凋亡檢測方法

㈠ 細胞凋亡的形態學檢測方法有哪些

形態學觀察方法:
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質濃縮,染色質成團塊狀,細胞表面有「出芽」現象.
2、丫啶橙（AO）染色,熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光,胞質呈紅色熒光.凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側,可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體.
3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂,台盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死.如果細胞膜完整,細胞不為台盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞.此方法對反映細胞膜的完整性,區別壞死細胞有一定的幫助.
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質緊實,細胞器集中,胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

㈡ 檢測細胞凋亡的方法有哪些

一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有「出芽」現象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，台盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為台盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。

二、DNA凝膠電泳
（一）檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特徵的雜亂片斷，利用此特徵可以確定群體細胞的死亡，並可與壞死細胞區別。

（二）結果判斷
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。

三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。

（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體；
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；
5、加酶的底物，測光吸收制。

（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。

四、流式細胞儀分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。

（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較准確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期

■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。

■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解後3.的羥基（－OH）端結合，經顯色反應後檢測DNA裂解點的技術。

DNA片段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation，ISNT）技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3－OH端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3－OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高於ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL為合適。

■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法
1、原理：在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露於細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。

2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。

3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早於DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。

㈢ 細胞凋亡的早期檢測方法有哪些

1、PS（磷脂醯絲氨酸）在胞外膜分布的檢測
PS從胞膜內側轉移到外側現象是在細胞凋亡的早期即可發生標志。AnnexinV是一種鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在胞膜外側的PS，使用熒光素標記的AnnexinV 蛋白（如Annexin V-FITC）即可檢測細胞凋亡。由於這是一種凋亡早期的活細胞檢測（懸浮細胞和貼壁細胞都適用），可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發展階段。操作簡便快速，10分鍾就可完成檢測。靈敏度高，可作為流式方法分析凋亡細胞的基礎。
2、細胞內氧化還原狀態改變的檢測
正常狀態下,谷胱甘肽（GSH）作為細胞內的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內有毒的氧化物通過被GSH還原而清除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產物的氧化損傷將由此被消化除。在細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉移系統。當細胞內GSH的排除非常活躍時，細胞液就由還原環境轉為氧化環境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C（三羧酸循環中的重要組分）從線粒體內轉移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯反應。
3、細胞色素C的檢測
細胞色素C作為一種信號物質，在細胞凋亡中發揮著重要的作用。正常情況下，它存在於線粒體內膜和外膜之間的腔中，而不存在於胞漿內。凋亡信號刺激後可使其從線粒體釋放到胞漿中，結合Apaf-1後而啟動caspase級聯活化反應，首先可激活caspase-9，後者再激活caspase-3和下游的其它caspase分子。凋亡發生的早期，細胞色素C泄漏到胞漿中，檢測胞漿中細胞色素c的含量可反映細胞的早期凋亡。
4、線粒體膜電位變化的檢測
在細胞凋亡的早期，線粒體在形態學上沒有明顯變化。但線粒體可發生很多生理生化的改變。例如在受到凋亡誘導後，線粒體的轉膜電位發生變化，導致膜穿透性改變。MitoSensorTM是一種陽離子染色劑，對此膜電位改變非常敏感，可呈現出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體跨膜電位改變，它則以單體形式停留於胞漿中，發出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。

㈣ 怎樣鑒定細胞凋亡

細胞凋亡的檢測

細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞凋亡形式，根據死亡細胞在形態學、生物化學和分子生物學上的差別，可以將二者區別開來。細胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹幾種常用的測定方法。

一、細胞凋亡的形態學檢測
根據凋亡細胞固有的形態特徵，人們已經設計了許多不同的細胞凋亡形態學檢測方法。
1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡
（1） 未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體。
貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
（2） 染色細胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割
成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態。
2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。
常用的DNA特異性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三種染料與 DNA的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T鹼基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用時用PBS稀釋成終濃度為2~5mg/ml。
DAPI為半通透性，用於常規固定細胞的染色。儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度，使用終濃度一般為0.5 ~1mg/ml。
結果評判：細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體(圖1)。
3 透射電子顯微鏡觀察
結果評判：凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細胞核內染色質高度盤繞，出現許多稱為氣穴現象（cavitations）的空泡結構(圖2)；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；細胞凋亡的晚期，細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。

