⑴ 細胞活性檢測的方法有多少種 每種的原理是什麼
簡單說幾個把
染色體法 主要在培養基中利用死活細胞對燃料親和力不同 來判斷
克隆形成實驗 原理是單個細胞在體外增至六代後，後代形成的細胞群體 ，通過計算其克隆形成率 來判斷
比色法 也是比較經典的 M,RR 活體細胞中的線粒體中的琥珀酸脫氫酶可以將M，rr還原成藍紫色的結晶甲醋 死細胞無此功能
⑵ 鑒定培養細胞活力有多種方法，fda是主要方法之一，其原理是什麼
細胞活力鑒定的方法：
1、相差顯微鏡觀察法 2、FDA染色法 3、伊凡藍染色法
FDA染色法：是測定原生質體活性的一種方法，即熒光素雙醋酸酯染色，FDA本身無熒光，
進入原生質體後便產生熒光素，它不能自由進入原生質體膜，因此有活力的細胞便產生熒光。
原生質分離，酶，纖維素酶，離析酶。
步驟：葉片表面消毒→去除表皮→葉碎片漂浮在含有酶和滲透壓穩定劑的溶液中→培育→原
生質體沉到培養皿底部→除去酶溶液→將原生質體移入CPW清洗→離心→清洗基質兩次
→重懸浮於培養基→除去小的個體，用血球計計數→調整到合適的密度重懸浮於培養基。
原生質體的培養：
培養基，MS+NAA 2.0ppm+BA 0.5ppm+3%蔗糖+9%甘露醇
注意：
1、原生質體分離後，非常脆弱，需要滲透壓保護劑的保護直到細胞壁形成。
2、針對不同的研究對象，培養基中生長素和細胞分裂素的水平要做適當調整。
影響原生質體培養的因素，營養需求（NH4+不能過多）滲壓劑，培養密度（105/mL）
貯藏條件（通常在黑暗處）。
培養方法:液體基質培養法,半液體基質培養法,固體基質培養法,看護培養。
固體培養的步驟,原生質體移入培養基→1體積含原生質體的培養基與1體積含瓊脂糖
(40℃)的培養基混和→倒轉培養皿在25℃下培養→原生質體重新產生細胞壁並分裂成細
胞團→細胞團於瓊脂糖基質中傳代培養,培養基中應減少滲壓劑以利於愈傷組織的形成→誘
導分化成植物的根莖。
原生質體分離培養的意義：
1、除去了細胞壁為植物細胞之間的融合掃平了障礙，同時葉為製造新雜種開辟了道路。
2、原生質體可攝入外源DNA,細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結合為高等植物的遺傳飾變打下基礎。
3、獲得細胞無性系和選育突變體的優良起始材料。
取洗滌過的原生質體懸浮液 0.5ml置於10×100mm的小試管中，加入 FDA溶液使其最終濃度為 0.01混勻、置於室溫5min後用熒光顯微鏡觀察。激發光濾光片用QB24壓制濾光片用JB8。發綠色熒光的原生質體為有活力的，不產生榮光的為無活力的。由於葉綠素的關系，葉肉原生質發黃綠色熒光的為有活力的，發紅色熒光的為無活力的。
⑶ 細胞活性檢測的方法有多少種 每種的原理是什麼
在目前的細胞活性檢測方法中，MTT法是較早且較為經典的方法。但是，由於MTT法形成的甲物是非水溶性的，需要加有機溶劑溶解，這不僅增加了研究人員的工作量，也給實驗帶來了一定的誤差。在這里我們向大家介紹一種國外最新檢測方法—CCK-8法，它具有方便、靈敏、快速、無放射性、重復性好的特點。現在已廣泛用於細胞增殖檢測、細胞毒性檢測、葯物篩選、葯敏試驗等。
另外還將向大家介紹幾種氧化應激和蛋白質抗體標記的新方法。
內容：
1、新型細胞活性檢測方法介紹
2、國外氧化應激測定方法介紹
3、蛋白質抗體標記的新方法介紹
原理恕在下不知
⑷ 對於ALP水解底物測定有哪些方法
一、血清鹼性磷酸酶（ALP）測定的常用方法有幾種，它們之間有何差別？
正常成人血清ALP主要來自肝臟，而來自骨組織的ALP一般少於總活性一半。其各自含量與年齡密切相 關，但也受性別的影響。還可能存在少量的小腸型ALP，特別是血型為分泌型B型或O型的人。 現已知人體含4型ALP同工酶，即腸型（IALP）、胎盤型（PALP）、生殖細胞型（GALP）和非特異組織型（TUALP）ALP。其中非特異組織型鹼性磷酸酶在基因表達後經過不同的修飾形成肝、腎、骨等次級同工酶。
