糧粒黴菌孢子檢測方法

❶ 微生物檢測-黴菌

黴菌和酵母計數操作細則
1 設備和材料
1.1 溫箱：25～28℃。
1.2 振盪器。
1.3 天平。
1.4 顯微鏡。
1.5 玻塞三角瓶：300mL。
1.6 試管：15mm×150mm。
1.7 平皿：直徑9cm。
1.8 吸管：1mL及10mL。
1.9 酒精燈。
1.10 載物玻片。
1.11 蓋玻片。
1.12 廣口瓶。
1.13 牛皮紙袋：121℃滅菌20min。
1.14 金屬勺、刀等。
1.15 試管架。
1.16 接種針。
1.17 橡皮乳頭。
2 培養基和試劑
2.1 馬鈴薯－葡萄糖瓊脂培養基，附加抗菌素，按GB 4789.28中4.79規定。
2.2 孟加拉紅培養基：按GB 4789.28中4.81規定。
2.3 滅菌蒸餾水。
2.4 乙醇。
3 操作步驟
3.1 采樣：取樣時須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。首先准備好滅菌容器和采樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬刀或勺等。在衛生學調查基礎上，採取有代表性的樣品。樣品採集後應盡快檢驗，否則應將樣品放在低溫乾燥處。
糧食(包括糧庫貯糧，糧店或家庭小量存糧)樣品的採集，可根據糧囤或糧垛的大小和類型，分層定點取樣，一般可分三層五點，或分層隨機採取不同點的樣品，充分混合後，取500g左右送檢。小量存糧可使用金屬小勺採取上、中、下各部位的混合樣品。
穀物加工製品(包括熟飯、糕點、麵包等)、發酵食品、乳及乳製品以及其他液體食品，用滅菌工具採集可疑霉變食品250g，裝入滅菌容器內送檢。
3.2 以無菌操作稱取檢樣25g(或25mL)，放人含有225mL滅菌水的玻塞三角瓶中，振搖30min，即為1：10稀釋液。
3.3 用滅菌吸管吸取1∶10稀釋液10mL，注入試管中，另用帶橡皮乳頭的1mL滅菌吸管反復吹吸50次，使黴菌孢子充分散開。
3.4 取1mL1∶10稀釋液注入含有9mL滅菌水的試管中，另換一支1mL滅菌吸管吹吸5次，此液為1∶100稀釋液。
3.5 按上述操作順序做10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1mL滅菌吸管，根據對樣品污染情況的估計，選擇3個合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時，吸取1mL稀釋液於滅菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿，然後將涼至45℃左右的培養基注入平皿中，待瓊脂凝固後，倒置於25～28℃溫箱中，3d後開始觀察，共培養觀察5d。
3.6 計算方法：通常選擇菌落數在10～150之間的平皿進行計數，同稀釋度的2個平皿的菌落平均數乘以稀釋倍數，即為每克(或毫升)檢樣中所含黴菌和酵母數。
3.7 報告：每克(或毫升)食品所含黴菌和酵母數以個/g(個/mL)表示。

❷ 大豆疫病菌的檢驗方法

首先需進行常規的洗滌檢驗。大豆霜霉病的卵孢子也可以產生在豆粒的表皮，卵孢子在種子上的數量往往很多，且肉眼也能見到一層白色霉層在豆粒表皮上。大豆霜霉病在我國東北地區常有發生，檢驗時必須嚴格區分疫黴菌和霜黴菌兩種卵孢子。
大豆疫黴菌以卵孢子和菌絲體存在於種皮內部，種子檢驗時應檢查種皮里是否帶有疫黴菌卵孢子，其檢驗方法，是將豆粒放在10%KOH或自來水中浸泡一夜，取出後剩下種皮，在解剖鏡下製片，然後在顯微鏡下檢查，即可見到大豆疫霉卵孢子。大豆疫黴菌卵孢子的活性檢查，可採用染色法，用0.05%MTT（噻唑蘭）染色，在顯微鏡下觀察卵孢子，被染上蘭色的為休眠後可以萌發的卵孢子，玫瑰紅色的表示處於休眠中的卵孢子，黑色的和未染上顏色的表示已死亡的卵孢子。
疫黴菌分離過程中，很容易受到細菌和其他真菌如鐮刀菌、腐黴菌的染污而使疫霉生長受到抑制，現在一般分離病組織內的疫黴菌是採用PARP選擇性培養基，即在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基中加入以下抗菌素和葯劑，培養基中有效成份最終濃度為：匹馬黴素10ppm，安比西林250ppm，利福黴素10ppm，五氯硝基苯100ppm，惡霜靈50ppm.