二、磷脂醯絲氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂醯絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位於細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合。將Annexin-V進行熒光素（FITC、PE）或biotin標記，以標記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜而使細胞核紅染。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細胞以及死細胞區分開來。
方法
1 懸浮細胞的染色：將正常培養和誘導凋亡的懸浮細胞（0.5~1×106）用PBS洗2次，加入100ul Binding Buffer和FITC標記的Annexin-V（20ug/ml）10ul，室溫避光30min，再加入PI（50ug/ml）5ul，避光反應5min後，加入400ul Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測（一般不超過1h）， 同時以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作為陰性對照。
2 貼壁培養的細胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細胞。
3 爬片細胞染色：同上，最後用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進行觀察。
結果 [圖4、圖5]
注意事項
1. 整個操作動作要盡量輕柔，勿用力吹打細胞。
2. 操作時注意避光，反應完畢後盡快在一小時內檢測。

三、線粒體膜勢能的檢測
線粒體在細胞凋亡的過程中起著樞紐作用，多種細胞凋亡刺激因子均可誘導不同的細胞發生凋亡，而線粒體跨膜電位DYmt的下降，被認為是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特徵（染色質濃縮、DNA斷裂）出現之前，一旦線粒體DYmt崩潰，則細胞凋亡不可逆轉。
線粒體跨膜電位的存在，使一些親脂性陽離子熒光染料如Rhodamine 123、3，3-Dihexyloxacarbocyanine iodide[DiOC6（3）]、Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide[JC-1]、Tetramethyl rhodamine methyl ester(TMRM)等可結合到線粒體基質，其熒光的增強或減弱說明線粒體內膜電負性的增高或降低。
方法：將正常培養的細胞和誘導凋亡的細胞加入使用終濃度為Rhodamine 123（1mM）或終濃度為DiOC6（25nM），JC-1（1mM），TMRM（100nM），37°C平衡30min，流式細胞計檢測細胞的熒光強度。
注意事項
1． 始終保持平衡染液中pH值的一致性，因為pH值的變化將影響膜電位。
2． 與染料達到平衡的細胞懸液中如果含有蛋白，他們將與部分染料結合，降低染料的濃度，引起假去極化。

