生物多樣性檢測的設備和方法

1. 如何用環境DNA來有效和准確地測量生物多樣性

2018年7月29日報道，近日，《通訊-生物學》發表的一項研究Acidity promotes degradation of multi-species environmental DNA in lotic mesocosms描述了環境DNA （eDNA） 在自然環境里的持久性和影響其持久性的因素。

班戈大學的Simon Creer及同事使用了四個高地流水的、有酸鹼梯度的圍隔生態系統，來測量各種環境DNA在不同的時間和空間里的降解程度。他們發現，eDNA的持久性只有2天， 而且酸性環境會加速它的降解。

綜上所述，他們的實驗結果為研究影響流水裡的環境DNA到因素提供了一個預計的時空框架， 為有效和准確地用eDNA 來實時測量生物多樣性做出了貢獻。

2. 廢水中微生物多樣性的檢測有幾種方法

solemon23(站內聯系TA)有沒有水處理的高手，只想得到水中微生物多樣性程度，比如某水體中微生物多樣性達到中度多樣性。 現在分子生物學手段比較盛行，PCR，克隆，DGGE等。凡龍(站內聯系TA)沒有簡單方法，只有專業方法，PCR嘍bill2064(站內聯系TA)可以嘗試biolog 但它只針對好氧微生物echo1234(站內聯系TA)PCR-DGGE吧 大概可以看出多樣性程度 成本相對不高cz200717(站內聯系TA)一般的生態分析方法的話，DGGE和RFLP應該都可以。稍微先進點的話就做一下RT-PCR……

3. 微生物檢測實驗室裝備有哪些

微生物實驗室主要負責各種微生物項目的檢測，主要檢測項目有菌落總數、菌落類型、致病球菌等等。微生物實驗室根據不同的分級，有著不同的安全要求和使用要求，因此微生物實驗室不同於一般的實驗室（凈化）工程的建設理念。

微生物檢測實驗室的建設基礎要求是牆壁表面必須光滑防水耐腐蝕，地面無滲漏，光潔但不滑，儀器和設備的陳設簡潔，方便打掃、便於消毒清潔，讓實驗環境盡量保持(潔凈)無菌狀態。微生物檢測實驗室的基本傢具包括：實驗台、超凈工作台、生物安全櫃等。
為了方便打掃和清潔，建議選擇隔離式中央實驗台，具備功能區干濕隔離模塊，可以防潮抗腐，干濕區域分離，實驗更安全。較好的隔離式中央實驗台還應配備全工位水電氣供給功能，靈活配合實驗需求；為了方便存取試劑，還可以充分利用空間設計立體試劑存儲空間。

另外，為給微生物檢測實驗提供更好的實驗環境，且要保證實驗結果的准確性，實驗室對環境的潔凈要求極高，為了保證實驗環境的無菌和安全，必須要選擇不銹鋼材質的超凈工作台和生物安全櫃。

4. 生物實驗室必備設備有哪些

1、樣品保存:
冰箱/超低溫冰箱(荷蘭SKADI)
液氮罐(英國STATEBOURNE CRYOGENICS)

2、樣品前處理:
移液器(gilson,ependof,biocos)
天平(梅特勒，賽多利斯)
均質/攪拌系列(IKA,KINEMATICA,LABSCAN)
離心機(sigma,日立，ebendof,hettich,beckman)
凍干機(荷蘭SKADI)
高壓滅菌器(MMM,SANYO,STURDY)
電泳儀(bio-rad,epondorf)

3、培養過程
培養箱系列(美國SI)
生物安全櫃/超凈工作台(telstar,baker,thermo)
發酵罐(infors，labconco)
搖床(IKA,INFORS,LAB-LINE)
水浴(LABSCAN,JULABO)
轉瓶機(WHEATON,IBS)
PCR(thermo，epondorf,ABI,BIO-RAD,MJ)
酶標儀(Awareness，epondorf,ABI)

4、觀察分析
顯微鏡(Hund,olympus，leica，nikon)
菌落計數儀(INTERSCIENCE)
流式細胞儀(bd,日立)
DNA測序儀(ABI)
高效色譜系列(agilent,whatman,abi,dionex,mathon)

5、其它
洗瓶機(labconco，miele)
超純水系列(MILLIPORE,ELGA,PALL)
超聲波清洗(英國Prima)