❸ 微生物生長的幾種檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定

體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的'生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生(轉載於:mHg）的條件下才能生長，他們有完整的呼吸鏈，以分子氧為最終氫受體，具有超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。

兼性厭氧菌:它是以在有氧條件下的生長為主也可兼在厭氧條件下生長的微生物，有時也稱「兼性好氧菌」。

微好氧菌:只能在嬌滴滴額氧分壓（1.33~3.Pa，正常大氣中的氧分壓為0.2bar）下才能正常生長的微生物。

耐氧菌:耐氧性厭氧菌的簡稱，是一類可在分子氧存在下進行發酵性厭氧生活的厭氧菌。

厭氧菌:有一般厭氧菌與嚴格厭氧菌（專性厭氧菌）之分。

超氧陰離子自由基:活性氧的形式之一，因有奇數電子，故帶負電荷；它既有分子性質，又有離子性質；其性質極不穩定，化學反應力極強，在細胞內可破壞各種重要生物大分子和膜結構，還可形成其他活性氧化物，故對生物體極其有害。

超氧化物歧化酶(SOD):保護好氧菌免受超氧化物陰離子自由基的毒害的酶。按SOD分子中所含金屬輔基的不同分三類：1、含Cu、Zn的SOD，存在於幾乎所有真核生物的細胞質中；2、含Fe的SOD，主要存在原核生物中；3、含Mn的SOD，主要存在於真核生物的線粒體中。SOD除可清除超氧陰離子自由基外，還發現在防治人體衰老、治療自身免疫性疾病、抗癌、防白內障、治療放射病和肺氣腫以及解除苯中毒等方面有一系列療效。

PRAS培養基:用嚴格厭氧方法配置、分裝、滅菌後的厭氧菌培養基，稱為預還原無氧滅菌培養基，即PRAS培養基。

厭氧罐:培養厭氧菌的裝置。

亨蓋特滾管技術:一種集制備高純氮、以氮驅氧和全過程實現無氧操作、無氧培養、無氧檢測於一體，用於研究嚴格厭氧菌的技術和裝置。

厭氧手套箱:一種用於無氧操作和培養嚴格厭氧菌的箱形密閉裝置。

搖瓶培養:一般將三角瓶內培養液的瓶口用8層紗布包紮，以利通氣和防止雜菌污染，同時減少瓶內裝液量，把它放在往復式或旋轉式搖床上作有節奏的震盪，以達到提高溶氧量的目的。

曲:是一類用麩皮、米糠等疏鬆的固體營養料接種、培養微生物而製成的含氧活菌產品。

曲法培養:將麩皮、碎麥或豆餅等固態基質經蒸煮和自然接種後，薄薄地鋪在培養容器表面，使微生物即可獲得充足的氧氣，又有利於散發熱量，對真菌來說，還有利於產生大量孢子。

通風曲:一種機械化程度和生產效率都較高的現代大規模製曲技術，在我國醬油釀造業中廣泛應用。

污染:有害微生物通過氣流、水流、接觸和人工接種等方式，傳播到合適的基質或生物對象上而造成種種危害。

巴氏消毒法:有發過微生物學家巴斯德用於果酒消毒，故名。這是一種專用於牛奶、啤酒、果酒或醬油等不宜進行高溫滅菌的也太風味食品或調料的低溫消毒方法（一般在60-85度下處理30min至15s）。有兩種方法：1、低溫維持法；2、高溫瞬時法。

間歇滅菌法:適用於不耐熱的培養基滅菌。方法是：講帶滅菌的培養基放在80-100度下蒸煮15-60min，以殺滅其中所有的微生物營養體，然後放至室溫37度下保溫過

夜，誘使其中殘存的芽孢發芽，第二天再以同樣方法蒸煮和保溫過夜，如此重復3天即可在較低的滅菌溫度下同樣達到徹底滅菌的效果。

連續加壓蒸氣滅菌法:讓培養基在管道的流動過程中快速升溫、維持和冷卻，然後流進發酵罐。

梅拉特反應:高溫滅菌時，培養基中得氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白質）的游離氨基與羧基化合物（糖類）的羰基間發生復雜的化學反應，導致培養基褐變同時，還降低了有關營養物成分，故應設法避免。