[臨床意義] 肝膽疾病，尤其是阻塞性黃疸患者，該酶活性顯著升高。骨骼疾病時血清ALP活性增高。血清ALP活性測定成為鑒別肝膽疾病和診斷骨質增生不可缺少的指標。 [測定原理] 在鹼性條件下，鹼性磷酸酶將無色磷酸對硝基苯酚水解為黃色對硝基苯酚，在405nm測定對硝基苯酚生成 的速率，這個速率與血清中ALP活性成正比。反應需要Mg2+作為激活劑。 [常用測定方法] 測定ALP活性受到組織來源、底物類型、反應溫度，特別是緩沖液種類的影響，目前，國際上生化試劑主要生產廠家，生產的ALP檢測試劑盒的主要差異就在於所使用的緩沖液不同。常用的激活型緩沖液不僅起緩沖作用，並可作為磷酸的受體參與反應，因而能增進酶促反應的速率。激活型緩沖液中，二乙醇胺（DEA）的激活作用比2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP）的激活作用更強。因此用不同緩沖液測定的ALP活性，其參考值不同。 不少國家，包括我國，多採用AMP或DEA做緩沖液，但這兩類物質不易提純，前者常混有5-氨基-3-吖-2, 2,5-三甲基乙醇，後者易含一乙醇胺，均對ALP有抑製作用。故日本學者建議採用2-乙氨基乙醇緩沖液，而德國學者建議使用甲基葡萄糖胺緩沖液，此類試劑純度高，不含抑制ALP活性的物質，可不加螯合劑，其pK值高於DEA。
根據所使用的激活型緩沖液不同，目前常用的檢測方法主要有四種： 1、 IFCC推薦方法：AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）緩沖液 正常參考范圍：45~130 U/L，37℃ 2、 JSCC推薦方法：EAE（2-乙氨基乙醇）緩沖液 正常參考范圍：115~359 U/L，37℃ 3、 GSCC推薦方法：DEA（二乙醇胺）緩沖液 正常參考范圍：80~260 U/L，37℃ 4、 DSKG推薦方法（新GSCC方法）：MEG（N-甲基-D-葡萄糖胺）緩沖液 正常參考范圍：45~130 U/L，37℃
二、甘油三酯（TG）常用測定酶法中，為什麼採用推薦方法—去除游離甘油的二步酶法優於一步酶法？
血脂異常是動脈粥樣硬化性疾病的重要危險因素之一，甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（TC）、高密度與低密度脂蛋白膽固醇（HDL-C與LDL-C）是四項基本指標。臨床上制定四項血脂的合適水平或異常水平的劃分標准、治療指針及治療目標，必須在血脂測定結果准確性的基礎上進行。由於TG的脂肪酸組成復雜，而且血中還有游離甘油與不完全甘油酯，使TG測定的結果的准確性顯得尤其重要。TG測定的常規方法，國內普遍採用甘油磷酸氧化酶法，也是檢驗學會的推薦方法，但目前因為商品試劑大都未用二步酶法去除游離甘油，這對多數住院病人是不合適的。 [測定原理] 標本中的游離甘油經第1試劑中甘油激酶（GK）作用，最後生成過氧化氫，再經過氧化氫酶分解成H2O，使游離甘油的影響被消除；另外，維生素C由維生素C氧化酶去除。第2試劑中TG等經脂蛋白脂酶（LPL）等作用所產生的過氧化氫，在POD的作用下，使4-氨基安替比林（4-AA）與HDAOS發生氧化縮合，生成紫色的醌色素，通過測定該色素的增加，求出TG濃度。
以SYSMEX公司生產的二步酶法TG測定試劑盒為例：
第一步反應： 抗壞血酸 + 1/2O2 AOD 脫氫抗壞血酸 + H2O 游離甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO 磷酸二羥丙酮 + H2O2 H2O2 過氧化氫酶 H2O + 1/2O2 第二步反應： 甘油三酯 + 3H2O LPL 甘油 + 3分子游離脂肪酸 甘油 + ATP GK 3-磷酸甘油 + ADP 3-磷酸甘油 + O2 GPO磷酸二羥丙酮 + H2O2 2H2O2 + 4-AA + HDAOS POD 醌類染料 [參考值 ] 高甘油三酯血症： 1.69mmol/L以上（150mg/dL以上）。
