流感病毒檢測有幾種方法

❶ 流感病毒是怎麼引起的 流感病毒檢測

流感是一種很常見的疾病，甚至很多人都患過流感，但是卻很少有人知道引起流感的原因，流感雖然不是什麼很嚴重的疾病，但是不及時治療越發嚴重後也有可能會導致死亡，那麼流感病毒是怎麼引起的？流感病毒檢測？
流感病毒是怎麼引起的
流感是流行性感冒的簡稱，是一種由流感病毒引起的急性呼吸道感染。主要的症狀有發熱、鼻部症狀、咳嗽、頭痛、全身不適等。在流感大流行期間，老年人、心肺功能不全，或者晚期妊娠的孕婦等高危人群，在患流感後可以導致死亡。甚至一些健康的青年，在流行期間，也可能病情危重而死亡。流感的傳染性強，主要通過呼吸道傳播。病毒表面有一層包膜，包膜的糖蛋白突起由植物血凝素（HA）和神經氨酸酶（NA）構成。這兩種成分是甲型流感病毒分型的主要依據，比如我們經常聽到的H5N1和H7N9，就是根據這兩種抗原成分來命名的。流感病毒經呼吸道吸入以後，病毒表面的植物血凝素能夠識別人體細胞表面的受體並結合，侵入呼吸道的纖毛柱狀上皮細胞，在細胞內復制。復制出來的病毒，藉助神經氨酸酶的作用，使病毒從細胞內釋放。進而再感染其他纖維柱狀上皮細胞，引起細胞變性壞死脫落，從而導致上呼吸道局部粘膜的炎症，最終出現全身的毒性症狀。

流感病毒檢測
流感病毒的檢測，包括病毒抗原檢測和病毒核酸檢測兩種方法。病毒抗原檢測使用快速抗原檢測方法，多數是採用免疫熒光的方法檢測呼吸道標本，(包括咽拭子，鼻拭子，鼻咽或管抽取物中的粘膜上皮細胞等)使用單克隆抗體來區分甲、乙型流感，一般可以在數小時內獲得結果。其它還有膠體金試驗一般能在10到30分鍾獲得結果。病毒的核酸檢測主要是用PCR法來檢測呼吸道的標本，包括咽拭子，鼻拭子，鼻咽或氣管抽取物,痰中的流感病毒，核酸病毒核酸檢測特異性和敏感性最好，且能快速的區分病毒的類型和亞型，一般能在4到6小時內獲得結果。

流感病毒有潛伏期嗎
流感病毒是有一定潛伏期的，不同的流感病毒潛伏期也不一樣。一般情況下潛伏期都在7天之內，禽流感病毒的潛伏期在2-4天左右。在潛伏期之後大部分患者都會出現類似普通感冒的症狀，表現為發熱，鼻塞流涕，頭痛，全身肌肉關節酸痛等症狀。隨著病毒在體內的蔓延，患者也會在短時間內出現高熱抽搐，氣促，呼吸困難等症狀，需要及時使用抗病毒葯物治療。

流感病毒的特點有哪些
由於流感病毒的活動強度在不同的季節均不等，所以它的流行具有顯著的季節性。其原因為不同季節的溫度和濕度都不同，這就會導致流感的發生也不同。因此，我們需要在不同的季節採取相對應的防控措施來預防。有研究顯示，春夏季節流行性感冒的發生率要顯著高於其他的季節，這是因為秋冬季節的氣溫較低，會降低流感病毒的活力和傳播速度。患者年齡越小，其機體內流感病毒的抗體含量就越低，且這個年齡段的機體免疫機制也還尚不完善，因此對流感病毒的抵抗力也就越低。除此以外，在學校這個人口聚集的場所，也是極易發生流行性感冒相互傳播的。

❷ 流感病毒的實驗室檢測方法有哪些

1.外周血檢測
白細胞總數一般不高或降低，淋巴細胞增高。重症病例也可以升高。若合並細菌感染，白細胞總數及中性粒細胞上升。
2.血液生化檢查
部分病例出現低鉀血症，少數病例肌酸激酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、肌酐等升高。
3.病原學相關檢查
主要包括病毒分離、病毒抗原、核酸和抗體檢測。病毒分離為實驗室檢測的主要方法；病毒的抗原和核酸檢測可以用於早期診斷；抗體檢測可以用於回顧性調查，但對病例的早期診斷意義不大。
4.影像學檢查
部分患者可表現為支氣管紋理增多的支氣管感染徵象，重症患者可出現肺部浸潤性病變或胸腔積液，甚至融合成片。

❸ 甲型H1N1流感病毒檢測流程

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根據衛生部印發《甲型H1N1流感診療方案（2009年試行版第二版）》的通知.
診斷時用病毒核酸檢測：以RT-PCR（最好採用real-time RT-PCR）法檢測呼吸道標本（咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或氣管抽取物、痰）中的甲型H1N1流感病毒核酸，結果呈陽性。就能確診。
血清甲型H1N1流感病毒核酸檢測，結果呈陽性。也能確診。

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❹ 禽流感病毒和抗體的實驗室檢測方法分別有哪些各種方法用途分別是什麼