石炭酸系數:一定時期內，被試葯劑能殺死全部供試菌的最高稀釋度與達到同效果的石炭酸的最高稀釋度之比。

抗生素:一類有微生物或其他生物生命活動過程中合成的此生代謝產物或其人工衍生物，他們在很低濃度時就能一直或干擾他種生物的生命活力，因而可用作有兩的化學治療劑。

抗代謝葯物:一類在化學結構上與細胞內必要代謝物的結構相似，並可干擾正常代謝活動的化學物質。3種作用：1、與正常代謝物一起共同競爭酶的活性中心，從而使微生物正常代謝所需要的重要物質無法正常合成，例如磺胺類；2、「假冒」正常代謝物，使微生物合成出無法正常生理活動的假產物，如8-重氮鳥嘌呤取代鳥嘌呤而合成的核苷酸就會產生無正常功能的RNA；3、某些抗代謝葯物與某一生化合成途徑的終產物結構類似，可通過反饋調節破壞正常代謝調節機制，例如，6-巰基腺嘌呤可抑制腺嘌呤核苷酸的合成。

選擇毒力:大於病原菌具高度毒力而對其宿主基本無毒的化學物質來抑制宿主體內病源微生物的生長繁殖，藉以達到治療該宿主傳染病的一種措施。

❹ 食品黴菌和酵母分別計數是怎麼樣的

黴菌和酵母計數 1主題內容與適用范圍

本標准規定了各類糧食、食品和飲料黴菌和酵母菌計數的檢驗方法。

本標准適用於各類糧食、食品和飲料中黴菌和酵母菌的計數。

2引用標准

GB 4789.28食品衛生微生物學檢驗染色法、培養基和試劑

3設備和材料

3.1溫箱：25～28℃。

3.2振盪器。

3.3天平。

3.4顯微鏡。

3.5玻塞三角瓶：300mL。

3.6試管：15mm×150mm。

3.7平皿：直徑9cm。

3.8吸管：1mL及10mL。

3.9酒精燈。

3.10載物玻片。

3.11蓋玻片。

3.12廣口瓶。

3.13牛皮紙袋：121℃滅菌20min。

3.14金屬勺、刀等。

3.15試管架。

3.16接種針。

3.17橡皮乳頭。

4培養基和試劑

4.1馬鈴薯－葡萄糖瓊脂培養基，附加抗菌素，按GB 4789.28中4.79規定。

4.2孟加拉紅培養基：按GB 4789.28中4.81規定。

4.3高鹽察氏培養基：按GB 4789.28中4.78規定。

4.4滅菌蒸餾水。

4.5乙醇。

5檢驗程序

檢驗程序如下：

（圖略）

6操作步驟

6.1采樣：取樣時須特別注意樣品的代表性和避免采樣時的污染。首先准備好滅菌容器和采樣工具，如滅菌牛皮紙袋或廣口瓶，金屬刀或勺等。在衛生學調查基礎上，採取有代表性的樣品。樣品採集後應盡快檢驗，否則應將樣品放在低溫乾燥處。

糧食(包括糧庫貯糧，糧店或家庭小量存糧)樣品的採集，可根據糧囤或糧垛的大小和類型，分層定點取樣，一般可分三層五點，或分層隨機採取不同點的樣品，充分混合後，取500g左右送檢。小量存糧可使用金屬小勺採取上、中、下各部位的混合樣品。