[說明] 現階段允許一步酶法與兩步酶法並存，要求逐步過渡到統一採用兩步法。在未統一方法前，實驗室報告TG測定結果時應註明「去FG值」或「未去FG值」，這將有助於臨床醫生對結果的正確判斷。 正常人血清FG濃度平均約0.11mmol/L(10mg/dl)，在糖尿病、服用含甘油的葯物、靜脈營養、情緒應急、血標本污染時，FG將明顯增高，以致影響對TG水平的判斷。 國外學者建議：臨床實驗室應備有可以去FG空白的試劑，供必要時採用；糖尿病及特殊門診以及TG>2.3mmol/L者，最好作FG空白校正。
⑸ 誰能告訴我，怎樣用對-硝基苯磷酸鹽（即PNPP）法測定鹼性磷酸酶（ALP）活性
【步驟】
（1）用吸管吸掉96孔板內的培養液，用PBS沖洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化鎂和6.7mmol/L PNPP的反應液。
（2）每孔150ul.37℃避光放置半小時,然後加0.1mol/L氫氧化鈉100ul終止反應,用酶標儀於405nm波長下測定OD值.
（3）樣品OD值在ALP標准曲線上讀取酶活性值(U/L).
ALP標准曲線繪制:
取PNP0.0111克用三蒸水溶解後稀釋至250ml,此時PNP的濃度為320umol/L.依次稀釋到160 umol/L，80umol/L,40umol/L,20umol/L,10umol/L和5mol/L.相當於ALP1280 U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶標儀於405nm波長下測定PNP的OD值.以ALP活性值作為自變數,對應的OD值作為應變數,求得直線回歸方程.
【結果】測定鹼性磷酸酶的含量
還有其他方法來測定，比如
以ALP為目標物的檢測方法有
1 Gomori鈣鈷法
2偶氮偶聯法
3鹼性磷酸酶染色試劑盒法。
4.PNPP偶氮法
5. BCIP/NBT比色法
6 茜素紅法
7. von Kossa法
⑹ 細胞活性和細胞毒性檢測的實驗方法
細胞數量確定
1.將細胞懸浮液（100μL/孔）接種在96洞孔板中。將板在潮濕的培養箱中預孵育（例如，在37℃，5％CO2下）。
2.向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。
3.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。
4.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。
細胞增殖和細胞毒性測定
1.將種子細胞以103-104個細胞/孔的密度在96孔板中在100μL培養基中培養。將細胞在CO2培養箱中於37℃培養24小時。
2.將不同濃度的待測物質加入板中。
3.將培養板在培養箱中孵育適當的時間（例如，6,12,24或48小時）。
4.使用重復移液器向板的每個孔中加入10μLCCK8溶液。注意不要在孔洞中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.讀數。
5.將培養板在培養箱中孵育1-4小時。
6.在讀取孔板之前，重要的是在軌道振動器上輕輕混合1分鍾，以確保顏色均勻分布。
7.使用酶標儀測量450 nm處的吸光度。
數據分析
統計分析有幾種方法，您可以選擇使用O.D.值或細胞數量，我們提供其中一種方法。
細胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =實驗孔吸光度（含有細胞，培養基，CCK-8和待測化合物的孔的吸光度）。
Ab =空白孔吸光度（含有培養基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac =對照孔吸光度（含有細胞，培養基和CCK-8的孔的吸光度）。
製作標准曲線
1. 細胞計數板計數細胞懸液中的細胞數。
2. 使用培養基，等比稀釋細胞懸液為一個濃度梯度，通常需要5-7個濃度梯度，每組幾個復孔。然後接種細胞。（注意每孔的細胞數量。如果您將細胞懸液稀釋在管中，在加入培養板的孔之前，請小心再次混勻細胞。每孔中細胞懸液的體積應該是一致的。）
