，我們也應該意識到ctDNA甲基化檢測距離真正進入臨床實踐還有很長的路要走。主要應注意以下幾點：
（1）因為臨床試驗中抗腫瘤的療效評價需要長期隨訪收集完整的治療信息和預後信息，目前在臨床上存在較大困難。ctDNA甲基化檢測應注意樣本收集的時間點，如治療前後對比來評估療效，甚至治療全程多時間點依次收集樣本來監測病程。
（2）ctDNA在血液中半衰期較短，其甲基化動力學變化應納入考慮。
（3）技術進步使得檢測數萬個CpG位點成為可能，但是全基因組ctDNA甲基化檢測技術對生物信息學提出了更高的要求。
（4）ctDNA甲基化標志物的診斷效能仍需與其他癌症循環生物標志物進行比較。未來ctDNA甲基化檢測可用於癌症個體化實時診治，包括癌症篩查、診斷、療效監測及預後判斷。
E. 目前腫瘤基因檢測有哪些
目前腫瘤基因檢測主要包括：
一：CTC循環腫瘤細胞檢測
癌細胞會從原發腫瘤上脫落，透過血液系統通往身體各處器官。這些在血液中檢測到的癌細胞被稱為循環腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells, CTC）。由於循環腫瘤細胞往往具有高存活力和擴散能力，所以從血液中偵測CTC的數量，適用於8種常見癌症 (大腸癌, 肺癌, 乳腺癌, 胃癌, 肝癌, 前列腺癌, 食道癌, 鼻咽癌)。可用以癌症早期篩查，如發現CTC，同步檢測CTC上PD-L1的表達，用以評估病人是否適合免疫治療。
二：ctDNA癌症早期基因篩查
ctDNA（circulating tumor DNA）即循環腫瘤DNA，癌細胞不停地生成和死亡，死亡的癌細胞會釋放出ctDNA進入血液循環，通過抽取受測者血液腫提取ctDNA進行檢測及分析，可一次性全面檢測女性常見30種癌症及男性常見27種癌症，在最早期得知罹患癌症的風險狀況。與傳統的癌症早期篩查（例如PET-CT影像學檢測腫瘤大小、腫瘤標記物的檢測）相比較，ctDNA癌症早期基因篩查可以提早3-5年就發現癌症，真正地實現在病變發生癌症前就檢測出癌症，早發現發預防，大大地降低癌症的發病率和死亡率。
三：遺傳性腫瘤基因篩查
基因遺傳自父母，如果父母攜帶有致病基因，下一代罹患癌症的風險將顯著增加。
臨床研究發現，在所有的癌症患者中，遺傳性癌症佔比8~10%左右。
因此，了解家族是否攜帶腫瘤致病突變基因，預估罹患遺傳性腫瘤的風險，盡早作針對性性預防，可有效保障個人同家人的健康。可一次性檢測18種腫瘤，79種遺傳性腫瘤基因。
透過遺傳基因測試，可找出求診者有否可導致癌症的基因突變。如測試結果屬陽性，表示求診者是患癌的高危人士。
F. 科普講堂 | 關於cfDNA你了解它多少
cfDNA（cell free DNA）指存在於人體血液循環中的、游離於細胞外的高度片段化DNA。在特定情況下（如腫瘤患者、孕婦、接受器官移植的患者等），一小部分來自「異源性」細胞的cfDNA（如腫瘤細胞、胎兒細胞、或供體細胞）可以作為基因檢測的標志物。其中死亡的腫瘤細胞破裂後所釋放出來的、片段化的基因組 DNA也稱之為ctDNA（circulating tumor DNA）。基於cfDNA檢測的「液態活檢」技術在產前診斷、腫瘤的篩查、早期診斷、治療監測和預後評估等多個方面受到極大的關注。