海運進口糧的采樣：每一船倉採取表層、上層、中層及下層四個樣品，每層從五點取樣混合，如船倉盛糧超過10000t，則應加采一個樣品。必要時採取有疑問的樣品送檢。

穀物加工製品(包括熟飯、糕點、麵包等)、發酵食品、乳及乳製品以及其他液體食品，用滅菌工具採集可疑霉變食品250g，裝入滅菌容器內送檢。

6.2以無菌操作稱取檢樣25g(或25mL)，放人含有225mL滅菌水的玻塞三角瓶中，振搖30min，即為1：10稀釋液。

6.3用滅菌吸管吸取1∶10稀釋液10mL，注入試管中，另用帶橡皮乳頭的1mL滅菌吸管反復吹吸50次，使黴菌孢子充分散開。

6.4取1mL1∶10稀釋液注入含有9mL滅菌水的試管中，另換一支1mL滅菌吸管吹吸5次，此液為1∶100稀釋液。

6.5按上述操作順序做10倍遞增稀釋液，每稀釋一次，換用一支1mL滅菌吸管，根據對樣品污染情況的估計，選擇3個合適的稀釋度，分別在做10倍稀釋的同時，吸取1mL稀釋液於滅菌平皿中，每個稀釋度做2個平皿，然後將涼至45℃左右的培養基注入平皿中，待瓊脂凝固後，倒置於25～28℃溫箱中，3d後開始觀察，共培養觀察5d。

6.6計算方法：通常選擇菌落數在10～150之間的平皿進行計數，同稀釋度的2個平皿的菌落平均數乘以稀釋倍數，即為每克(或毫升)檢樣中所含黴菌和酵母數。

6.7報告：每克(或毫升)食品所含黴菌和酵母數以個/g(個/mL)表示。

❺ 微生物生長的常用檢測方法

一、生長量測定法

1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。

通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。

1.2稱乾重法：

可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。

1.3比濁法：

微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。

1.4菌絲長度測量法：

對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適

的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長

二、微生物計數法

2.1血球計數板法:

血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。

2.2染色計數法：

為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。

2.3比例計數法：

將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的'細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。

2.4液體稀釋法：

對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。

2.5平板菌落計數法：

這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。

2.6試劑紙法：

在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。

2.7膜過濾法：

用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。

2.8生理指標法：

微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。

2.9測定含氮量：

大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。

2.10測定含碳量：

將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。

2.11還原糖測定法：

還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。

2.12氨基氮的測定：

方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。

2.13其他生理物質的測定：

P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。

拓展：微生物的現代定義

肉眼難以看清，需要藉助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細菌、病毒、真菌和少數藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬於真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的「非細胞生物」，但是它的生存必須依賴於活細胞。根據存在的不同環境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細胞結構分類分為原核微生物和真核微生物。

微生物的主要特徵

體小面大

一個體積恆定的物體，被切割的越小，其相對表面積越大。微生物體積很小，如一個典型的球菌，其體積約1mm，可是其表面積卻很大。這個特徵也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎。

吸多轉快

微生物通常具有極其高效的生物化學轉化能力。據研究，乳糖菌在1個小時之內能夠分解其自身重量1000-10000倍的乳糖，產朊假絲酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。

生長繁殖快

相比於大型動物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鍾內繁殖1次。不妨計算一下，1個大腸桿菌假設20分鍾分裂1次，1小時3次，1晝夜24小時分裂24×3=72次，大概可產生4722366500萬億個（2的72次方），這是非常巨大的數字。但事實上，由於各種條件的限制，如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因，微生物無法完全達到這種指數級增長。 已知大多數微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6~7.5)附近，部分則低於4.0。

微生物的這一特性使其在工業上有廣泛的應用，如發酵、單細胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。

適應強 易變異

分布廣 種類多

微生物對我們生活的影響

微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行。在人類疾病中有50%是由病毒引起。微生物導致人類疾病的歷史，也就是人類與之不斷斗爭的歷史。在疾病的預防和治療方面，人類取得了長足的進展，但是新現和再現的微生物感染還是不斷發生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療葯物。一些疾病的致病機制並不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力，使許多菌株發生變異，導致耐葯性的產生，人類健康受到新的威脅。一些分節段的病毒之間可以通過重組或重配發生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導致感染的株型發生了變異，這種快速的變異給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。而耐葯性結核桿菌的出現使原本已近控制住的結核感染又在世界范圍內猖獗起來。

微生物千姿百態，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結構發生不良變化。當然有些微生物是有益的，它們可用來生產如乳酪，麵包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過顯微鏡放大約1000 倍才能看到。比如中等大小的細菌，1000個疊加在一起只有句號那麼大。

微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青黴菌抑制其它細菌的生長中發現了青黴素，這對醫葯界來講是一個劃時代的發現。後來大量的抗生素從放線菌等的代謝產物中篩選出來。抗生素的使用在第二次世界大戰中挽救了無數人的生命。一些微生物被廣泛應用於工業發酵，生產乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，並且可再生資源的潛力極大，稱為環保微生物；還有一些能在極端環境中生存的微生物，例如：高溫、低溫、高鹽、高鹼以及高輻射等普通生命體不能生存的環境，依然存在著一部分微生物等等。看上去，我們發現的微生物已經很多，但實際上由於培養方式等技術手段的限制，人類現今發現的微生物還只佔自然界中存在的微生物的很少一部分。

