鼠疫PCR檢測方法

1. 鼠疫耶爾森菌的微生物學檢查法

用DNA探針雜交方法或PCR技術檢測鼠疫耶爾森菌核酸，有助於鼠疫的診斷。PCR敏感性極高，蚤體內有10個鼠疫耶爾森菌感染即可用PCR技術檢出。

2. 鼠疫桿菌的檢測

鼠疫桿菌的檢驗必須嚴格執行烈性菌管理規則，注意防止氣溶膠感染或防蚤叮咬。動物實驗應有防護設備，實驗用過培養物及器材應及時消毒。取檢材塗片，用甲醇或酒精乙醚混合液固定5～10分鍾，然後進行革氏或美蘭染色，鏡檢觀察鼠疫桿菌的形態特徵。將檢材劃線接種於普通瓊脂平板上，龍膽紫血瓊脂平板及厚金格爾（hottinger）瓊脂平板上。28℃孵育48小時後觀察菌落特徵，挑取可疑菌落，塗片、染色、鏡檢。必要時，接種厚金格爾斜面和肉湯，作噬菌體裂解、凝集或沉澱試驗等進一步鑒定。確診第一例鼠疫報告時，須作豚鼠皮下或擦皮接種試驗。

3. PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker，根據marker條帶判斷產物分子量大小，從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列，看上面有什麼酶切位點，用一個酶或者兩個酶切斷，看與理論預測的條帶數目和大小是否一致。一般檢測有以上兩步就行了，如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上，轉到大腸桿菌中。拿到公司去測序，測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致，這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上，適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析，看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

4. 怎麼檢查自己得了鼠疫

突然出現發熱、寒戰、淋巴結疼痛、咳嗽、咳血或出血等任一症狀，應當立即就醫，可以通過檢查血常規、細菌的分離和鑒別、血清學檢查、聚合酶鏈反應（PCR）檢測等方式，確認是否得了鼠疫。

臨床表現：

1、潛伏期

腺型2～8天；肺型數小時至2～3天；曾經預防接種者可延至9～12天。

2、症狀體征

1）輕型

有不規則低熱，全身症狀輕微，局部淋巴結腫痛，偶可化膿，無出血現象，多見於流行初、末期或預防接種者。

2）腺型

多見，常發生於流行初期。急起寒戰、高熱、頭痛、乏力、全身酸痛偶有惡心、嘔吐、煩躁不安、皮膚淤斑、出血。發病時即可見蚤叮咬處引流區淋巴結腫痛，發展迅速，第2～4天達高峰。腹股溝淋巴結常受累，其次為腋下、頸部及頜下。

由於淋巴結及周圍組織炎症劇烈，使呈強迫體位。如不及時治療，腫大的淋巴結迅速化膿、破潰、於3～5天內因嚴重毒血症、繼發肺炎或敗血症死亡。治療及時或病情輕緩者腺腫逐漸消散或傷口癒合而康復。

二、預防措施

1、管理傳染源

加強國際檢疫，防止從國外傳入。發現疑似或確診患者即予分別隔離，並於 6h 內向衛生防疫機構報告，接觸者檢疫 6 天。

肺鼠疫隔離至痰培養 6 次陰性，腺鼠疫隔離至淋巴結腫完全消散後再觀察 7 天。患者排泄物及用具應徹底消毒或焚毀。疫區封鎖至少 9 天，大力開展捕鼠、滅鼠、消滅其他疫源動物，控制鼠間鼠疫。

2、切斷傳播途徑

1）消滅跳蚤患者的身上及衣物都要噴撒安全有效的殺蟲劑殺滅跳蚤，滅蚤必須徹底，對貓、狗，家畜等也要噴葯。

2）加強交通及國鏡檢疫對來自疫源地的外國船隻、車輛、飛機等均應進行嚴格的國境衛生檢疫，實施滅鼠、滅蚤消毒，對乘客進行隔離留檢。

5. PCR檢測的具體步驟是什麼

具體步驟就是：
1，制備瓊脂糖凝膠，或者聚丙烯醯胺凝膠
2，取少量（大概5ul）PCR產物（確定是否加入上樣緩沖液），點樣到凝膠孔里，記得點合適的maker
3，接通電源，調好電壓（120V）,開始運行
3，等跑到大概2/3處，在紫外成像儀里查看條帶。
就是如此，關鍵看你設備是否齊全

