腸道菌群豐度檢測方法

A. 大腸桿菌的檢測方法

多管發酵法。

多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而後能產生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特徵熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。

在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵，分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離，接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最後通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。

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注意事項：

1、檢樣時注意無菌操作。

2、稀釋時採用的稀釋液可以用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，接種時可採用九管法，設置三個梯度，分別為0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一個稀釋度的試管應充分混勻。

3、每次實驗需要有陰性對照。

4、使用小倒管培養基配製時，為排凈氣泡，滅菌時不要把試管的蓋子蓋的太緊，滅菌後注意觀察一下倒管中的氣體是否排完全、

5、高壓滅菌後等高壓滅菌鍋的壓力表達到0，取出培養基放到冰箱冷卻，效果會比較好。

B. 大腸桿菌檢測方法國標是用什麼方法檢測的

大腸桿菌檢測方法分為三種：

1、細菌分離鑒定法

分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液先經肉湯增菌，然後轉種血瓊脂平板。其他標本同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。

37℃孵育18～24小時後，觀察菌落塗片染色鏡檢。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要的時候檢定腸黴毒素。

2、衛生細菌學檢查法

大腸桿菌會不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，則表示樣品被糞便污染的越嚴重，表明樣品中存在腸道致病菌的可能性也就越大。

大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群，瓶裝汽水和果汁中每100ml大腸菌群不能超過5個。

3、全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測法

全自動微生物定量分析（TEMPO）儀大腸桿菌群計數檢測有TEMPOTC和TEMPOCC兩種方法。

TEMPOTC的開發是為獲得NF ISO4832標准相當性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群方法。

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大腸桿菌在生物技術中的應用

這些菌株由於失去了細胞壁等重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。即便由於操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。

生物工程用的菌株基因組都被優化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用於分子克隆實驗。

真核基因在大腸桿菌中表達，必須有合適的表達載體(Vector),常用載體：pBV220,pET系統。

目的基因在大腸桿菌中表達的情況：

大腸桿菌更適合原核基因的表達，外源基因表達產量與單位體積產量是正相相關的，外源基因拷貝數和表達 產物產量之間存在動態平衡，單個細胞的產量又與外源基因拷貝數，基因表達效率，表達產物的穩定性和細胞代謝負荷等因素有關。

C. 腸道致病菌的分類及常用檢測方法

根據可培養細菌的數量分類在腸道菌群中，可以培養到的細菌有400餘種，依據其數量多少可以分為主要(優勢)菌群(predominant microflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。

①主要(優勢)菌群：指腸道菌群中數量大或種群密集度大的細菌，一般在10～10cfu/g以上，包括類桿菌屬、優桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬於原籍菌群。優勢菌群是對宿主發揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。

②次要菌群：數量在10～10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬於外籍菌群或過路菌群。

檢測方法：

1、采樣及稀釋

（1）按無菌操作法將檢樣25g（或25mL）放於含有225mL無菌水的三角瓶中（瓶內預置適當數量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質器，以8000～10000r/min的速度離心1min，做成1：10的稀釋液。

（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1Ml，注入含有9mL無菌水的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀釋液。

（3）根據食品的衛生要求或對檢驗樣品污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。

2、乳糖初發酵試驗

即通常所說的假定試驗。其目的在於檢查樣品中有無發酵乳糖產生氣體的細菌。將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發酵管。

lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發酵管。每一個稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。

3、分離培養

將產氣的發酵管分別劃線接種於伊紅美藍瓊脂平板，置36±1℃溫箱內培養18～24h，然後觀察菌落形態並作革蘭氏染色、鏡檢並作復發酵試驗。

4、乳糖復發酵試驗

即通常所說的證實試驗，其目的在於證明經乳糖初發酵試驗呈陽性反應的試管內分離到的革蘭陰性無芽胞桿菌，確能發酵乳糖產生氣體。

在上述選擇性EMB培養基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1～2個進行革蘭染色，同時接種乳糖發酵管，置36±l℃溫箱內培養24±2小時，觀察產氣情況。

凡乳搪發酵管產氣，革蘭染色為陰性反應的無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；凡乳糖發酵管不產氣或革蘭染色為陽性，則報告為大腸菌群陰性。

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有益菌菌群的生理功能：

如果腸內有益菌菌群占優，腸內黏膜呈現粉紅色，表示腸內環境相當良好。

1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄

在胃部分解消化的食物，經由小腸吸收營養後，成為粘稠狀物體送至大腸。然後再經過18小時將水分及礦物質吸收，就變成容易排泄的糞便。腸道內環境良好時，糞便的軟硬適中，排便會較為順利。