微生物間的相互作用機制也相當奧妙。例如健康人腸道中即有大量細菌存在，稱為正常菌群，其中包含的細菌種類高達上百種。在腸道環境中這些細菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物質甚至葯物的分解與吸收，菌群在這些過程中發揮的作用，以及細菌之間的相互作用機制還不明了。一旦菌群失調，就會引起腹瀉。

隨著醫學研究進入分子水平，人們對基因、遺傳物質等專業術語也日漸熟悉。人們認識到，是遺傳信息決定了生物體具有的生命特徵，包括外部形態以及從事的生命活動等等，而生物體的基因組正是這些遺傳信息的攜帶者。因此闡明生物體基因組攜帶的遺傳信息，將大大有助於揭示生命的起源和奧秘。

工業微生物涉及食品、制葯、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多種行業。通過微生物發酵途徑生產抗生素、丁醇、維生素C以及一些風味食品的制備等；某些特殊微生物酶參與皮革脫毛、冶金、採油采礦等生產過程，甚至直接作為洗衣粉等的添加劑；另外還有一些微生物的代謝產物可以作為天然的微生物殺蟲劑廣泛應用於農業生產。通過對枯草芽孢桿菌的基因組研究，發現了一系列與抗生素及重要工業用酶的產生相關的基因。乳酸桿菌作為一種重要的微生態調節劑參與食品發酵過程，對其進行的基因組學研究將有利於找到關鍵的功能基因，然後對菌株加以改造，使其更適於工業化的生產過程。國內維生素C兩步發酵法生產過程中的關鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究，將在基因組測序完成的前提下找到與維生素C生產相關的重要代謝功能基因，經基因工程改造，實現新的工程菌株的構建，簡化生產步驟，降低生產成本，繼而實現經濟效益的大幅度提升。對工業微生物開展的基因組研究，不斷發現新的特殊酶基因及重要代謝過程和代謝產物生成相關的功能基因，並將其應用於生產以及傳統工業、工藝的改造，同時推動現代生物技術的迅速發展。

經濟作物柑橘的致病菌是國際上第一個發表了全序列的植物致病微生物。還有一些在分類學、生理學和經濟價值上非常重要的農業微生物，例如：胡蘿卜歐文氏菌、植物致病性假單胞菌以及中國正在開展的黃單胞菌的研究等正在進行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也剛剛測定完成。借鑒已經較為成熟的從人類病原微生物的基因組學信息篩選治療性葯物的方案，可以嘗試性地應用到植物病原體上。特別像柑橘的致病菌這種需要昆蟲媒介才能完成生活周期的種類，除了殺蟲劑能阻斷其生活周期以外，只能通過遺傳學研究找到毒力相關因子，尋找抗性靶位以發展更有效的控制對策。固氮菌全部遺傳信息的解析對於開發利用其固氮關鍵基因提高農作物的產量和質量也具有重要的意義。[10]

在極端環境下能夠生長的微生物稱為極端微生物，又稱嗜極菌。嗜極菌對極端環境具有很強的適應性，極端微生物基因組的研究有助於從分子水平研究極限條件下微生物的適應性，加深對生命本質的認識。