病毒檢測方法有：
（1）病毒（雞胚、細胞）分離培養與鑒定，用途為直接分離病毒；
（2）免疫熒光法，用途為檢測組織、細胞培養物中病毒抗原；
（3）免疫酶法（包括免疫酶組織化學染色法和免疫過氧化物酶細胞單層試驗），用途為檢測組織、細胞培養物中病毒抗原；
（4）中和試驗，用已知陽性血清檢測病毒，金標准方法
（5）血凝/血凝抑制試驗，用已知陽性血清檢測病毒
（6）乳膠凝集試驗，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（7）膠體金試紙，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（8）ELISA方法，用已知陽性血清檢測病毒抗原
（9）RT-PCR（含熒光RT-PCR），用途為檢測病毒核酸
（10）NASBA，用途為檢測病毒核酸
（11）核酸探針，用途為檢測病毒核酸
（12）基因晶元，檢測病毒核酸
（13）核酸序列測定，解析病毒核酸
抗體檢測方法
（1）瓊脂擴散試驗，檢測病毒NP和M蛋白抗體
（2）血凝抑制試驗，檢測病毒HA蛋白抗體，可用於免疫效果評估
（3）神經氨酸酶抑制試驗，檢測病毒NA蛋白抗體
（4）中和試驗，用已知病毒檢測血清，金標准方法
（5）ELISA方法，用已知病毒抗原檢測特異抗體
（6）膠體金試紙，用已知病毒抗原檢測特異抗體
（7）乳膠凝集試驗，用已知病毒抗原檢測特異抗體

❺ 怎樣檢測流感病毒

流感病毒的檢測有三種方法：第一種方法，也是最快捷的一種方法，稱作「流感病毒抗原檢測」，方法是由醫生或護士採集鼻咽或口咽分泌物，用專門的試劑條檢測，半小時內出結果；第二種方法是病毒培養，將鼻咽或口咽分泌物接種到細胞株上，體外培養，通過細胞的形態變化和紅細胞凝集試驗來判斷是否有流感病毒感染；第三種方法是流感病毒核酸檢測，通過PCR方法檢測流感病毒遺傳物質。但是很可惜的是，現在這三種檢測方法都不是醫院的常規檢查項目，也就是說，病人不能像查肝功，血型一樣方便的進行流感病毒檢測。特別是流感病毒培養和核酸檢測兩種方法，因為需要特殊的設備和技術條件，在普通醫院更難以開展。
參考資料：網路知道日報，《如何分辨是感冒還是流感？》 http://..com/daily/view?id=2002

❻ 流行性感冒病毒的診斷方法

病毒感染還會誘導干擾素的表達和細胞免疫調理，造成一些自身免疫反應，包括高熱、頭痛、腓腸肌及全身肌肉疼痛等，病毒代謝的毒素樣產物以及細胞壞死釋放產物也會造成和加劇上述反應。
由於流感病毒感染會降低呼吸道粘膜上皮細胞清除和黏附異物的能力，所以大大降低了人體抵禦呼吸道感染的能力，因此流感經常會造成繼發性感染，由流感造成的繼發性肺炎是流感致死的主要死因之一。
在流行期結合臨床症狀診斷流感並不困難，但要確診或流行監測時必須進行實驗室檢查，主要包括病毒分離培養、血清學診斷和快速診斷方法。
病毒的分離與鑒定
通常採取發病3日內患者的咽洗液或咽拭子，經抗生素處理後接種於9～11日齡雞胚羊膜腔和尿囊腔中，於33℃～35℃孵育3～4天後，收集羊水和尿囊液進行血凝試驗。如血凝試驗陽性，再用已知免疫血清進行血凝抑制（hemoagglutination inhibition，HI）試驗，鑒定型別。若血凝試驗陰性，則用雞胚再盲目傳代3次，仍不能出現血凝則判斷病毒分離為陰性。也可用組織培養細胞（如人胚腎或猴腎）分離病毒，判定有無病毒增殖可用紅細胞吸附方法或熒光抗體方法。
血清學診斷
採取患者急性期（發病5天內）和恢復期（病程2～4周）雙份血清，常用HI試驗檢測抗體。如果恢復期比急性期血清抗體效價升高4倍以上，即可做出診斷。正常人血清中常含有非特異性抑制物，因此在進行HI試驗前可用胰蛋白酶等處理血清，以免影響HI試驗結果。HI試驗所用的病毒應當是與當前流行密切相關的病毒株，反應結果才能確切。補體結合試驗（compliment fixation，CF）只能檢測NP、MP的抗體。這些抗體出現早、消失快。因此，CF試驗只能作為是否新近感染的指標。
快速診斷
對患者進行快速診斷，主要是採用間接或直接免疫熒光法、ELISA法檢測病毒抗原。常取患者鼻甲粘膜印片或呼吸道脫落上皮細胞塗片，用熒光素標記的流感病毒免疫血清進行免疫熒光染色檢查抗原，或用ELISA檢查患者咽漱液中的抗原。 用單克隆抗體經免疫酶標法僅用24～72小時即可快速檢測甲、乙型流感病毒在感染細胞內的病毒顆粒或病毒相關抗原。
PCR、核酸雜交或序列分析等方法也被用於檢測流感病毒核酸或進行分型。