細胞主動裂解（又叫細胞凋亡）過程中產生的「DNA ladder」式的片段化核酸，它們的大小基本上在150-200bp左右。人體是一個龐大而復雜的循環系統，其中的運作周而復始，循環往復。除了整個人體的大循環，還有組成人體的各個部件各自的「小循環」，簡單來說，就是人體各個器官更換狀態的周期。一般情況下，人體會在半年內更新掉身體的98%組織的細胞，也就是說每天每時每刻我們體內都不斷地有細胞在凋亡又有新的細胞在形成。
細胞被動裂解——這種裂解的方式就有很多，既可以來源於外界物理或者化學刺激引發的組織壞死，也可以是自身免疫系統對細胞殺傷作用，不同的是這個過程產生的核酸很大，會接近基因組DNA大小。
方法一：酚-氯仿
原理： 利用核酸DNA不溶於有機溶劑的方法將DNA與其他雜質分離
優點： 成本低；設備要求低。
缺點： 操作繁瑣；回收率低；抑制物殘留多；試劑含有毒成分。
方法二：硅膠柱
原理： 核酸在高鹽條件下與硅膠膜結合，在低鹽、高PH值時核酸從硅膠膜上洗脫下來，經過多次離心轉管收集
優點： 純度高；成本較低。
缺點： 需多次高速離心，操作步驟多；負壓抽吸，開放式操作，效率低，易形成交叉污染；
吸附柱會出現堵塞現象；回收率低，損失量大，不適合小片段提取；不同試劑保存條件不一致，易丟失。
方法三：磁珠法
原理： 精製的超順磁納米硅磁珠在鹽溶液條件下特異性吸附血液中的游離核酸，將吸附核酸的磁珠轉移至低鹽等條件下將其洗脫下來。
優點： 純度高；回收率高，小片段同樣可純化；可自動化操作。
缺點： 國外進口試劑成本高。
1. 檢測cfDNA片段大小
a）利用凝膠電泳檢測，但是不能精確檢測片段大小；
b）利用qPCR檢測, 但只能檢測事先選定的位點，並不適合基因組范圍的分析；
c）利用電鏡檢測， 但費時費力，效率低；
d）利用大規模測序平台檢測；
2. cfDNA相關的分子檢測
利用計算窗口化保護評分（windowedprotectionscore，縮寫wps）進行檢測，即：片段大小=在基因組裡面一個特殊的點內跨越120bp的DNA片段數量-有端點的片段的數量。它和核小體距離有相關性。我們可以根據核小體的距離來推測cfDNA的來源。
3. 檢測目的
a）檢測cfDNA的大小可以知道它是由哪種細胞死亡機制產生的：～10000bp的cfDNA由細胞壞死產生；140-200bp的cfDNA由細胞凋亡產生；313-798bp的為孕婦cfDNA；
b）檢測 cfDNA相關分子信號，比如甲基化，以及核小體距離可以追溯它的組織來源；
c）檢測特定序列的cfDNA的種類數量的變化可以判斷癌症，以及相關疾病。
血中cfDNA在疾病的早期診斷、預後、監測等方面具有重要潛在價值。其具體醫學應用大致包括以下方面：
a）用於產前診斷；
b） 用於免疫性疾病等非腫瘤類疾病的病情分析與療效觀察；
c）用於腫瘤相關分析。
在上述三類應用中，其在腫瘤分析中的價值尤為重要，雖然目前血中cfDNA分析尚未列為臨床必需的檢測指標，但數以千計的研究論文和大量一期和二期臨床試驗的數據，有力支持這一新技術在腫瘤防治中的巨大應用價值：
a）腫瘤的早期診斷；
b）腫瘤治療方案確定；
c）腫瘤療效觀察；
d）腫瘤預後評估；
e）腫瘤轉移風險分析；
f）腫瘤復發監測。
魏禕 | 文案
G. ctDNA是什麼有什麼作用
ctDNA是腫瘤患者血液中游離的來自腫瘤的DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)
在非小細胞肺癌中的應用