❻ 黴菌和酵母菌的測定還有什麼方法

黴菌和酵母菌介紹及檢測方法
一、黴菌和酵母菌介紹：
黴菌和酵母菌及其檢驗酵母菌是真菌中的一大類，通常是單細胞，呈圓形,卵圓形、臘腸形或桿狀。黴菌也是真菌，能夠形成疏鬆的絨毛狀的菌絲體的真菌稱為黴菌。
黴菌和酵母廣泛分布於自然界並可作為食品中正常菌相的一部分。長期以來，人們利用某些黴菌和酵母加工一些食品，如用黴菌加工乾酪和肉，使其味道鮮美；還可利用黴菌和酵母釀酒、制醬；食品、化學、醫葯等工業都少不了黴菌和酵母。但在某些情況下，黴菌和酵母也可造成中腐敗變質。由於它們生長緩慢和競爭能力不強，故常常在不適於細菌生長的食品中出現，這些食品是pH低、濕度低、含鹽和含糖高的食品、低溫貯藏的食品，含有抗菌素的食品等。由於黴菌和酵母能抵抗熱、冷凍，以及抗菌素和輻照等貯藏及保藏技術，它們能轉換某些不利於細菌的物質，而促進致病細菌的生長；有些黴菌能夠合成有毒代謝產物－黴菌毒素。黴菌和酵母往往使食品表面失去色、香、味。例如，酵母在新鮮的和加工的食品中繁殖，可使食品發生難聞的異味，它還可以使液體發生混濁，產生氣泡，形成薄膜，改變顏色及散發不正常的氣味等。因此黴菌和酵母也作為評價食品衛生質量的指示菌，並以黴菌和酵母計數來制定食品被污染的程度。目前已有若干個國家制訂了某些食品的黴菌和酵母限量標准。我國已制訂了一些食品中黴菌和酵母的限量標准。
二、檢驗方法：
黴菌和酵母的計數方法，與菌落總數的測定方法基本相似。主要步驟為：將樣品製作成10倍梯度的稀釋液，選擇3個合適的稀釋度，吸取1mL於平皿，傾注培養基後，培養觀察，計數。對黴菌的計數，還可以採用顯微鏡直接鏡檢計數的方法。
具體檢測標准參見：
GB4789.15-94，《中華人民共和國國家標准食品衛生微生物檢驗黴菌和酵母計數》
三、說明：
1．樣品的處理。為了准確測定黴菌和酵母數，真實反映被檢食品的衛生質量，首先應注意樣品的代表性。對大的固體食品樣品，要用滅菌刀或鑷子從不同部位採取試驗材料，再混合磨碎。如樣品不太大，最好把全部樣品放到滅菌均質器杯內攪拌2min。液體或半固體樣品可用迅速顛倒容器25次來混勻。
2．樣品的稀釋：為了減少櫚稀釋倍數的誤差，在連續遞增稀釋時，每一稀釋度應更換一根吸管。在稀釋過程中，為了使黴菌的孢子充分散開，需用滅菌吸管反復吹吸50次。
3．培養基的選擇：在黴菌和酵母計數中，主要使用以下幾種選擇性培養基。
馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養基（PDA）：黴菌和酵母在PDA培養基上生長良好。用PDA作平板計數時，必項加入抗菌素以抑制細菌。
孟加拉紅（虎紅）培養基：該培養基中的孟加拉紅和抗菌素具有抑制細菌的作用。孟加拉紅還可抑制黴菌菌落的蔓延生長。在菌落背面由孟加拉紅產生的紅色有助於黴菌和酵母菌落的計數。
高鹽察氏培養基：糧食和食品中常見的麴黴和青黴在該培養基上分離效果良好，它具有抑制細菌和減緩生長速度快的毛霉科菌種的作用。
4．傾注培養。每個樣品應選擇3個適宜的稀釋度，每個稀釋度傾注2個平皿。培養基熔化後冷卻至45℃，立即傾注並旋轉混勻，先向一個方向旋轉，再轉向相反方向，充分混合均勻。培養基凝固後，把平皿翻過來放溫箱培養。大多數黴菌和酵母在25－30℃的情況下生長良好，因此培養溫度25~28℃。培養3d後開始觀察菌落生長情況，共培養5d觀察記錄結果。
5．菌落計數及報告：選取菌落數10~150之間的平板進行計數。一個稀釋度使用兩個平板，取兩個平板菌落數的平均值，乘以稀釋倍數報告。固體檢樣以g為單位報告，液體檢樣以mL 單位報告。關於稀釋倍數的選擇可參考細菌菌落總數測定。
6．黴菌直接鏡檢計數法：對黴菌計數，可以採用直接鏡檢的方法進行計數。
在顯微鏡下，黴菌菌絲具有如下特徵：
平行壁：黴菌菌絲呈管狀，多數情況下，整個菌絲的直徑是一致的。因此在顯微鏡下菌絲壁看起來象兩條平行的線。這是區別黴菌菌絲和其他纖維時最有用的特徵之一。
橫隔：許多黴菌的菌絲具有橫隔，毛霉、根霉等少數黴菌的菌絲沒有橫隔。
菌絲內呈粒狀：薄壁、呈管狀的菌絲含有原生質，在高倍顯微鏡下透過細胞壁可見其呈粒狀或點狀。
分枝：如菌絲不太短，則多數呈分枝狀，分枝與主幹的直徑幾乎相同，有分枝是鑒定霉功得出可靠的特徵之一。
菌絲的頂端：常呈鈍圓形。無折射現象。
凡有以上特徵之一的絲狀均可判定為黴菌菌絲。
觀察視野中有無菌絲，凡符合下列情況之一者為陽性視野。
一根菌絲長度超過視野直徑1/6；
一根菌絲長度加上分枝的長度超過視野直徑1/6；
兩根菌絲總長度超過視野直徑1/6；
三根菌絲總長度超過視野直徑1/6；
一叢菌絲可視為一個菌絲，所有菌絲（包括分枝）總長度超過視野直徑1/6。
根據對所有視野的觀察結果，計算陽性視野所佔比例，並以陽性視野百分數（%）報告結果。計算公式：
每件樣品陽性視野（%）=（陽性視野數 / 觀察視野數）×100