❼ 甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案的本方案旨

在為全國流感監測網路實驗室提供甲型H1N1流感病毒實驗室檢測技術方案，不用作商業活動或贏利目的。
一、標本的採集種類和要求
1、推薦採集的呼吸道標本種類
疾病發病後應盡快採集如下標本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔沖洗液。氣管插管的病人也應收集氣管吸取物。標本應置於無菌病毒采樣液，並立即用冰塊或冰排保存或置於4 ℃ （冰箱），並馬上送至實驗室。（臨床樣品採集人員及實驗室檢測人員的感染控制指導請見相關文件。） 采樣同時填寫疑似人感染甲型H1N1感染病例標本采樣單。（附表1）
2、拭子的選擇
標本應使用頭部為合成纖維的拭子（例如，聚酯纖維），用鋁或塑料做柄。不推薦棉拭子和木柄。標本採集管應包含3毫升病毒采樣液（含有蛋白質穩定劑，阻止細菌和真菌生長的抗生素，緩沖液）
3、臨床標本儲存要求
保存在4℃（不能超過4天）或者-70℃或-70℃以下。有條件的實驗室均應保存在-70℃或-70℃以下。不應保存在-20℃。
4、標本的分裝處理
標本送至實驗室後，立即進行處理，避免反復凍融。將原始標本分為三份，一份用於核酸檢測，一份用於病毒分離，一份保存待復核。
5、標本的運輸
疑似人感染甲型H1N1感染病例列為 A類，用UN2814包裝運輸。填寫疑似人感染甲型H1N1感染病例標本送檢單（附表2）。
二、核酸檢測
基於PCR原理的核酸檢測方法是一種快速有效的診斷方法，在突發傳染病應急工作中發揮了巨大作用。
1、基於real-time RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒（引物和探針序列為美國CDC設計）：
4月29日WHO網站上公布了美國CDC設計的針對此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探針，此實驗用於檢測疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道樣本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建議首先篩選甲型流感病毒並排除季節性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法參見附件3（中文翻譯版），附件4（英文原版）。
2、基於RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒（引物序列為國家流感中心設計）：
目前國家流感中心設計了RT-PCR方法檢測新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法參見附件5。
三、病毒分離鑒定
可採用雞胚和/或MDCK細胞進行流感病毒分離。具備相應條件的網路實驗室在收到標本後24h內進行病毒接種。具體方法參見附件6和7。
四、適用於實驗室工作人員的甲型H1N1流感病毒生物安全
（一）實驗室級別及個人防護
1、對採集自屬於感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的臨床標本進行的診斷性實驗工作，在BSL-2實驗室內進行。所有樣本操作均應在生物安全櫃（BSC）內進行。遵循生物安全三級個人防護。
2、對採集自屬於感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的臨床標本進行的病毒分離培養工作，應在BSL-3實驗室內進行，並遵循生物安全三級個人防護。
（二）健康監測
1、所有人員均應自測發熱及其他症狀。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症狀包括咳嗽、喉嚨痛、嘔吐、腹瀉、頭痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不適，應立即向上級報告。
3、如有人員在無防護情況下暴露於甲型H1N1流感確診病例的臨床標本或活病毒，應考慮在暴露後的7天時間里使用奧司他韋或扎那米韋進行抗病毒葯物預防。
五、附表和附件
附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例標本采樣單
附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例標本送檢單
附件3： real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程(2009版)（中文）
附件4： real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程(2009版)（英文）
附件5： RT-PCR方法檢測甲型流感病毒
附件6：甲型H1N1流感病毒雞胚分離方法
附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK細胞分離方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本采樣單 姓名 性別 年齡 職業※ 現住址 發病日期 標本#
種類 標本量
（g或ml） 採集
日期 備注 ※選項：參照傳染病報告卡。
#選項：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔沖洗液、D鼻腔吸取物、E氣管吸取物、F其他（如為其他，請在表格中註明）
採集人員： 採集單位（蓋章）：
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例標本送檢單 姓名 性別 年齡 職業※ 現住址 發病日期 標本#
種類 標本量*
（g或ml） 採集
日期 備注 ※選項：參照傳染病報告卡
#選項：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔沖洗液、D鼻腔吸取物、E氣管吸取物、F其他（如為其他，請在表格中註明）
*標本量：如果同一份標本有多個包裝請註明。
填表人員： 送樣時間： 單位（蓋章）：
附件3
real-time RT-PCR方法檢測甲型H1N1流感操作規程
中文翻譯版（請同時參考英文原版）
請注意：體系建立請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。本規程中的體系僅供參考。
美國CDC實時RTPCR(rRTPCR)檢測豬流感操作規程(2009版)
本規程所有權歸屬疾病控制中心，緊急狀態時授權各公共衛生實驗室使用。本規程不用作商業活動或贏利目的。
一、概 述
（一）前提
本規程基於對rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）實驗原理
實時熒光定量RTPCR(rRTPCR)法檢測豬流感的方案是用一組寡核苷酸引物和雙重標記的TaqMan®探針，對呼吸道樣本或體外培養的豬流感病毒進行定性檢測鑒定。InfA引物和探針為檢測出甲型流感病毒而設計，swInfA引物和探針可特異性地檢測出所有的豬甲型流感病毒，swH1引物和探針可特異性檢測豬流感病毒H1亞型。本實驗用於檢測甲型流感陽性的疑似豬甲型流感感染病例的呼吸道樣本。
（三）使用條件
一步法定量RT-PCR 96孔板熱循環系統。
（四）生物安全要求
樣本處理應在相應的生物安全實驗室完成。
（五）樣本要求
1、呼吸道樣本
支氣管肺泡灌洗液，氣管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子樣本所用的拭子頂端應為人造材質（如聚脂或滌綸）、柄為鋁制或塑料。不推薦使用棉頭木柄的拭子。藻酸鈣拭子采樣不可取。
2、排除標准
1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的樣本
2）以上未列的其它不當樣本