微生物實驗室主要用於無菌環境下微生物提純、分離、增殖及鑒定等工作，對無菌環境的要求很高。那麼微生物實驗室中需要用到哪些儀器設備呢？

一、無菌室

無菌室是實驗室的核心部分，主要為樣品提供保護，保證實驗結果的准確和人員的安全。

二、超凈工作台

微生物的培養都是在特定培養基中進行無菌培養，那麼無菌培養必然需要超凈工作台提供一個無菌的工作環境。超凈工作台的主要用途是微生物的接種及處理時的無菌操作。

六、微波爐/電爐

其主要作用是用於溶液的快速加熱，微生物固體培養基的加熱溶化等。

七、搖床

搖床又稱搖瓶機，它是培養好氣性微生物的小型試驗設備或作為種子擴大培養之用。

八、冰箱

冰箱是實驗室中保存試劑和樣品必不可少的儀器。微生物學實驗中用到的試劑有些要求是4度保存，有些要求是負20度保存，實驗人員一定要看清試劑的保存條件，放置在恰當的溫度下保存。

九、顯微鏡

微生物個體微小，必須藉助顯微鏡才能觀察清楚它們的個體形態和細胞結構。因此，在微生物學的各項研究中，顯微鏡就成為不可缺少的工具。

十、生物安全櫃

微生物實驗中所涉及到的部分試劑和樣品微生物有些是有毒的，對於操作人員來說傷害比較大。為了防止有害德懸浮微粒、氣溶膠的擴散，可以利用生物安全櫃對操作人員、樣品及樣品間交叉感染和環境提供安全的保護作用。

微生物實驗室用到的儀器設備都有哪些

A2生物安全櫃

十一、菌落計數器

菌落計數儀可幫助操作者計數菌落數量。通過放大，拍照，計數等方式來准確的獲取菌落的數量。有些高性能的菌落計數器還可直接連接電腦來完成自動計數的操作，方便快捷的計數。

十二、分光光度計

分光光度計在微生物試驗中用於測定微生物懸液的濃度，可以正確選取合適的培養時間。

十三、離心機

離心機是用於收集微生物菌體以及其他沉澱物。有冷凍離心機和常溫離心機之分。

十四、液氮罐

液氮罐里裝有液氮，可用於微生物實驗室中各菌種的長期保存。

5. 生物多樣性監測方法有哪些

檢測遺傳多樣性的方法隨生物學尤其是遺傳學和分子生物學的發展而不斷提高和完善。 從形態學水平、細胞學（染色體）水平、生理生化水平、逐漸發展到分子水平。然而不管研究是在什麼層次上進行，其宗旨都在於揭示遺傳物質的變異。