四、DNA片斷化檢測
細胞凋亡時主要的生化特徵是其染色質發生濃縮, 染色質DNA在核小體單位之間的連接處斷裂, 形成50~300kbp長的DNA大片段, 或180~200bp整數倍的寡核苷酸片段, 在凝膠電泳上表現為梯形電泳圖譜(DNA ladder)。細胞經處理後，採用常規方法分離提純DNA，進行瓊脂糖凝膠和溴化乙啶染色，在凋亡細胞群中可觀察到典型的DNA ladder。如果細胞量很少，還可在分離提純DNA後，用32P-ATP和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）使DNA標記，然後進行電泳和放射自顯影，觀察凋亡細胞中DNA ladder的形成。
1. 大分子染色體DNA片段的測定
細胞凋亡的早期,染色體斷裂成為50~300kbp長的DNA大片段。所有超過一定分子量大小的雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中的遷移速度相同。線性DNA的雙螺旋半徑超過凝膠半徑時，即達到分辨力的極限。此時凝膠不再按分子量的大小來篩分DNA，DNA像通過彎管一樣，以其一端指向電場一極而通過凝膠，這種遷移模式稱之為"爬行"。因此，細胞凋亡早期產生的50~300kbp長的DNA大片段不能用普通的瓊脂糖凝膠電泳來分離。通常採用脈沖電泳技術可圓滿地解決這一問題。這個方法是在凝膠上外加正交的交變脈沖電場。每當電場方向改變後，大的DNA分子便滯流在爬行管中，直至新的電場軸向重新定向後，才能繼續向前移動。DNA分子量越大，這種重排所需要的時間就越長。當DNA分子變換方向的時間小於電脈沖周期時，DNA就可以按其分子量大小分開。
參考文獻 Brown,D.G., Sun, X.M., and Cohen, G.M.(1993) Dexamethasone-inced apoptosis involves cleavage of DNA to large fragments prior to internucleosomal fragmentation. J. Biol.Chem. 268, 3037-3039
2． DNA Ladder 測定
方法：收獲細胞（1′107）沉澱?細胞裂解液?13000rpm′5min, 收集上清?1%SDS和RnaseA（5mg/ml）56°C，
2h?蛋白酶K（2.5mg/ml）37°C，2h?1/10體積3M醋酸鈉和2.5倍體積的冷無水乙醇沉澱DNA，4°C過夜?14000rpm′15min?最後將沉澱溶解在TE buffer中，加DNA Loading Buffer?1.2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色並照相。
結果：[圖6]
參考文獻 Herrmannm M, Lorenz HM, Voll R et al. A Rapid and simple method for the isolation of apoptotic DNA fragments. Nucleic Acid Res. 1994; 22:5506-5507
3． 凋亡細胞DNA含量的流式細胞計分析
方法：收集細胞?70%冷乙醇（in PBS）4°C固定過夜?PBS洗滌，1000rpm′10min?RNase A（0.5mg/ml）37°C消化30min?PI（50mg/ml）染色，室溫避光15min?FACScan分析DNA亞二倍體的形成及細胞周期的變化。
結果：[圖7]
4. ApoAlertTM LM-PCR Ladder Assay (CLONTECH)
優點：敏感度高，適合於檢測少量樣本，小部分凋亡細胞。如臨床活組織檢測。

五 TUNEL法
細胞凋亡中, 染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、鹼性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到DNA的3'-末端，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由於正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL實際上是分子生物學與形態學相結合的研究方法，對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能准確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特徵，可用於石蠟包埋組織切片、冰凍組織切片、培養的細胞和從組織中分離的細胞的細胞形態測定，並可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中被廣泛採用。

六、Caspase-3活性的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關鍵的執行分子，它在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在於胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。
1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及對底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。
方法：
收集細胞→PBS洗滌→抽提細胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→硝酸纖維素膜或PVDF膜轉移→5%脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2h或4°C過夜→Caspase-3多抗或單抗室溫反應1~2h或4°C過夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→HRP-標記的羊抗鼠IgG或AP標記的羊抗鼠IgG室溫反應1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL顯影或NBT/BCIP顯色。
結果：[圖8-1、圖8-2]
2 熒光分光光度計分析
原理：活化的Caspase-3能夠特異切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽鍵。根據這一特點，設計出熒光物質偶聯的短肽Ac-DEVD-AMC。在共價偶聯時，AMC不能被激發熒光，短肽被水解後釋放出AMC，自由的AMC才能被激發發射熒光。根據釋放的AMC熒光強度的大小，可以測定caspase-3的活性，從而反映Caspase-3被活化的程度。
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?制備細胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC（caspase-3四肽熒光底物）?37°C反應1h?熒光分光光度計（Polarstar）分析熒光強度（激發光波長380nm，發射光波長為430-460nm）。
結果：[圖9]
3 流式細胞術分析
方法：收獲細胞正常或凋亡細胞?PBS洗滌?加Ac-DEVD-AMC?37°C反應1h?UV流式細胞計分析caspase-3陽性細胞數和平均熒光強度。
結果：[圖10]