3. 培養直至細胞貼壁（通常2-4小時），然後每100 μl培養基加入10 μl CCK-8。繼續孵育1-4小時，用酶標儀測量450nm處的吸光度。製作出一條以細胞數為X軸坐標，O.D.值為Y軸坐標的標准曲線。
可以基於該曲線確定待測樣品的細胞數。使用此標准曲線的先決條件是培養檢測條件相同。
注意事項
1. 確保葯物和CCK8均勻分布在培養基中。
2. 細胞增殖越多, 顏色越深; 細胞毒性越強，顏色越淺。
3. 對於貼壁細胞，每孔至少需要1000個細胞（100 μl培養基）。對於白細胞，由於靈敏度較低，每孔至少需要2500個細胞（100 μl培養基）。推薦的96孔板每孔最大細胞數為25000。如果使用24孔或6孔板進行該檢測，請計算相應的每孔的細胞數，並調整CCK-8的體積，使其為每孔總液體體積的10％。
4. 因為CCK8測定是基於活細胞中的脫氫酶活性，影響脫氫酶活性的條件或化學物質可能導致實際活細胞數與使用CCK-8測定活細胞數之間有差異。
5. WST-8可能與還原劑反應生成WST-8 formazan。如果使用還原劑 (例如一些抗氧化劑)會干擾檢測。如果待檢測體系中存在較多的還原劑，需設法去除。
6. 孵育2小時後，背景O.D.值一般為0.1-0.2單位。
7. 注意不要在孔中引入氣泡，因為它們會干擾O.D.值。
8. 如果您想對CCK8溶液進行滅菌，請使用0.2 μm的膜過濾溶液。
9. 孵育時間因孔中細胞的類型和數量而異。通常，白細胞著色較弱，因此可能需要較長的孵育時間（長達4小時）或大量細胞（~105細胞/孔）。
10. 如果細胞懸液中存在高濁度, 測量並減去樣品在600nm或更高波長的O.D值。
11. CCK8不能用於細胞染色。
12. 培養基中的酚紅不會影響實驗結果，酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。
13. CCK8的毒性非常低，在CCK8測定完成後，相同的細胞可用於其他細胞增殖測定，例如結晶紫測定，中性紅測定或DNA熒光測定。（除非細胞極為稀少，不推薦。）
14. 該試劑盒可用於大腸桿菌，但不能用於酵母細胞。
15. 在讀取平板之前，您可以在搖床上輕柔混勻。
16. 我們建議將細胞接種在靠近培養板中央的孔中，最外圍一圈孔中的培養基容易蒸發，可以用PBS，水或培養基填充這些孔。
17. 如果您沒有450nm濾光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之間的濾光片, 450nm濾光片具有最佳靈敏度。
18. 測量450nm處的吸光度，如果您需要進行雙波長測定，作為參考波長可以測定650nm處的吸光度。
19. 葯物中金屬離子的存在可能會影響CCK8的靈敏度。終濃度為1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制 5%、15%、 90% 的顯色反應，使靈敏度降低。如果終濃度是10mM的話，將會100%抑制。
Glpbio是新啟的世界領先的高性能的生命科學產品供應商之一，產品涵蓋癌症、神經科學、抗感染、表觀遺傳學等20個熱門研究領域，覆蓋Akt、Jak等近千個細分靶點。
上海宏葉生物科技有限公司是GlpBio在中國區的總代理。
推薦測試劑 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)
⑺ 細胞活性檢測的方法有多少種
細胞活性測定方法有台盼藍染色法、克隆（集落）形成法、 3H 放射性同位素摻入法、 MTT 法等。其中 MTT 法以其快速簡便，不需要特殊檢測儀器、無放射性同位素、適合大批量檢測的特點而得到廣泛的應用。但 MTT 法形成的 Formazan 為水不溶性的，需要加有機溶劑溶解，由於在去上清操作時會有可能帶走小部分的 Formazan ，故有時重復性略差。為了解決這個問題，研究人員又開發了很多種水溶性的四氮唑鹽類：如 XTT 、 CCK-8 （ WST-8 ）等。
⑻ 求助成骨細胞分化ALP染色活性鑒定問題