6. 細菌16S微生物多樣性研究實驗方法及關鍵點

1. 樣品元基因組提取

1.1 樣品元基因組抽提核心思想：

盡可能多的獲得樣本中各種微生物的基因組DNA。

1.2 樣本元基因組提取的重要性：

最大程度獲得樣本中各種微生物的基因組DNA，為後續樣本的分析和比較提供完整的微生物種類及豐度信息。否則，分析環節「形同虛設」，永遠分析不出真實結果。

1.3 對樣品的一些思考：

a）樣本收集的難易程度；

b）樣本的珍貴程度；

c）怎樣用盡可能少的單個樣本使用量來幫助客戶完成研究目的；

d）怎樣在實驗開始前就確保客戶結果的准確性；

e）復雜環境中的樣本基因組如何能夠更全面的獲取。

1.4 元基因組提取的主要原理（核心步驟）：

①通過高溫化學裂解法和物理擊打法充分裂解細胞； 

②離心法除去雜質、抑制物等；去除破碎細胞中的蛋白質；

③純化DNA； 

④消化RNA。

1.5 元基因組提取的主要流程：

1）樣品准備：

樣本-80℃保存；

避免樣本出現反復凍融，影響樣本中微生物組成，樣本均在冰盒或乾冰上完成拿取和轉移。

2）化學裂解+物理擊打

I.化學裂解：

作用：採用化學方式破壞細胞膜和細胞核膜充分釋放細胞內容物。

II.物理擊打：

作用：針對細胞膜難以裂解或裂解不充分的微生物，採用玻璃珠碰撞產生剪切力進行物理干預破壞；

材料：玻璃珠。

3）酚類及生物鹼干擾物的去除

PVPP：

作用：

a）去除酚類和生物鹼； 

b）可參與配製適合的緩沖溶液反復浸提體系中的DNA，同時吸附雜質。

4）蛋白質、雜質、抑制劑干擾物的去除

HTR等試劑

純化DNA；

Rnase A 消化RNA；

獲得DNA溶液；

2. PCR文庫擴增

2.1 高保真pfu酶的使用：

作用：

①降低擴增環節鹼基錯配率； 

②校正作用； 

③保真性大於Taq酶； 

④產生平末端。

2.2 最低循環數的控制：

a）循環數對PCR擴增的影響：

    1）降低擴增環節鹼基錯配率；

    2）校正作用；

    3）保真性大於Taq酶；

    4）產生平末端。

b）解決方法：

    1）根據樣本來源及類型，利用預實驗對擴增反應條件進行摸索，用最低的循環數獲得滿足後續實驗濃度要求的擴增產物。

    2）因樣本間存在質量差異等情況，應保持每個樣本擴增的循環數統一。

c）擴增DNA模板濃度的均一性

    根據樣本類型和來源，將擴增時樣本DNA濃度調整至一致，以免由於樣本DNA濃度差異造成擴增後產生偏差，增加樣本間的可比性。

d）建庫擴增循環數

    1）採用擴增形式進行接頭添加；

    2）利用最低循環數確保完成建庫。

3.實驗過程質控

3.1 陰、陽性對照設置

1）元基因組提取環節：

①設置陽性對照，監控提取效果； 

②設置陰性對照，監控提取流程。

2）PCR環節：

①設置陽性對照，監控擴增效果； 

②設置陰性對照，監控PCR操作流程； 

③擴增抽提環節陰性對照，監控抽提是否有污染； 

④擴增抽提環節陽性對照，驗證抽提效果。

4.數據分析優先順序的確定

4.1 下機數據分析優先順序：

1）分析陽性對照：觀察實驗、測序環節是否有問題；

2）比較分析不同測序run之間的陽性對照，排除測序批次間的差異性。

3）按照要求分析該批次中的樣本。

7. 微生物檢測手段及注意事項

1. 微生物計量法

1.1 體積測量法

又稱測菌絲濃度法，通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液(如10 mL)放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間(如5 min)和轉速(如5000 rpm)，離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為(10-v)/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱 乾重法

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10~20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1~5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105 ℃或100 ℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80 ℃或40 ℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40 ℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母(Activity Dry Yeast, ADY),一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3 比濁法

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600 nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.coli的生長及誘導時間。

1.4 菌絲長度測量法

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長。

2. 微生物計數法

2.1 血球計數板法

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1 mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1 mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1 mL菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2 染色計數法

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3 比例計數法

將已知顆粒(如黴菌孢子或紅細胞)濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4 液體稀釋法

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5 mL試樣，接種1 mL到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN(Most Probable Number)得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5 平板菌落計數法

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9 cm的平板上出現50~500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的'細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6 試劑紙

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑(TTC，無色)待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7 膜過濾法

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

3. 間接測定法

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。因此可利用生理指標等間接參數來測定生物量。

3.1 測定含氮量

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

3.2 測定含碳量

將少量(乾重0.2~2.0 mg)生物材料混入1 mL水或無機緩沖液中，用2 mL 2%的K2Cr2O7溶液在100 ℃下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5 mL，在580 nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

3.3還原糖測定法

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

3.4 氨基氮的測定

離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02 mol/L的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02 mol/L的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

3.5 其他生理物質的測定

P，DNA，RNA，ATP，NAM(乙醯胞壁酸)等含量以及產酸，產氣，產CO2(用標記葡萄糖做基質)，耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

4. 商業化快速微生物檢測法

微生物的檢測，其發展方向是快速，准確，簡便，自動化，當前很多生物製品公司利用傳統微生物檢測原理，結合不同的檢測方法，設計了形式各異的微生物檢測儀器設備，正逐步廣泛應用於醫學微生物檢測和科學研究領域。例如：

4.1 試劑盒，培養基等手段

抗干擾培養基和微生物數量快速檢測技術結合解決了傳統微生物檢測手段不能解決的難題，為建立一套完整的抗干擾微生物檢測系統奠定了堅實的基礎。如：抗干擾微生物培養基，新型生化鑒定管，微生物計數卡，環境質量檢測試劑盒等，可方便的用於多項檢測。

4.2 藉助新型先進儀器

BACTOMETER全自動各類總菌數及快速細菌檢測系統可以數小時內獲得監測結果，樣本顏色及光學特徵都不影響讀數，對酵母和黴菌檢測同樣高度敏感原理是利用電阻抗法(Impedance Technology)將待測樣本與培養基置於反應試劑盒內，底部有一對不銹鋼電極，測定因微生物生長而產生阻抗改變。如微生物生長時可將培養基中的大分子營養物經代謝轉變為活躍小分子，電阻抗法可測試這種微弱變化，從而比傳統平板法更快速監測微生物的存在及數量。測定項目包括總生菌數，酵母菌，大腸桿菌群，黴菌，乳酸菌，嗜熱菌，革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌等。