七、凋亡相關蛋白TFAR19蛋白的表達和細胞定位分析
TFAR19（PDCD5）是由本研究室在國際上首先報導的一個擁有自己知識產權的人類新基因，前期的功能研究表明，它是促進細胞凋亡的增強劑。利用熒光素（FITC）標記的TFAR19單克隆抗體為探針，對細胞凋亡過程中TFAR19蛋白的表達水平及定位研究發現，凋亡早期TFAR19表達水平增高並出現快速核轉位現象，伴隨著細胞核形態學的變化，持續較長時間，在凋亡小體中仍然可見。同時我們發現，凋亡早期TFAR19蛋白的核轉位早於磷脂醯絲氨酸（PS）外翻和細胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核轉位是細胞凋亡更早期發生的事件之一。進一步的研究證明，凋亡早期TFAR19的核轉位具有普遍意義，不同細胞凋亡早期均出現TFAR19高表達和核轉位。這為研究細胞凋亡早期所發生的事件，提供了一種新的技術和指標。
（一）TFAR19蛋白的細胞定位分析
材料試劑：
FITC標記的單克隆抗體，pH7.4 、0.15Mol/L PBS，3%的多聚甲醛，PBS-T（pH7.4 、0.15Mol/L PBS 含0.2% Tween 20），胎牛血清，熒光細胞洗液：pH7.4 、0.15Mol/L PBS含2%胎牛血清及0.1%NaN3 。FACS管，Tip頭，移液器。
儀器：低溫水平離心機, 37°C水浴箱，熒光顯微鏡，共聚焦激光掃描顯微鏡，流式細胞計
方法：
1 懸浮細胞的染色：
（1）收獲正常和誘導凋亡的細胞（0.5~1′106），PBS洗2次，1000rpm′10min。
（2）3%多聚甲醛冰浴10min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（3）加入PBS-T溶液，37°C孵育15min，PBS洗2次，1000rpm′10min。
（4）加入200ml胎牛血清，室溫反應30min。
（5）加入5ml FITC標記的TFAR19單抗（終濃度為1：40），4°C反應30min
（6）熒光細胞洗液洗2次，1000rpm′10min。
結果觀察：將細胞沉澱滴片，熒光顯微鏡及共聚焦激光顯微鏡下觀察TFAR19在細胞中的定位。同時用流式細胞計定量檢測TFAR19蛋白的平均熒光強度。[圖11]
2：貼壁細胞的原位染色
（1） 貼壁生長的對數期細胞鋪在24孔或6孔板中（內有潔凈蓋玻片），讓其爬片生長，待長到
50%~80%滿時，凋亡誘導劑處理細胞。
（2） 將不同時間點處理的細胞進行免疫熒光染色，染色步驟同上。
（3） 將染色的爬片細胞放於一張滴有少量甘油（5ml）的載玻片上，熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描顯微
鏡觀察TFAR19在細胞中的定位。
結果觀察：[圖12]
3：臨床病理切片的染色、檢測。
4：原代細胞的培養、檢測。
5：分析TFAR19蛋白在人體內各組織器官的分布及定位
（二）TFAR19蛋白的表達與臨床疾病
1． ELISA法檢測正常人和疾病狀態下，以及疾病的不同時期，血清中TFAR19蛋白水平及其TFAR19自身抗體水平。
材料和試劑：
1. 包被Buffer: pH9.6, 0.05Mol/L碳酸鹽Buffer
2. 洗滌液： pH7.4, 0.15Mol/L PBS 含0.05% Tween 20
3. 封閉液： 3%BSA（用洗滌液配製）
4. 酶標抗體的稀釋：用封閉液稀釋
5. OPD底物Buffer：Na2HPO4.12H2O 1.84g
檸檬酸 0.51g
DDW 100ml
6. 顯色液（現配現用）：底物Buffer 10ml
OPD 2mg
30% H2O2 2ml
7. 終止液 2Mol/L H2SO48. 重組人TFAR19, HRP標記的羊抗人IgG9. ELISA板, Tip, 移液器，ELISA
Reader（OD490nm），洗板機
操作步驟
1. 用包被Buffer稀釋的重組人TFAR19（1mg/ml）包被ELISA板, 100ml/well, 37°C孵育2h或4°C過夜（一般24h以上）。
2. 洗滌Buffer洗板三次，加入封閉液，200 ml/well ， 37°C孵育2h或4°C
過夜。
3. 洗滌Buffer洗板三次，加入不同稀釋度的病人血清（3個重復孔）100ml/well ，37°C孵育1h。設包被Buffer、洗滌Buffer 、封閉液為陰性對照。
4. 洗滌Buffer洗板三次，加入1：2500稀釋的HRP標記的抗人IgG, 100ml/well，37°C孵育1h。
5. 洗滌Buffer洗板三次，加入顯色液，100 ml/well，避光反應10~15min。
6. 加入H2SO4終止反應，50 ml/well。
7. ELISA Reader 讀取OD490 光密度值，分析和比較病人血清和正常血 清中TFAR19自身抗體的表達水平。
2． Western blot 分析原發性腫瘤細胞和正常細胞的TFAR19蛋白的表達水平。