❼ 進行菌種質量檢測的常用方法有哪些

1、直接觀察。對引進菌種觀察包裝是否合乎要求，棉塞有無松動，試管、玻璃瓶和塑料袋有無破損，棉塞和管、瓶或袋中有無病蟲侵染，菌絲色澤是否正常，有無發生變化。然後在瓶塞邊作深吸氣，聞其是否具備特有的香味。原種和栽培種可取出小塊菌絲體觀察其顏色和均勻度，並用手指捏料塊檢驗含水量是否符合標准。

2、顯微鏡檢驗。若菌絲透明，呈分枝狀、有橫隔、鎖狀聯合明顯，再加上具有不同品種固有的特徵，則可認為是合格菌種。

3、觀察菌絲長速。將供測的菌種接入新配製的試管斜面培養基上，置於最適宜的溫、濕度條件下進行培養，如果菌絲生長迅速、整齊濃密、健壯有力，則表明是優良菌種，否則即是劣質菌種。

優質菌種的標准

食用菌的種類雖然繁多，但從總體上看，每一個優良菌種均有＂純、正、壯、潤、香＂的共性。其標準是：

1、菌種的純度要高，不能有雜菌感染，也不能有其他類似的菌種。

2、菌絲色澤要純正，多數種類的菌絲應純白、有光澤，原種、栽培種菌絲應連結成塊，無老化變色現象。

3、菌絲要粗壯，分枝多而密，接種到培養基吃料塊，生長旺盛。

4、培養體要濕潤，與試管（瓶）壁緊貼而不幹縮，含水適宜。

5、具有每品種特有的清香味，不可有霉、腐氣味。

❽ 黴菌檢測中與微生物檢測常見問題的分析

黴菌檢測中與微生物檢測常見問題的分析

黴菌：不是分類學上的名詞，而是一些絲狀真菌的通稱，屬真菌的一部分;其對人類具有雙重性，有利的方面是它可以用來釀造、工業發酵、抗生素和酶制劑的生產等，不利方面是它能引起農副產品、食品、原料及器材的腐爛，也感染並引起人類和動、植物的多種疾病，少數種類，如黃麴黴，能產生黃麴黴毒素，黃麴黴毒素是一種致癌物質，危害人、畜的健康和生命。因此，黴菌的檢測對於食品的安全性很重要。下面是我為大家帶來的關於黴菌檢測中與微生物檢測常見問題的分析的知識，歡迎閱讀。