（六）核酸提取
RT-PCR擴增效能依賴於樣本模板RNA的質與量。RNA提取操作需經過檢驗核酸的純度合格之後，再用於樣本實驗。商業化的操作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取試劑盒，RNeasy®小試劑盒 (QIAGEN公司)，羅氏MagNA Pure Compact RNA分離試劑盒, MagNA Pure LC RNA分離試劑盒II, 和羅氏MagNA總核酸純化試劑盒，在推薦的操作程序下，可提取高純度的RNA。
（七）免責聲明：提到的廠家名僅用作舉例，並不表示疾控中心認可。
二、實驗材料
（一）試劑
1、一步法熒光定量RT-PCR探針試劑盒；
2、分子級無菌蒸餾水 (無RNA酶和DNA酶)；
3、正反向引物 (40μM)；
4、雙重標記探針(10μM)；
5、陽性對照。
（二）供給
1、實驗室標記筆；
2、微量離心管格柵，96孔0.2ml PCR反應管；
3、20μl 和 200μl 可調節移液器及濾芯槍頭；
4、0.2ml PCR 反應管盤；
5、光學反應蓋板；
6、無菌,無核酸酶的1.5 ml微量離心管；
7、一次性無粉手套。
（三）儀器設備
1. 微量離心機；
2. 漩渦振盪器；
3. 實時熒光定量PCR檢測系統，含96孔的熱循環反應板。
三、操作程序
（一）准備工作
1. 避免樣品污染
由於fluorogenic 5』核酸酶測定的敏感性，應特別注意假陽性產生。推薦以下預防污染的方法：
1）實驗准備與核酸提取使用獨立區域；
2）實驗准備與核酸提取使用專用設備（如移液器，微量離心機）和耗材（如微量離心管，吸頭）；
3）實驗開始後穿清潔工作服，並使用新的一次性無粉手套；
4）不同樣本操作之間，以及懷疑可能污染的情況下均更換手套；
5）試劑和反應管的蓋子應盡量關閉。
2、儀器准備
工作台、移液管、離心機必須清潔，用去污劑凈化，例如5%的漂白劑、「DNAzap」或者「RNase AWAY®」來減小核酸交叉污染的風險。
3、試劑准備
注意：在試驗過程中，保持所有的試劑在冰架上保持低溫。
1）引物和探針
（1）分裝好的冰凍的引物和探針進行融化（已融的探針避光2-8℃可保存多達3個月，不要對探針反復凍融）；
（2）渦旋振盪引物和探針；
（3）瞬時離心引物和探針，之後置於冰架上。
2）Real time RT-PCR的試劑
（1）將Master Mix和酶置於冰架上；
（2）融化2×的Reaction Mix；
（3）顛倒混合2×的Reaction Mix；
（4）瞬時離心2×的Reaction Mix和酶，置於冰架上。
4、對RT-PCR的每一步過程均進行檢測
1）每個樣品的RNA提取物通過分別的引物和探針進行檢測：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探針是以人的RNaseP基因為靶基因的，因此對於人的核酸可以作為內部陽性對照。
2）對於每一個過程中包括的所有引物和探針，均設立無模板對照（NTC）和陽性模板對照（PTC）。
3）人類樣本對照（HSC）提供了次級陰性對照，以便確認核酸提取過程和試劑的完整性。
5、建立反應
反應檢測混合物充分混合後加入到96孔板中。然後在適當的實驗反應和對照中，加入水和提取的核酸或者陽性模板對照（PTC）。
1）為每一個引物和探針標記一個1.5ml的微量離心管；
2）對每一個建立的反應確定反應數（N）。考慮到NTC、PTC、HSC反應和吸量誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
3）Master Mix:計算加到每個引物/探針反應混合物中的各個試劑的量。計算如下：
* 體系建立請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。
4）加入水之後，通過上下吹打混勻反應混合物，不要渦旋振盪。
5）離心5s使混合物聚集管底，然後將管子置於冰架上；
6）准備板狀的反應管子或者96孔板，置於冰架上；
7）每一個master mix吸取20μl到每一孔中，每排按順序進行，如下圖：
實驗建立舉例：
實驗樣本舉例：
注意：在任何樣本被加入之前，應該首先加入陰性模板對照（NTC）（第1列），用來檢驗master mix中的污染。HSC應該在待測樣本之後加入（第11列），用來檢驗在樣本准備或者加入過程中的交叉污染。陽性模板對照（PTC）應該在所有樣品和陰性模板對照（NTC）之後被加入。
8）在將培養板移到核酸處理區域之前，在試驗設定區域，在反應板的第一列將NTC反應進行。如上所述。
9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，將NTC孔蓋上。
10）將反應板蓋上，移到核酸處理區域。
11）將含有樣品的管子渦旋振盪5s，瞬時離心5s；
12）將提取的核酸樣本置於冰架上；
13）如上所述，樣品應該按列加入，吸取5μl的第一種樣本到所有標記這種樣品的孔中（例如，樣本「S1」如上表格所示）。不同樣本之間需更換槍頭操作。
14）加完樣本的孔要蓋住，這將會幫助防止樣品的交叉污染，並且能夠使操作人員記錄其加樣的具體進程；
15）為了避免交叉污染，必要時更換手套；
16）對剩下的樣本，重復步驟13-15；
17）加入5μl的HSC樣品加到HSC孔中（第11列）。將HSC孔蓋蓋。
18）最後，加5μl陽性模板對照RNA到所有PTC孔中，將PTC孔蓋上。
19）如果使用8個管子的條狀板子，每一條都要做標簽標記，來指明每一個樣品的位置（不要在反應管子的頂部標記！）。瞬時離心條狀管子10－15s，然後置於冰架上。如果使用培養板，4℃，500g離心30s，置於冰架上。
6、RT-PCR擴增條件
反應體系為25ul，反應條件如下：
註：在55度這一步驟中要收集熒光信號（FAM）。
* 具體擴增條件請參照所使用試劑盒供應商所提供的使用說明。
7、解釋說明/檢驗
1）探針/引物的陰性對照反應中得到的熒光增長曲線不應該超過閾值線。如果一個或者多個引物和探針的陰性反應出現了假陽性，則樣品可能已經被污染。那麼整個實驗過程是無效的，嚴格的按照步驟規則重新實驗。
2）在37個循環處或者37個循環之前，所有的臨床樣本的RP反應曲線都應該超過閾值線，這表明從人類RNase P基因擴增到足夠量的RNA，也表明了樣本質量合格。然而，可能有些樣本會由於初始臨床樣本中的細胞數量較少而無法出現陽性結果。同時，從動物/禽類體內或者經細胞培養得到的樣本，經常會RP反應沒有結果或者結果很弱。如果在所有臨床樣本中檢測RNase P都陰性，則說明：
（1）從臨床材料中對核酸的不適當的提取導致RNA的損失或者來自臨床標本的RT-PCR抑制劑的殘留污染；
（2）沒有足夠的人類細胞以備檢測；
（3）方法建立和實施不當；
（4）試劑和儀器原因。
3）在40個循環之內，HSC組中InfA，swFluA，swH1探針的熒光增長曲線不應該超過閾值線。如果任何其中任何一個流感特異性探針的增長曲線超過了閾值線，那麼有以下解釋：
（1）可能由於RNA提取試劑污染。在實驗前確保RNA提取試劑無誤。
（2）RNA提取過程或建立反應加樣過程發生交叉污染。嚴格遵照操作程序的要求進行重復實驗。
（3）在40個循環之前，PTC反應的InfA, swInfA, swH1和RP反應應出現陽性結果。如果沒產生預期的陽性結果則視為無效，應嚴格遵照操作程序進行重復實驗。確定PTC反應失敗原因，訂正並記錄錯誤原因及更改方案。不再使用沒產生預期結果的PTC試劑。
（4）當所有對照都滿足要求後，如果InfA反應增長曲線與閥值線在40個循環內有交叉時，則樣本被視為A型流感病毒陽性。如果A型流感病毒反應呈陽性，那麼Univ SW 和/或 SW H1也可能呈陽性。如果樣本InfA和特異亞型反應（swInfA和swH1）的反正增長曲線與閾值線在40個循環內有交叉，則視該樣本為豬流感病毒A/H1陽性。如果樣本只有InfA和一個亞型的反應陽性或只有InfA陽性，請聯系CDC做進一步指導。
（5）在所有對照都滿足要求的前提下，如果在40個循環內，待測樣本的所有InfA反應陰性則視該樣本為陰性。