來源（北京大學人類疾病研究中心）：
http://gene.bjmu.e.cn/news/apoptosis.htm

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細胞壞死的鑒定

細胞壞死是因病理而產生的被動死亡，如物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等均導致細胞壞死。壞死細胞的膜通透性增高，致使細胞腫脹，細胞器變形或腫大，早期核無明顯形態學變化，最後細胞破裂。另外壞死的細胞裂解要釋放出內含物，並常引起炎症反應；在癒合過程中常伴隨組織器官的纖維化，形成瘢痕。

㈤ 細胞凋亡檢測方法都有什麼呢

這個問題應該是生物免疫學方面的問題。細胞凋亡檢測方法有很多種，我們最常見的就是染色光鏡觀察法，把細胞放到特定的染色劑中，一段時間後在光鏡下觀察，可以看到凋亡細胞呈團塊狀。還有一個方法是DNA觀察，正常的細胞DNA是完整的排列，凋亡的細胞DNA排列是斷裂的，這一點可以明顯的觀察到，靠這個方法也可以判斷。用透射電鏡觀察，凋亡細胞形狀是新月形的。

㈥ 細胞凋亡最常用的方法檢測方法有哪些

一、形態學觀察方法二、DNA凝膠電泳三、酶聯免疫吸附法四、流式細胞儀定量分析

㈦ 細胞凋亡的檢測方法及指標

哥們，大學翟中和版的細胞生物學裡面就有，很全很詳細，似乎就在講癌細胞的那一章，你去翻翻看，不會讓你失望的

㈧ 細胞凋亡檢測方法有哪些

細胞凋亡的形態學檢測

1 光學顯微鏡和倒置顯微鏡

(1) 未染色細胞:凋亡細胞的體積變小、變形,細胞膜完整但出現發泡現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體.

貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落.

(2) 染色細胞:常用姬姆薩染色、瑞氏染色等.凋亡細胞的染色質濃縮、邊緣化,核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態.

2 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況.

常用的DNA特異性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342),HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI.三種種染料與DNA的結合是非嵌入式的,主要結合在DNA的A-T鹼基區.紫外光激發時發射明亮的藍色熒光.

Hoechst是與DNA特異結合的活性染料,儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用時用PBS稀釋,終濃度為10 ug/ml.

DAPI為半通透性,用於常規固定細胞的染色.儲存液用蒸餾水配成1mg/ml的濃度,使用終濃度一般為10 ug/ml.

結果評判:細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期:Ⅰ期的細胞核呈波紋狀(rippled)或呈折縫樣(creased),部分染色質出現濃縮狀態;Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體(圖1).

3 透射電子顯微鏡觀察

結果評判:凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮.凋亡Ⅰ期(pro-apoptosis nuclei)的細胞核內染色質高度盤繞,出現許多稱為氣穴現象(cavitations)的空泡結構(圖2);Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化;細胞凋亡的晚期,細胞核裂解為碎塊,產生凋亡小體.

㈨ 簡述幾種檢測細胞凋亡的生化方法及它們原理。

最簡單的方法是放在顯微鏡下觀察，凋亡的細胞和正常的細胞形態不同，凋亡細胞形態書上有