在過去十年中，對非小細胞肺癌（NSCLC）的理解發生了重要的變化。現在證實，NSCLC具有不同的分子亞型。現在醫生認為，針對NSCLC的個性化治療，應該是利用這些分子亞型匹配相對應的靶向療法。表皮生長因子（EGFR）突變和ALK易位被認為是NSCLC治療最有效的靶點。但是EGFR和ALK的突變數量是多種多樣的，並且我們檢測到的突變類型還在不斷地增加。因此，現代科學家們利用基於NGS的ctDNA技術，從患者血液中可以獲得ROS1，BRAF，KRAS，HER2-，c-MET，RET，PIK3CA，FGFR1和DDR2的突變信息，從而利用這些突變信息為患者選擇合適的靶向療法。
在乳腺癌中ctDNA的監測作用
乳腺癌轉移確診後，患者已經很少能夠徹底治癒。但是現在，我們可以利用含有腫瘤染色體異質性的ctDNA來對乳腺癌進行檢測。在H Saal教授的研究中，他們對20例早期確診的原發性乳腺癌患者進行了監測和長期隨訪。通過NGS和液體數字PCR聯合使用的方法，他們能夠覆蓋很多低信號的全基因組測序結果，並且首次發現，在手術後，ctDNA監測是高度精確的，其成功監測預示了93%的復發病人以及100%的沒有復發的病人。基於ctDNA的監測中，轉移患者的平均生存期是11個月，而在患者的長期不進展期的時候，是沒有檢測到ctDNA的。因此，ctDNA能夠預測不良生存期。這些發現表明，我們可以利用ctDNA來監測早期乳腺癌患者的轉移情況，並幫助修改治療方案，避免過度治療。
NGS-ctDNA在胰腺癌中的應用
由於通常的活檢技術不能夠描述分子特性，因此胰腺癌和膽道癌患者通常缺少個性化的治療方案。而游離的DNA測序能夠幫助這部分人群進行精準醫療。在Eric A. Collisson教授的研究中，他們分析了26名患者腫瘤中的54個基因。除了9名患者測序失敗，剩下的17名患者中，90.3%的腫瘤突變都能夠在ctDNA中發現。其正確率為97.7%，靈敏度為92.3%，特異性為100%。同時，他們發現，ctDNA與腫瘤標記動態是具有相關性的。因此，可以在胰腺癌和膽道癌患者中，通過ctDNA測序的方法，來確定患者的腫瘤基因型，從而為患者提供准確的靶向療法。
從基於NGS的ctDNA的臨床數據來看，其在轉移性腫瘤監測，腫瘤突變類型的檢測等方面，都具有高精度，高靈敏度，高特異性的優點。加上該技術的無創性和簡便性，其在腫瘤治療中，將會在腫瘤預後，腫瘤精準療法等方面，為臨床治療和護理帶來一次質的飛躍。在ctDNA研究領域，已經有了很多優秀的公司。上海立迪配備了優秀的研究團隊，在進行ctDNA研究及相關產品的開發。 我們相信隨著技術的進步，腫瘤的治療會逐步走向精準化。
DNA 英[ˌdi: en ˈeɪ] 美[ˌdi:en'eɪ]
abbr. 脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid); （美國） 國防部核子局(Defense Nuclear Agency);
[例句]DNA fingerprinting has proved the clincher in this investigation
在這次調查中，DNA指紋鑒定起了決定性的作用。
CT
abbr. Connecticut 美國康奈提格州郵遞區號;
[例句]We also present results for the classification of solitary pulmonary noles detection and diagnosis using CT images.