目的：通過觀察植物雌激素α玉米赤霉醇（α-ZAL）對體外培養新生大鼠顱骨成骨細胞的作用，研究植物雌激素α-玉米赤霉醇對大鼠成骨細胞增殖、分化及蛋白表達的影響，探討植物雌激素α-玉米赤霉醇在骨代謝中的作用機理，以期為骨質疏鬆防治葯物的研究開闊思路。 方法：1.採用二次酶消化法分離培養新生（24h）SD 乳鼠顱蓋骨成骨細胞。2.應用鈣鈷法鹼性磷酸酶(ALP)染色和茜素紅礦化結節染色來鑒定成骨細胞。3.應用噻唑蘭(MTT)法測定植物雌激素α-玉米赤霉醇對成骨細胞增殖的影響。4.採用對硝基苯二鈉基質動力學法檢測了24 h和48h 成骨細胞鹼性磷酸酶活性的改變。5.採用免疫組化法觀察α玉米赤霉醇對體外培養成骨細胞的Bax、Bcl-2表達的影響。 結果：1.細胞形態學觀察：剛接種的原代成骨細胞呈球形，24h內存活細胞已沉降貼壁，培養第2天能夠完全展開，呈三角形、梭形，核明顯增大；傳代培養5天，細胞形態可見多樣化，胞漿豐富，向外伸展，伸出多個偽足，與周圍細胞的偽足相互連結，細胞半融合；培養一周左右，可見長索形、多角形、條索形，匯合時細胞呈鋪路石狀，可重疊生長。2.成骨細胞的鑒定：ALP 染色可見90％細胞染色陽性,胞質中出現灰黑色顆粒或塊狀沉積，礦化結節呈橘紅色結節、邊界清晰，可證明為成骨細胞。3.對大鼠成骨細胞增殖的影響：大鼠成骨細胞在含有不同濃度（10-5mol/L～10-10mol/L）α玉米赤霉醇以及含有10-10mol/L的雌二醇和無葯物的培養基中培養24h後，與E2組比較，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 這兩種濃度差異無顯著性（P＞0.05），說明這兩種濃度有促進成骨細胞增殖的作用4.對大鼠成骨細胞外鹼性磷酸酶活性的影響：與正常組比較，三組均有顯著性差異，與E2組比較，α-ZAl10-7mol/L、α-ZAl10-10mol/L 這兩種濃度差異無顯著性（P＞0.05），說明這兩種濃度均可以促進成骨細胞分泌ALP。在促進成骨細胞分泌ALP的過程中，隨著用葯天數的增加，ALP 含量也增加。5. Α-ZAL對Bcl-2，Bax蛋白表達分析的影響：α-ZAL（10-7mol/L）組、α-ZAL（10-10mol/L）組抑製成骨細胞凋亡的作用。 結論：1.一定濃度的α-玉米赤霉醇可以促進成骨細胞的增殖分化，說明它們對骨都具有雌激素樣活性。2.Bax/Bcl-2 參與成骨細胞的凋亡過程,一定濃度的α-玉米赤霉醇可以通過調節Bax/Bcl-2 起到關鍵調控作用。
⑼ 細胞活力測定常用的簡便方法是
MTT法又稱MTT比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（Formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤葯物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由於MTT經還原所產生的甲瓚產物不溶於水，需被溶解後才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的准確性產生影響，而且溶解甲瓚的有機溶劑對實驗者也有損害。
細胞活力常用百分比表示，活力的大小對試驗結果有很大影響。細胞活力的測定有許多方法，最簡便常用的方法是台盼藍（trypanblue）染色法。台盼藍又稱錐藍，是一種陰離子型染料，這種染料不能透過活細胞正常完整的細胞膜，故活細胞不著色，但死亡細胞的細胞膜通透性增加，可使染料通過細胞膜進入細胞內，使死細胞著色呈藍色。
⑽ 如何進行兔骨髓間充質細胞ALP活性定量檢測
如何進行兔骨髓間充質細胞ALP活性定量檢測
髓核細胞與骨髓間充質幹細胞共培養，影響髓核細胞的活性，經共培養的髓核細胞增殖速度、蛋白多糖合成量較對照組提高明顯，髓核細胞活性上調。 睾丸支持細胞與骨髓間充質幹細胞在體外共培養的早期，睾丸支持細胞可以顯著促進間充質幹細胞的生長，但在後期則反而抑制間充質幹細胞的生長。