2、緩和的蠕動，能順利將糞便排出

藉由腸的蠕動，將糞便緩慢的推送至肛門。如果蠕動過快或太慢，都將影響糞便的構成，導致便秘或者腹瀉。而如果腸內干凈，則蠕動的速度就相當的有規律，糞便可順利排出。

3、有助維他命的合成

比菲德氏菌等好菌能維護肌膚的健康，並具有合成有助熱量產生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會不斷繁殖，維他命的合成也可順利進行。

4、迅速排出有害物質

健康的腸道並非完全沒有壞菌的存在，有害物質多少會產生。當然還包括，吃進體內的食品化學添加物或是無法成為營養成分的物質。只要腸內環境良好，這些物質在開始危害身體前就被排出體外。

5、避免病原菌的侵害

比菲德氏菌等好菌可以刺激並提高身體的免疫機能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內繁殖。

腸道有益菌菌群除了以上功能之外，對人體還有營養作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對人類的毛發具有重要的作用，當缺少這些營養元素，會導致頭發脫落或毛發發黃、發叉，容易折斷等現象。

D. 醫院怎麼檢查腸道菌群

腸道菌群有兩種檢查方法。(一)菌群檢查為主要檢查方法，有定性分析和定量分析兩種。(1)定性分析，與一般微生物檢查方法相同，定性分析後，要進一步做定量檢查。(2)定量檢查，手續麻煩，一般實驗室很少採用。(二)結腸鏡檢查：有散在的糜爛性潰瘍及出血，有時可能會見黃色假膜附著。如果症狀嚴重者建議去醫院診斷及治療。
腸道內種類繁多的細菌之間相互作用以維持腸道正常菌群的穩定性。腸道中需氧菌和兼性厭氧菌消耗氧氣，有利於專性厭氧菌生長。專性厭氧菌過度繁殖反過來抑制需氧菌生長，進一步抑制厭氧菌自身繁殖。這些細菌還通過各種代謝產物互相影響，起到自身調節作用。有些學者將胃腸道菌群分為原籍菌（或稱常住菌群或固定菌群）和外籍菌（或稱過路菌群或游動菌群），正常菌群是以原籍菌為優勢菌群，外籍菌參與組成，外籍菌在人體中數量少而且不穩定。當腸道內一些原籍菌由於失去制約而過度生長叫腸道菌群失調。

E. 菌落總數大腸桿菌和致病菌的檢測方法

大腸菌群測定的操作細則
大腸菌群系指一群能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。該菌主要來於人畜糞便,故以此作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量,推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。
食品中大腸菌群數系以100mL(g)檢樣內大腸菌群最可能數(MPN)表示。
1
設備和材料
1.1
溫箱：36±1℃。
1.2
冰箱:0～4℃。
1.3
恆溫水浴
:44.5±0.5℃。
1.4
天平。
1.5
顯微鏡。
1.6
均質器或乳缽。
1.7
平皿:直徑為90mm。
1.8
試管。
1.9
吸管。
1.10
廣口瓶或三角燒瓶:容量為500mL。
1.11
玻璃珠:直徑約5mm。
1.12
載玻片。
1.13
酒精燈。
1.14
試管架。
2
培養基和試劑
2.1
乳糖膽鹽發酵管:按GB
4789.28中4.9規定。
2.2
伊紅美藍瓊脂平板:按GB
4789.28中4.25規定。
2.3
乳糖發酵管:按GB
4789.28中4.10規定。
2.4
EC
肉湯:按GB
4789.28中4.11規定。
2.5
磷酸鹽緩沖稀釋液:按GB
4789.28中3.22規定。
2.6
生理鹽水。
2.7
革蘭氏染色液:按GB
4789.28中2.2規定。
3
操作步驟
3.1
檢樣稀釋
3.1.1
以無菌操作將檢樣25mL(或g)放於有225mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內(瓶內予置適當數量的玻璃珠)或滅菌乳缽內,經充分振搖或研磨做成1:10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質器,以8
000-10
000
r/min的速度處理1min,做成1:10的均勻稀釋液。
3.1.2
用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1mL,注入含有9mL滅菌生理鹽水或其他稀釋液的試管內,振搖試管混勻,做成1:100的稀釋液。
3.1.3
另取1mL滅菌吸管,按上條操作依次做10倍遞增稀釋液,每遞增稀釋一次,換用1支1mL滅菌吸管。
3.1.4
根據食品衛生標准要求或對檢樣污染情況的估計,選擇三個稀釋度,每個稀釋度,接種3管。
3.2
乳糖發酵試驗
將待檢樣品接種於乳糖
膽鹽發酵管內,接種量在1mL以上者,用雙料乳糖膽鹽發酵管,1mL及1mL以下者,用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管,置36±1℃
溫箱內,培養24±2h,如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣,則可報告為大腸菌群陰性,如有產氣者,則按下列程序進行。
3.3
分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上,置36±1℃
溫箱內,培養18-24h,然後取出,觀察菌落形態,並做革蘭氏染色和證實試驗。
3.4
證實試驗
在上述平板上,挑取可疑大腸菌群菌落1-2個進行革蘭氏染色,同時接種乳糖發酵管,置
36±1℃溫箱內培養24±2h,觀察產氣情況。凡乳糖管產氣、革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌,即可報告為大腸菌群陽性。
3.5
報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)大腸菌群的MPN值。
4
糞大腸菌群(faecal
coliform)
4.1
用接種環將所有產氣的乳糖膽鹽發酵管培養物(見3.2條)轉種於EC肉湯管內,置44.5±0.2℃水浴箱內(水浴箱內的水面應高於EC肉湯液面),培養24±2h,經培養後,如所有EC肉湯管均不產氣,則可報告為陰性;如有產氣者,則將所有產氣的EC肉湯管分別轉種於伊紅美藍瓊脂平板上,置
培養18-24h,凡平板上有典型菌落者,則證實為糞大腸菌群陽性。
4.2
結果報告
根據證實為糞大腸菌群的陽性管數,查MPN檢索表,報告每100mL(g)糞大腸菌群的MPN值。