微生物OD值是反映菌體生長狀態的一個指標，OD是Optical Density(光密度)的縮寫，表示被檢測物吸收掉的光密度。通常400～700 nm 都是微生物測定的范圍，需要紫外分光光度計測最大吸收波長。用得最多的是：505 nm測菌絲菌體、560 nm測酵母、600 nm測細菌。用測OD方法畫微生物生長曲線時，同一株菌的起始培養濃度可以准備多管(根據檢測點的需要，如需檢測10個點，就准備10管)，然後每個點取一管出來測OD值就行了。

一般測菌體密度的OD的波長范圍是580 nm-660 nm，如枯草芽孢桿菌用600 nm，已經屬於可見光區(200 nm～400 nm為紫外光區，400 nm～800 nm為可見光區)。空白如用水做，需要離心洗滌菌體;空白如用不接種的培養基做就不需要洗滌，但是不接種的培養基要和接種的同時培養以求條件一致，最後注意一般OD值在控制在0.1~0.4最好，在這個區內的值就可靠，如果OD大於1.0，一般要稀釋後再測，因為OD太大，分光光度計的靈敏度就會顯著降低。

一般都測吸光值，而且最好是整個實驗過程中，保持發酵液或菌體的稀釋倍數一致，吸光值與稀釋倍數不一定成正比，可保證整個實驗點有可比性。且取值的時候要連續讀數，重復3次的數最好。

另，用分光光度計測微生物的OD值為什麼要把波長設為600 nm

這個波長其實只是針對濁度，而分光光度計在600 nm處對濁度的反應比較靈敏。測吸收峰的實際意義並不大，比如LB搖瓶培養過夜的大腸桿菌，其實在400多納米處的吸收最大，但那很可能是培養液的吸收峰。

8. 生物群落多樣性的測度方法有哪些

群落的物種數目，即物種豐富度，是最古老、同時也是最基本的一個多樣性概念，從對它的估計中可以得到關於物種滅絕速率方面的信息，這對生物多樣性保護是非常重要的。已經提出了很多方法來估計九落中的物種數目，這些方法可以分為兩大類，即基於理論抽樣的方法和基於數據分析的方法。前者包括經典估計方法和貝葉斯估計方法；後者包括對正態分布的積分方法、再抽樣方法和種－面積曲線的外推方法。

9. 生物監測的生物監測手段

主要有：①利用指示生物來監測，如根據顫蚓、蛭等大型底棲無脊椎動物和搖蚊幼蟲，以及某些浮游生物在水體中的出現和消失、數量的多少等來監測水體的污染狀況。利用污水生物系統監測水體污染也是一種常用的手段。②利用水生生物群落結構的變化來監測。水質狀況發生變化，水生生物群落結構也會發生相應的改變。在有機物污染嚴重、溶解氧很低的水體中，水生生物群落的優勢種只能由抗低溶解氧的種類組成；未受污染的水體，水生生物群落的優勢種則必然是一些清水種類。在利用指示生物和群落結構監測水體污染時，還引用了生物指數和生物種的多樣性指數等數學手段，簡化監測的方法。③水污染的生物測試，即利用水生生物受到污染物的毒害所產生的生理機能的變化，測試水質污染的狀況。這種方法可以測定水體的單因素污染，對測定復合污染也能收到良好的效果。測試方法分為靜水式生物測試和流水式生物測試。
對土壤污染進行生物監測也是一種可行的途徑，但國內外做的工作還不多。環境系統十分復雜，生物監測只有與物理、化學監測結合起來，才能取得更好的效果。

10. 自然保護區生物多樣性保護監測措施

人類與自然界所有的生物都息息相關、處於同一個生態系統，保護生物多樣性，應科學、系統地建立生物多樣性監測體系，為物種生存、繁衍提供良好的環境氛圍；
生物多樣性保護技術包括野生動物監測管理、野生植物監測管理、古樹名木監測管理以及動物救助管理四個方面。
物聯英卡的野生動物監測管理技術是充分利用高空視頻、高清視頻、無人機視頻和紅外相機進行連續觀測，採用AI識別方法對保護區內的野生動物多樣性種群數量、屬科目多樣性、新發現物種、新分布棲息地等進行監測、識別、分類和數據匯總，為野生動保護成效評價提供數據支撐。
野生植物的監測保護通過實時連續觀測物候圖像和氣候環境大數據，建立珍稀植物生長和生境資料庫，對生長狀態、生存環境、變化趨勢等進行有效分析評估，為科學保護野生植物和人工培養提供數據支撐。
古樹名木監測管理是對古樹名木進行實時連續有效觀測，包括安防監測、倒伏監測、物候監測，建立專項資料庫，結合氣候監測數據和土壤等環境監測數據，對生長狀態、變化趨勢等進行有效分析評估，加強古樹名木有效保護力度。
動物救助管理是對救助過程、動物狀態進行信息化記錄管理，並提出合理化建議，便於自然保護區開展動物救援工作。
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