同時，給出了該演算法應用在孤立肺結節CT圖像的檢測和診斷中的分類結果。
H. ALK為什麼這么「火」(二) | ALK融合基因檢測
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ALK融合基因
間變性淋巴瘤激酶（ALK）突變的形式有過量表達、與其他基因形成融合基因，發生點突變等等。
ALK是非小細胞肺癌（NSCLC）常見的一種驅動基因，中國NSCLC突變陽性率5.3%。
ALK融合基因突變主要在肺腺癌里常見，一般肺鱗癌患者ALK融合基因突變概率很低。
有研究說亞裔的EGFR、KRAS野生型的腺癌患者，ALK陽性比例高達30%-42%，因此如果發現EGFR和KRAS是野生型，是更有必要測下ALK基因的。
下圖為非小細胞肺癌中ALK的重排形式
01
免疫組化（IHC）
原理：通過抗原和抗體的結合反應，配合信號級聯放大來檢測。羅氏公司的Ventana IHC 試劑盒可以達到與FISH檢測結果94%~100%的一致率。
判讀標準是腫瘤細胞胞漿出現簇狀黃棕色染色顆粒，胞膜著色則為陰性。歐盟和中國都已經批准Ventana IHC用於檢測ALK重排。
缺點：由於腫瘤異質性，靶蛋白的表達強度不均一。由於存在蛋白或RNA降解的可能，FFPE切片存儲大於3個月的不建議Ventana IHC檢測。
02
熒光原位雜交(FISH)
原理：分離探針的FISH方法，設計紅與綠兩個探針，分別標記ALK基因的兩端，一旦ALK基因發生斷裂重排或倒轉，紅綠信號便出現分離，而沒有發生斷裂的則呈現為黃色熒光信號。
判讀標准為單個視野中計數50個腫瘤細胞，>50%的細胞出現分離信號則判讀為陽性，如<10%細胞出現分離信號則判讀為陰性。如果10%~50%的細胞出現分離信號，則再次挑選50個腫瘤細胞，看計數100個細胞，是否有>15%的細胞出現分離信號（僅限用於雅培的分離探針試劑盒）。
缺點：無法判斷ALK的融合型，必須由經驗豐富的病理科醫師來完成。15%的臨界值存在一定爭議，由於腫瘤異質性、取樣偏差等問題，存在假陰性的可能。即漏檢ALK突變陽性患者。
03
反轉錄PCR（RT-PCR）
原理：通過預先設計好的引物對樣本的RNA進行逆轉錄來檢測融合突變，簡便可行，並可以確定ALK的融合型。
缺點：需要高質量的ALK RNA樣本，臨床大部分是石蠟樣本，RNA降解嚴重，影響檢出率，導致假陰性的結果，大於2年的標本不建議使用RT-PCR檢測，推薦新鮮腫瘤組織樣本。通過PCR引物只能檢測已知的融合基因型，無法囊括所有的融合型。
03
二代測序（NGS）
目前已經證實使用二代測序技術檢測基因擴增、基因重排是可行的，而且二代測序有助於發現ALK新的融合突變形式。而且僅需要少量樣本即可檢測多種基因的突變情況。
缺點：價格較高，判讀標准及後續驗證等亟待解決。
臨床常用的三種方法是FISH、Ventana IHC及RT-PCR，三種方法FISH的靈敏度最低。因此，如果是胸腔積液、細針穿刺取到的細胞學樣本做成的蠟塊，不建議使用FISH，避免假陰性。另外通過抽血檢測循環腫瘤DNA（ctDNA），循環腫瘤細胞（CTC）也正在發展起來。總之在面對ALK檢測結果模稜兩可的時候，一定要換一個檢測方法去驗證，也沒有哪一種方法靈敏度和特異性都是100%。
參考資料：
DOI: 10.20892/j.issn.2095-3941.2017.0017
，侵刪。
I. Oseq-ctDNA腫瘤基因檢測的檢測內容有哪些
Oseq-ctDNA腫瘤基因檢測可以一次性檢測腫瘤相關508個基因的全外顯子區域，全面、准確解讀88種腫瘤葯物（未來將持續更新葯物種類）與基因的關系，不存在獲取腫瘤組織隨機性高、檢測基因單一、位點不全面等常見問題，擴大靶向葯物可選擇范圍，減少患者耐葯性產生，提高用葯精準性和治療效率。同時Oseq-ctDNA還為患者提供腫瘤遺傳易感基因檢測，為患者及家族成員提示遺傳性腫瘤罹患風險。