6. 高中生物。RT-PCR怎樣檢測病毒含量呢

RT-PCR檢測方法的具體步驟如下：
（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。 3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計： 檢測標本RNA
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。） 陽性對照：已知病毒RNA

2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液） 1）按下表加入試劑： PCR反應體系
對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。
3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR 擴增。
4、RT-PCR產物檢測
1）2.0％瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。 4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。 5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷。

7. 鼠疫的檢查

1.常規檢查
白細胞總數及中性粒細胞增多，紅細胞與血紅蛋白減少則因出血程度而異，血小板可減少。腸炎型者可有血樣或黏液血便。
2.細菌的分離和鑒別
取血、膿、痰、腦脊液、淋巴結穿刺液等材料送檢。一般檢查程序包括顯微鏡檢查、培養、鼠疫噬菌體裂解試驗和動物實驗，簡稱四步試驗，以上四步均獲陽性結果可確診鼠疫。
3.血清學檢查
（1）熒光抗體染色鏡檢（IFA）具有快速、敏感度及特異性較高的優點，但有假陽性或假陰性。
（2）間接血凝反應（IHA）是將鼠疫特異性抗原（或抗體）致敏的紅細胞與被檢材料混合，用於檢查和測定鼠疫抗體（或抗原）。是一種快速、敏感、特異性高的血清學診斷方法。不僅可檢查活菌和死菌，也可檢查可溶性抗原以及污染、腐敗的材料。70年代於我國得到普遍推廣，是目前行之有效的快速診斷方法之一。
（3）放射免疫沉澱試驗（RIP）敏感、高度特異，不僅是目前鼠疫監測、查源較為理想的方法之一，特別是輕型和不典型病例的追索診斷，作為補充IHA的不足，具有一定的實用價值。
（4）葡萄球菌A蛋白的血凝改進方法（SPA-IHA）比間接血凝的檢出率高，方法更簡便，適於野外基礎實驗使用。
4.聚合酶鏈反應（PCR）檢測
可以在幾小時內作出診斷，是一種快速和高度特異的方法。對鼠疫監測、臨床早期診斷及分子流行病學調查有重要意義。
5.其他的檢測方法有ELISA法及放射免疫法等

8. PCR產物的檢測方法有哪些都有什麼原理

1.瓊脂糖凝膠電泳 同時點分子量marker,根據marker條帶判斷產物分子量大小,從而大致判斷是不是你要的
2.酶切 已知你產物的序列,看上面有什麼酶切位點,用一個酶或者兩個酶切斷,看與理論預測的條帶數目和大小是否一致.一般檢測有以上兩步就行了,如果需要知道確切的需要進行3
3.測序 連接到pMD-18t 載體上,轉到大腸桿菌中.拿到公司去測序,測序結果通過gene bank比對看與哪個基因一致,這種方法最准確
4.表達 pcr產物連到真核或者原核表達載體上,適宜條件表達出來以後的蛋白做質譜分析,看與理論產物表達的蛋白是否有一致的片段

9. 微生物學的檢查方法是有哪些

微生物學檢查法

標本

因鼠疫傳染性極強，採集標本時必須嚴格無菌操作。根據病型採取淋巴結穿刺液、腫脹部位組織液、膿汁，血液和痰等。人和動物屍體可取肝、脾、肺、病變淋巴結以及心血等。陳舊屍體取骨髓。將採集標本送至有嚴密防護措施的專門實驗室進行檢查，禁止在一般實驗室進行操作。