8、限制規定
1）實驗員在實際操作之前應進行操作程序和試驗結果分析的培訓，熟練掌握後方可進行試驗。
2）當樣本量不足可能會產生假陰性結果，造成的原因可能是不當的收集，運輸或處理。
3）如果反應中存在過量的DNA / RNA模板時也可能出現假陰性。如果某樣本的RP反應被抑制，則可以將提取的RNA進行2倍或更大倍數的稀釋（例如1：10或1：100）來重復試驗。
9、備注
引物和探針參見英文版P7。
附件4
real-time RT-PCR方法檢測鑒定甲型H1N1流感操作規程
（英文版）
附件5
基於RT-PCR的方法檢測新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
對採集的可疑病例標本進行檢測，篩選甲型H1N1流感病毒並排除季節性H1N1流感病毒。
二、引物 NIC引物 引物名稱 鹼基組成 目的片段大小 備注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用檢測引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亞型檢測通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季節性流感病毒H1N1亞型檢測引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亞型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 約80bp 與real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及儀器
1、 RNA 提取試劑盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）
2、β－巰基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）
5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）
6、檢測引物
7、Axygen 1.5mL離心管，貨號：MCT-150-C
8、Axygen 0.2mL PCR管，貨號：PCR-02-C
9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL帶濾芯槍頭
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加樣器
11、可調轉速14K離心機：
12、旋渦混合器：
13、生物安全櫃：二級生物安全櫃
14、PCR儀：
15、瓊脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No. 101685
16、核酸染料：
17、電泳液：5×TBE電泳緩沖液 cat No. 9009032718．電泳槽、電泳儀
四、實驗步驟
（一）RNA提取
1、根據標本數量分裝RLT液：從Kit中取出RLT液，用1.5mL離心管分裝，每管500μL（在體系配製區操作）。
2、在生物安全櫃內將采樣液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培養物（雞胚尿囊液或細胞培養液）取100μL加入RLT液管中，充分混勻。
3、每管分別加入5μL β-巰基乙醇，混勻後依次加入600μL 70%的乙醇，充分混勻。
4、從Kit中取出帶濾柱的2mL收集管，打開包裝將其做好標記。取步驟（3）中的混合液600μL加入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄收集管中的離心液。
5、濾柱仍放回收集管上，將步驟（3）剩餘的混合液全部吸入濾柱中，12000rpm，離心15s，棄離心液。
6、於濾柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，離心15s。
7、從QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支幹凈的2mL收集管，將離心後的濾柱移到新的收集管上，於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，離心15s。
8、棄收集管中的離心液，再於濾柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，離心2min。
9、將濾柱移到一個干凈的1.5mL eppendorf管上，向濾柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室溫靜置1~3min。
10、12000rpm，離心1min，收集離心液即為提取的病毒RNA，立即做實驗或-20℃以下保存。
注意：Buffer RPE使用之間加44mL無水乙醇。
（二）反應體系配製
1、實驗設計：
檢測標本RNA
質控參數：
陰性對照：無菌水（標本RNA提取時，跟標本同時提取無菌水。）
陽性對照：已知病毒RNA
2、PCR反應體系配製（在體系配製區配反應液）
1）按下表加入試劑：
PCR反應體系 組 分 體 積（μL） RNase Free Water
5×RT-PCR Buffer 11.9×n
5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 0.1×n 上游引物 0.5×n 下游引物 0.5×n Total 20×n 對每一個建立的反應確定反應數（n=擬進行的PCR管數，包括陰性，陽性對）。考慮到陰性無模板對照，陽性對照，誤差，制備過量的反應混合物是必要的。具體如下：
（1）如果包括對照，樣品的數量（n）為1到14，那麼N=n+1；
（2）如果包括對照，樣品的數量（n）大於15，那麼N=n+2。
2）將上述反應液混勻，分裝到0.2mL PCR小管中，每管20μL，分別做好標記。
3）加RNA模板（在核酸提取區）
將上述分裝好的PCR小管分別加入模板。首先加入陰性對照管（5μL無菌水），然後分別加標本RNA（每管5μL），最後加入陽性對照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反應
將上述加好模板的反應管混勻，短暫離心後放入PCR儀進行RT-PCR
擴增，反應程序如下： 溫度 (C) 時間 循環數 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR產物檢測
1）2.0%瓊脂糖凝膠制備：稱取2.0g Agarose，倒入耐熱玻璃瓶內，再加入電泳液（1×TBE）100mL，輕輕混勻後加熱，使Agarose完全熔化。待Agarose膠溫度降至50～60℃左右，加入核酸染料，輕輕混勻（不要產生氣泡）。待膠溫度降至50℃左右時，將其倒入制膠板，插好電泳梳子。待膠完全凝固（約30～60min）之後，將梳子拔出。
2）將制備好的電泳膠放入電泳槽（帶梳子孔的一端在陰極），倒入電泳液（1×TBE）浸過膠面即可。
3）PCR產物各取10μL，加入2μL上樣緩沖液（6×Loading Buffer），混勻後加入電泳膠孔內（先加Marker（DL－2000）5μL，然後依次加標本PCR產物，再加陰性對照，最後加陽性對照產物）。
4）電泳電壓100V，約30～40min後看結果。
5）將電泳膠放入凝膠成像系統觀察結果並照相。
5、結果判斷
在系統成立，即陰陽性參考均正常的條件下，各引物所代表意義如下： PCR引物 待檢樣品1 待檢樣品2 待檢樣品3 待檢樣品4 待檢樣品5 待檢樣品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 結果判斷 非甲型流感病毒 甲型流感病毒
非H1N1亞型 人季節性H1N1亞型流感病毒 豬H1N1亞型流感病毒
送國家流感中心復核 送國家流感中心檢測 標本不是人源標本/標本中細胞量少/實驗或儀器問題