檢測中的注意事項：

食品中常見的黴菌：毛霉屬、根霉屬、麴黴屬、青黴屬等。

1、 取樣的代表性。

2、 取樣工具的無菌。空氣中黴菌的孢子含量很高，所以，取樣的工具、容器等要經過嚴格的高壓滅菌。

3、 檢樣的方法。

（1）、由於黴菌易被攜帶，所以，檢樣時操作人員應盡量避免自身攜帶的可能。

（2）、樣品的均質及充分振搖。因為有些孢子是連成串的，故均質和振搖能使其充分散開，同時，在各梯度連續稀釋時，也要用滅菌吸管反復吹吸幾次，使孢子充分散開。

4、培養溫度和時間。培養溫度25—28℃培養，3天後觀察，需培養觀察一周。

黴菌檢驗中常用的培養基：孟加拉紅瓊脂、馬鈴薯葡萄糖瓊脂、察氏瓊脂、高鹽察氏瓊脂等。

檢樣中常見的問題：

（1） 不同稀釋度計數結果相同。

（2） 不生長或生長很好連成片無法計數。

原因：（1）稀釋時未經反復振搖，吹吸，導致孢子未充分散開，影響了計數的結果。

（2）由於培養基不適宜，PH值低等，致使生長較慢。

（3）觀察時間的掌握。真菌生長較慢，故需3d後才能觀察出結果。每天都要觀察結果。

微生物操作中常見問題的討論與分析：

1、 劃線獲得單個菌落的方法。劃不出單個菌落的原因：

（1） 平板上有過多的水分;

（2） 劃線時接種環未經反復灼燒。

（3） 多區劃線，三區或四區劃線。

2、 塗布和傾注的區別：

塗布利於觀察，但由於塗布棒上會帶有少量的菌液，影響計數的准確性。

塗布更為准確，但不利於觀察菌落的狀態。

3、 培養基配製時應注意的問題：

（1）滅菌溫度要嚴格控制，按照要求滅菌，尤其含糖量較高的培養基溫度不應太高，過高會導致糖分焦化，影響質量。

（2）瓊脂培養基不能反復溶化。反復溶化會破壞培養基中的營養成分。

（3）培養基不能反復滅菌，反復滅菌也會導致營養成分的破壞。

（4）含瓊脂的培養基滅菌後，要搖勻。

4、 平板的保存：大多數平板如VRBA、DC、、尿素酶生化管、顯色系列等要避光低溫保存。

5、 產品的保存：

（1） 乾粉培養基：避光乾燥，結塊後不能使用。

（2） 亞碲酸鉀卵黃增菌液、50%卵黃乳液等：冷凍保存，使用時，要常溫解凍，避免水浴加熱。

（3） 抗生素類：冷藏保存，溫度過高會導致靈敏度的下降。

（4） 兔血漿：冷藏保存少量的紅色不會影響結果。

6、 觀察時間的掌握：

按SN、GB等標准或培養基的.使用說明所述時間進行觀察，時間過短或時間過長，單菌落的特徵都不會很明顯。如單增李斯特氏菌顯色培養基，時間短單菌落看不到卵磷脂環，時間長綿羊李氏菌也會產生沉澱環。OXA、PALCAM的觀察也如此，時間過長，李氏菌使整個平板成黑色，不利於觀察單個菌落。

7、 添加劑的添加：

（1）溫度的掌握。卵黃和抗生素類添加的溫度都不應太高。

（2）定量。過多會抑制一些目標菌，太少又導致雜菌的過度生長。

8、 培養溫度的掌握：

（1）真菌類。25—28℃培養

（2）細菌類。李氏菌在增菌和生化中要求培養溫度在30℃左右。

（3）其他一般在36℃左右

9、 接種方法：常用的方法主要有劃線、三點接種、穿刺接種、傾注接種、塗布接種、液體接種。

10、革蘭氏染色方法：染色時間的掌握、沖洗的方法。

11、生化實驗：

（1）接種的方法

（2）氧化型和發酵型實驗操作

（3）陽性菌種的對照

（4）接種前的純化。挑取單個菌落進行一系列的生化。

12、關於殺菌的幾個概念：

（1）抑制：是在亞抑制劑量因子作用下導致微生物生長停止，但在移去這些因子後生長仍可以恢復的生物學現象。

（2）死亡：在致死劑量因子的作用下或在亞致死劑量因子長時間的作用下，導致微生物生長能力不可逆喪失，即使移去這種因子後生長仍不能恢復的生物學現象。

（3）防腐：在某些化學物質或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生長的一種措施，它能防止食物腐壞或防止食物霉變。

（4）消毒：利用某種方法殺死或滅活物質或物體中所有病原微生物的一種措施，它可以起到防止感染和傳播的作用。

（5）滅菌：利用某種方法殺死物體中包括芽孢在內的所有病原微生物的一種措施。

（6）化療：利用具有選擇毒性的化學物質，例磺胺、抗生素等對生物體內部被微生物感染的組織或病變細胞進行治療，以殺死組織內的病原微生物或病變細胞，但對有機體無毒害作用的治療措施。

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