直接塗片鏡檢

除血液標本外，一般均需塗片或印片，乾燥後用甲醇固定，革蘭染色或呂氏美蘭染色，鏡檢。在不同材料中，菌體大小、形態有很大差異，除典型形態外，往往可見菌體呈多形態性，需加以注意。

分離培養與鑒定

血液標本需先置肉湯中進行增菌培養。分離培養一般選用血瓊脂平板，28攝氏度24小時後，可見較小的露滴狀菌落，繼續培養則菌落增大至1～2毫米，中央厚而緻密，周邊逐漸變薄。取可疑菌落進行塗片染色鏡檢，噬菌體裂解試驗，血清凝集試驗，特異熒光抗體染色等作出鑒訂。

血清學試驗

可用於檢查鼠疫耶爾森菌抗原或特異性抗體。敏感而特異的試驗方法有ELISA、固相放射免疫分析，SPA協同凝集試驗等。

檢測核酸

用DNA探針雜交方法或PCR技術檢測鼠疫耶爾森菌核酸，有助於鼠疫的診斷。PCR敏感性極高，蚤體內有10個鼠疫耶爾森菌感染即可用PCR技術檢出。

診斷檢查

診斷：取決於病人有接觸史及肺部受累表現，病因診斷取決於痰、血或淋巴結吸出物革蘭染色、培養，有條件的單位可作直接熒光素標記抗體染色，可提供快速的病因診斷。

10. 怎樣確定得了鼠疫

如果突然出現發熱、寒戰、淋巴結疼痛、咳嗽、咳血或出血等任一症狀，應當立即就醫，可以通過檢查血常規、細菌的分離和鑒別、血清學檢查、聚合酶鏈反應（PCR）檢測等方式，確認是否得了鼠疫。

一、鼠疫的臨床表現

主要的臨床類型包括腺鼠疫、肺鼠疫和敗血型鼠疫，其他類型鼠疫如皮膚鼠疫、腸鼠疫、扁桃體鼠疫等型比較少見。

1、腺鼠疫

臨床表現主要是高熱、畏寒、伴惡心嘔吐、頭痛及四肢痛、顏面潮紅、結膜充血、皮膚黏膜出血點等。多表現為腹股溝淋巴結、腋下淋巴結和頸部淋巴結腫大，且發展迅速，多為單側，一周後淋巴結很快化膿破潰。

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一、鼠疫的危害

鼠疫是由鼠疫耶爾森菌引起的自然疫源性疾病，通常在嚙齒動物之間流行，偶爾能引起人間流行，是《中華人民共和國傳染病防治法》規定的甲類傳染病。北京不屬於鼠疫自然疫源地，但依然存在鼠疫輸入和傳播的風險。

鼠疫起病急、病程短、死亡率高、傳染性強、傳播迅速。特別是敗血性鼠疫和肺鼠疫，如果不加治療，病死率為30%-100%。鼠疫潛伏期較短，一般為1-6天，但個別病例可達8-9天。

二、鼠疫的傳播

1、蚤叮咬的傳播方式

鼠-蚤-人，即跳蚤叮咬病鼠後再叮咬人，或剝取染疫旱獺皮或剝食其它染疫動物，此類傳播方式常引起腺鼠疫或敗血型鼠疫。

2、人-人傳播方式

即健康者接觸患有肺鼠疫的病人後，經呼吸道吸入感染，此種方式感染的主要為肺鼠疫。

三、預防辦法

1、減少疫區活動區域

避免到疫區旅遊或活動，避免接觸嚙齒動物(如：鼠類、旱獺)。

2、避免與患有鼠疫的病人密切接觸

與可能感染肺鼠疫的病人接觸時，盡量和病人保持1米以上的接觸距離，並戴口罩，勤洗手。

3、採取防蟲措施

採取必要的防跳蚤叮咬措施，使用驅蟲制劑，常用驅蚊劑一般都可以驅趕跳蚤。