❽ 高致病性禽流感診斷方法和程序是什麼

（1）流行病學

禽流感病毒的宿主廣泛，雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉和雉雞等家禽及野鳥、水禽、海鳥等均可感染。其中以雞和火雞感染禽流感病毒後的危害最為嚴重，而在鴨中分離到的病毒比其他禽類多。各種日齡的禽均可感染。

禽流感病毒主要通過與患禽（包括與患禽接觸的器具）的直接接觸和間接接觸傳染。此外，帶毒的飛鳥或水禽常常成為傳染源，引起家禽大批發病和死亡。

（2）臨床症狀

禽流感的潛伏期從幾小時到3天不等，潛伏期的長短依賴於感染病毒的毒力和劑量、感染途徑、被感染禽的種別和禽體的狀態。急性感染的禽流感無特定臨床症狀，在短時間內可見食慾廢絕，體溫驟升，呼吸道症狀，下痢，後期出現神經症狀。伴隨大量死亡。

（3）病理變化

禽流感的病理變化因感染毒株毒力的強弱、病程長短和禽種的不同而變化不一。主要表現為頭腫，肉髯、冠出血，小腿和趾部皮下出血，腺胃乳頭出血及輸卵管炎等。

（4）病原學診斷

病毒分離需由國家規定的實驗室完成。

（5）血清學診斷

目前用於禽流感檢測的方法有禽流感病毒分離技術、瓊脂擴散（AGP）試驗、血凝試驗、血凝抑制（HI）試驗、神經氨酸酶抑制（NI）試驗、酶聯免疫吸附試驗（ELISA）、病毒中和試驗（SN）、反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、免疫熒光技術（IF）及核酸探針技術。其中血凝試驗、血凝抑制試驗和瓊脂擴散試驗是OIE推薦使用的方法。

禽流感病毒血凝素分型抗原和標准分型血清均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所提供，按說明書操作。

❾ 流行性感冒要點

  最近流感爆發，疾控又開始緊張，開始各種培訓，提高大家意識，也算是記錄培訓筆記了。

流行性感冒

      (以下簡稱流感)是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病,在世界范圍內引起暴發和流行。流感起病急,雖然大多為自限性,但部分因出現肺炎等並發症可發展至重症流感,少數重症病例病情進展快,可因急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)和/或多臟器衰竭而死亡。重症流感主要發生在老年人、年幼兒童、孕產婦或有慢性基礎疾病者等高危人群,亦可發生在一般人群。

      2017年入冬以來,我國南北方省份流感活動水平上升較快,當前處於冬季流感流行高峰水平。全國流感監測結果顯示,流感樣病例就診百分比和流感病毒檢測陽性率均顯著高於過去三年同期水平,流感活動水平仍呈現上升態勢,本次冬季流感活動強度要強於往年。

      為進一步規范和加強流感的臨床管理,減少重症流感發生、降低病死率,在《甲型H1N1流感診療方案(2009年第三版)》和《流行性感冒診斷與治療指南(2011年版)》的基礎上,結合近期國內外研究成果及我國既往流感診療經驗,制定本診療方案。