F. 大腸桿菌的檢查方法

細菌的分離鑒定
1、標本：腸道外感染取中段尿、血液、膿液、腦脊液等，腹瀉者取糞便。
2、分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液需先經肉湯增菌，再轉種血瓊脂平板。其他標本可同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。37℃孵育18～24小時後，觀察菌落並塗片染色鏡檢。採用一系列生化反應進行鑒定。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要時檢定腸黴毒素。
泌尿系統除確定大腸桿菌外，還應計數，每毫升尿含菌量≥100，000時，才有診斷價值。
衛生細菌學檢查
大腸桿菌不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境和水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，表示樣品被糞便污染越嚴重，也表明樣品中存在腸道致病菌的可能性越大。故應對飲水、食品、飲料進行衛生細菌學檢查。
1、細菌總數：檢測每毫升或每克樣品中所含細菌數，採用傾注培養計算。中國規定的衛生標準是每毫升飲水中細菌總數不得超過100個。
2、大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國的衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群；瓶裝汽水、果汁等每100ml大腸菌群不得超過5個。
全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測
全自動微生物定量分析（TEMPO）儀的大腸桿菌群計數檢測有TC和CC兩種方法。TEMPO TC的開發是為了獲得NF ISO4832標准相當性能水平。TEMPO CC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群的方法。該法是為了獲得和AOAC官方方法966.24及美國公共健康聯合會檢測乳製品檢測方發（SMEDP）一致的效果。TEMPO系統根據陽性空的大小和數目來推算出原始樣本中大腸桿菌群數目。
食品檢測方法 大腸菌群MPN 計數法 1 樣品的稀釋 1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,
8000 r/min～10000 r/min 均質1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋
中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，製成1:10 的樣品勻液。
1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶
（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成1:10 的樣品勻液。
1.3 樣品勻液的pH 值應在6.5～7.5 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調節。
1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液
或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌
吸管反復吹打，使其混合均勻，製成1:100 的樣品勻液。
1.5 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋
1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。 2.初發酵試驗 每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3
管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36
℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續
培養至48 h±2 h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。 3.復發酵試驗 用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ℃±1
℃培養48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。 4.大腸菌群最可能數（MPN）的報告 按3確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的
MPN值。 大腸菌群平板計數法 1 樣品的稀釋 按上一方法稀釋。 2 平板計數 2.1 選取2個～3個適宜的連續稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽
水加入無菌平皿作空白對照。
2.2 及時將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注於每個平皿中。小心
旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固後，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平
板，置於36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。 3 平板菌落數的選擇 選取菌落數在15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。
典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5 mm 或更大。 4 證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於BGLB 肉湯管內，36 ℃±1 ℃
培養24 h～48 h，觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。

G. 大腸菌群檢測方法

GB 4789.3-2016 《食品安全國家標准 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中的規定操作步驟：

1、乳糖發酵試驗：樣品稀釋後，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。

2、分離培養：將產氣發酵管培養物轉種於伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18-24h，觀察菌落形態。

3、證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發酵管36±1℃培養24±2h，觀察產氣情況。

SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標准出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》規定操作：

1、推測試驗：樣品稀釋後，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。

2、證實試驗：將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。

(7)腸道菌群豐度檢測方法擴展閱讀：

大腸菌群並非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面並非完全一致。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。

大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。

糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。

H. 腸道菌群檢測是什麼如何檢測

腸道菌群檢測是通過對人體糞便的提取物檢測腸道菌群狀況，比例是否正常，存在哪些問題和風險。對於前述適應症疑似患者，治療前均需進行腸道菌群進行多項常規生物指標檢測，以初步判斷患者腸道菌群狀況。

在進行此基礎上，進一步對疑似患者進行腸道菌群基因檢測，並對結果進行詳盡解讀，以便給患者菌群移植治療制定個性化精準菌群移植治療方案。