1、病原學

    流感病毒屬於正粘病毒科,為RNA病毒。根據核蛋白和基質蛋白分為甲、乙、丙、丁四型。

    目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亞型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系。

    流感病毒對乙醇、碘伏、碘酊等常用消毒劑敏感;對紫外線和熱敏感,56℃條件下30分鍾可滅活。

2、流行病學

(一)傳染源

    流感患者和隱性感染者是流感的主要傳染源。從潛伏期末到急性期都有傳染性。受感染動物也可成為傳染源,人感染來源動物的流感病例在近距離密切接觸可發生有限傳播。

    病毒在人呼吸道分泌物中一般持續排毒3-6天,嬰幼兒、免疫功能受損患者排毒時間可超過1周,人感染H5N1/H7N9病例排毒可達1~ 3周。

(二)傳播途徑

    流感主要通過打噴嚏和咳嗽等飛沫傳播,也可經口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸傳播。接觸被病毒污染的物品也可引起感染。人感染禽流感主要是通過直接接觸受感染的動物或受污染的環境而獲得。

(三)易感人群

    人群普遍易感。接種流感疫苗可有效預防相應亞型的流感病毒感染。

(四)重症病例的高危人群

    下列人群感染流感病毒,較易發展為重症病例,應給予高度重視,盡早(發病48小時內)給予抗病毒葯物治療,進行流感病毒核酸檢測及其他必要檢查。

1.年齡<5歲的兒童(年齡<2歲更易發生嚴重並發症);

2.年齡≥65歲的老年人;

3.伴有以下疾病或狀況者:慢性呼吸系統疾病、心血管系統疾病(高血壓除外)、腎病、肝病、血液系統疾病、神經系統及神經肌肉疾病、代謝及內分泌系統疾病、免疫功能抑制(包括應用免疫抑制劑或HIV感染等致免疫功能低下);

4.肥胖者[體重指數(body mass index,BMI)大於30,BMI=體重(kg)/身高 (m) 2];

5.妊娠期婦女。

3、發病機制及病理

(一)發病機制

    甲、乙型流感病毒通過HA結合呼吸道上皮細胞含有唾液酸受體的細胞表面啟動感染。流感病毒通過細胞內吞作用進入細胞,病毒基因組在細胞核內進行轉錄和復制。復制出大量新的子代病毒顆粒。流感病毒感染人體後,可以誘發細胞因子風暴,導致全身炎症反應,出現ARDS、休克及多臟器功能衰竭。

(二)病理改變

    病理變化主要表現為呼吸道纖毛上皮細胞呈簇狀脫落、上皮細胞化生、固有層粘膜細胞充血、水腫伴單核細胞浸潤等病理變化。重症肺炎可發生彌漫性肺泡損害。合並腦病時出現腦組織彌漫性充血、水腫、壞死。合並心臟損害時出現心肌細胞腫脹、間質出血,淋巴細胞浸潤、壞死等炎症反應。

4、臨床表現和實驗室檢查

  潛伏期一般為1-7天,多為2-4天。

(一)臨床表現

    主要表現為發熱、頭痛、肌痛和全身不適起病,體溫可達39-40℃,可有畏寒、寒戰,多伴全身肌肉關節酸痛、乏力、食慾減退等全身症狀,常有咽喉痛、乾咳,可有鼻塞、流涕、胸骨後不適等。顏面潮紅,眼結膜充血。部分以嘔吐、腹痛、腹瀉為特點,常見於感染乙型流感的兒童。

    無並發症者病程呈自限性,多於發病3-4天後體溫逐漸消退,全身症狀好轉,但咳嗽、體力恢復常需1-2周。

(二)並發症

    肺炎是流感最常見的並發症,其他並發症有神經系統損傷、心臟損害、肌炎、橫紋肌溶解綜合征和膿毒性休克等。

(三)實驗室檢查

1.外周血常規:白細胞總數一般不高或降低,重症病例淋巴細胞計數明顯降低。

2.血生化:部分病例出現低鉀血症,少數病例肌酸激酶、天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、肌酐等升高。

3.病原學相關檢查:

(1)病毒核酸檢測:以RT-PCR(最好採用real-time RT-PCR)法檢測呼吸道標本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰)中的流感病毒核酸。病毒核酸檢測的特異性和敏感性最好,且能區分病毒類型和亞型。(2)病毒抗原檢測(快速診斷試劑檢測):快速抗原檢測方法可採用膠體金和免疫熒光法。由於快速抗原檢測的敏感性低於核酸檢測,因此對快速抗原檢測結果的解釋應結合患者流行病史和臨床症狀綜 合考慮。

(3)血清學檢測:檢測流感病毒特異性IgM和IgG抗體水平。動態檢測的IgG抗體水平恢復期比急性期有4倍或以上升高有回顧性診斷意義。

(4)病毒分離培養:從呼吸道標本中分離出流感病毒。在流感流行季節,流感樣病例快速抗原診斷和免疫熒光法檢測陰性的患者建議也作病毒分離。

(四)影像學表現並發肺炎者影像學檢查可見肺內斑片狀、磨玻璃影、多葉段滲出性病灶;進展迅速者,可發展為雙肺彌漫的滲出性病變或實變,個別病例可見胸腔積液。

兒童病例肺內片狀影出現較早,多發及散在分布多見,易出現過度充氣,影像學表現變化快,病情進展時病灶擴大融合,可出現氣胸、縱隔氣腫等徵象。

5、診斷

診斷主要結合流行病學史、臨床表現和病原學檢查。

(一)臨床診斷病例

出現上述流感臨床表現,有流行病學證據或流感快速抗原檢測陽性,且排除其他引起流感樣症狀的疾病。

(二)確定診斷病例

有上述流感臨床表現,具有以下一種或以上病原學檢測結果陽性:

1.流感病毒核酸檢測陽性(可採用real-time RT-PCR和RT-PCR 方法)。

2.流感病毒分離培養陽性。

3.急性期和恢復期雙份血清的流感病毒特異性IgG抗體水平呈4倍或4倍以上升高。

6、重症與危重病例

(一)出現以下情況之一者為重症病例

1.持續高熱>3天,伴有劇烈咳嗽,咳膿痰、血痰,或胸痛;

2.呼吸頻率快,呼吸困難,口唇紫紺;3.神志改變:反應遲鈍、嗜睡、躁動、驚厥等;

4.嚴重嘔吐、腹瀉,出現脫水表現;

5.合並肺炎;

6.原有基礎疾病明顯加重。

(二)出現以下情況之一者為危重病例

1.呼吸衰竭;

2.急性壞死性腦病;

3.膿毒性休克;

4.多臟器功能不全;

5.出現其他需進行監護治療的嚴重臨床情況。

7、鑒別診斷

(一)普通感冒

流感的全身症狀比普通感冒重;追蹤流行病學史有助於鑒別;普 通感冒的流感病原學檢測陰性,或可找到相應的感染病原證據。

(二)其他類型上呼吸道感染

包括急性咽炎、扁桃體炎、鼻炎和鼻竇炎。感染與症狀主要限於相應部位。局部分泌物流感病原學檢查陰性。

(三)其他下呼吸道感染

流感有咳嗽症狀或合並氣管-支氣管炎時需與急性氣管-支氣管炎相鑒別;合並肺炎時需要與其他肺炎,包括細菌性肺炎、衣原體肺炎、支原體肺炎、病毒性肺炎、真菌性肺炎、肺結核等相鑒別。根據臨床特徵可作出初步判斷,病原學檢查可資確診。

8、治療

(一)基本原則

1.對臨床診斷病例和確診病例應盡早隔離治療。

2.住院治療標准(滿足下列標准1條或1條以上):

(1)妊娠中晚期婦女。

(2)基礎疾病明顯加重,如:慢性阻塞性肺疾病、糖尿病、慢性心功能不全、慢性腎功能不全、肝硬化等。

(3)符合重症或危重流感診斷標准。

(4)伴有器官功能障礙。

3.非住院患者居家隔離,保持房間通風。充分休息,多飲水,飲食應當易於消化和富有營養。密切觀察病情變化,尤其是兒童和老年患者。

4.流感病毒感染高危人群容易引發重症流感,盡早抗病毒治療可 減輕流感症狀,縮短流感病程,降低重症流感的病死率。

5.避免盲目或不恰當使用抗菌葯物。僅在流感繼發細菌性肺炎、中耳炎和鼻竇炎等時才有使用抗生素的指征。

6.兒童忌用阿司匹林或含阿司匹林葯物以及其他水楊酸制劑。

(二)對症治療

高熱者可進行物理降溫,或應用解熱葯物。咳嗽咳痰嚴重者給予止咳祛痰葯物。根據缺氧程度可採用鼻導管、開放面罩及儲氧面罩進行氧療。

(三)抗病毒治療

抗流感病毒治療時機

發病48h內進行抗病毒治療可減少流感並發症、降低住院患者的病死率、縮短住院時間,發病時間超過48h的重症患者依然能從抗病毒治療中獲益。

重症流感高危人群及重症患者,應盡早(發病48h內)給予抗流感病毒治療,不必等待病毒檢測結果;如果發病時間超過48h,症狀無改善或呈惡化傾向時也應進行抗流感病毒治療。無重症流感高危因素的患者,發病時間不足48h,為縮短病程、減少並發症也可以抗病毒治療。

2.抗流感病毒葯物

神經氨酸酶抑制劑(NAI)對甲型、乙型流感均有效。

(1)奧司他韋:成人劑量每次75mg,每日2次,療程5天,重症病例劑量可加倍,療程可延長。腎功能不全者要根據腎功能調整劑 量。1歲及以上年齡的兒童應根據體重給葯:體重不足15Kg者,予30mg每日2次;體重15~23Kg者,予45mg每日2次;體重23~40Kg 者,予60mg每日2次;體重大於40Kg者,予75mg每日2次。對於吞咽膠囊有困難的兒童,可選用奧司他韋顆粒劑。對用葯過程中無效或病情加重的患者,要注意是否出現耐葯。

(2)扎那米韋:適用於於成人及7歲以上青少年,用法:每日2次,間隔12小時;每次10mg(分兩次吸入)。但吸入劑不建議用於重症或有並發症的患者。

(3)帕拉米韋:成人用量為300~600mg,小於30d新生兒6mg/kg, 31-90d嬰兒8mg/kg,91d-17歲兒童10mg/kg,靜脈滴注,每日1次, 1~5天,重症病例療程可適當延長。目前臨床應用數據有限,應嚴密觀察不良反應。

離子通道M2阻滯劑金剛烷胺和金剛乙胺僅對甲型流感病毒有效,但目前監測資料顯示甲型流感病毒對其耐葯,不建議使用。

(四)重症病例的治療

治療原則:積極治療原發病,防治並發症,並進行有效的器官功能支持。

1.如出現低氧血症或呼吸衰竭,應及時給予相應的治療措施,包括氧療或機械通氣等。

2.合並休克時給予相應抗休克治療。

3.出現其他臟器功能損害時,給予相應支持治療。

4.出現繼發感染時,給予相應抗感染治療。