單克隆抗體檢測方法

A. 單克隆抗體等電點如何檢測

做等電聚焦電泳(isoelectric focusing electrophoresis,IEF)

B. 單克隆抗體的鑒定實驗

1．雜交瘤細胞染色體的檢查採用秋水仙素裂解法進行。2．單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標准抗血清，採用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型的試劑盒說明書 1、首先將試劑盒恢復室溫（大約30分），然後用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。
2、取出酶標板。每個標本需要6孔，陽性對照6孔。多餘的用自封袋保存，記得放入乾燥劑。
3、將細胞培養上清（或特異親和純化的抗體）50μl加入酶標微孔板，每個標本加6孔，陽性對照也是加6孔每孔50μl。然後每孔再加入50μl標本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
4、棄去板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。再在每個標本的6孔中分別加入6種酶標二抗各100μl，通用陽性對照的6孔也一樣。在加樣圖上或酶標板上做好標記。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
5、吸棄板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鍾。
6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結果，看顯色藍的那個孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。更可將反應終止液（每孔50μl）終止反應後用酶標儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結果，參看高值孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。陽性對照0D小於0.5實驗無效，需要重做。 1、雖然本試劑盒過期後很久還有使用價值但還是請您在有效期內使用。
2、在檢測腹水類單抗時要稀釋到1/5萬，雖然可以分辨但並不建議您這樣做。此類樣品成分十分復雜，有干擾結果的可能。在此種情況下您可以選擇本公司的C030215抗體鑒定試劑。它會給您帶來滿意的結果。
3、手洗板子時一定要把孔加滿，停留10秒然後棄盡，最後要拍干凈。特別是在酶標二抗溫育後洗板時一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個在手工洗板時對結果很重要。
4、一次沒用完的板子要帶乾燥劑放自封袋封好，隨盒存放。
5、拿放板子時不要劇烈抖動，以免孔間交叉污染出現錯誤結果。
6、出現異常結果請隨時咨詢我們。
3．單抗的特異性鑒定可以採用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等。
4．單抗的效價測定可採用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。採用凝集反應，腹水效價可達5×104。而採用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。
5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。

C. 單克隆抗體制備的基本原理與過程有什麼意義

單克隆抗體制備的原理：

B淋巴細胞在抗原的刺激下,能夠分化、增殖形成具有針對這種抗原分泌特異性抗體的能力、B細胞的這種能力和量是有限的,不可能持續分化增殖下去，因此產生免疫球蛋白的能力也是極其微小的、將這種B細胞與非分泌型的骨髓瘤細胞融合形成雜交瘤細胞，再進一步克隆化，這種克隆化的雜交瘤細胞是既具有瘤的無限生長的能力，又具有產生特異性抗體的B淋巴細胞的能力，將這種克隆化的雜交瘤細胞進行培養或注入小鼠體內即可獲得大量的高效價、單一的特異性抗體.這種技術即稱為單克隆抗體技術。

單克隆抗體制備的過程：

1. 免疫動物

   免疫動物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產生致敏B淋巴細胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預先制定的免疫方案進行免疫注射。 抗原通過血液循環或淋巴循環進入外周免疫器官，刺激相應B淋巴細胞克隆，使其活化、增殖，並分化成為致敏B淋巴細胞。

2. 細胞融合

   採用二氧化碳氣體處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內擠壓研磨，制備脾細胞懸液。 將准備好的同系骨髓瘤細胞與小鼠脾細胞按一定比例混合，並加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細胞可與骨髓瘤細胞發生融合，形成雜交瘤細胞。

3. 選擇性培養

   選擇性培養的目的是篩選融合的雜交瘤細胞，一般採用HAT選擇性培養基。在HAT培養基中，未融合的骨髓瘤細胞因缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，不能利用補救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細胞雖具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，但其本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細胞由於從脾細胞獲得了次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖轉移酶，並具有骨髓瘤細胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養基中存活和增殖。

4. 雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

   在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常採用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。採用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，並進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量後，及時進行凍存。

5. 單克隆抗體的大量制備

   單克隆抗體的大量制備主要採用動物體內誘生法和體外培養法。

   (1)體內誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進行預處理。1-2周後，腹腔內接種雜交瘤細胞。雜交瘤細胞在小鼠腹腔內增殖，並產生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

   (2)體外培養法 將雜交瘤細胞置於培養瓶中進行培養。在培養過程中，雜交瘤細胞產生並分泌單克隆抗體，收集培養上清液，離心去除細胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產生的抗體量有限。各種新型培養技術和裝置不斷出現，大大提高了抗體的生產量。

單克隆抗體制備的意義：

用於以下各種生命科學實驗並具有醫用價值

（1）沉澱反應：Precipitation reaction

（2）凝集實驗：haemaglutination

（3）放射免疫學方法檢測免疫復合物

（4） 流式細胞儀：用於細胞的分型和細胞分離.

（5）ELISA 等免疫學檢測

（6）BIAcore biosensor:檢測Ab-Ag或與蛋白的親和力 .

（7）免疫印記（western blotting)

（8） 免疫沉澱：

（9） 親和層析：分離蛋白質

（10） 磁珠分離細胞

（11）臨床疾病的診斷和治療；

D. 要獲得一個基因的單克隆抗體，怎樣設計實驗方案

下面是通過原核表達系統得到基因表達的產物以及制備多克隆抗體的一種方法：
1.得到目的基因：設計引物（引物上帶有酶切位點）→進行PCR,膠回收,酶切,再膠回收,得到帶有粘性末端的目的基因→將目的片段連接到具有相同粘性末端的PET載體上
2．得到目的蛋白：將連接好的帶有目的片段的載體轉入到DH5α菌系中,將菌塗布與相應的抗性LB培養過夜→挑菌→接到相應抗性的液態LB中,搖菌過夜→提取質粒,進行PCR鑒定與酶切鑒定確定轉入的不是空質粒→送測→將的到地帶有目的蛋白基因的質粒轉入到BL21（DE3）菌系中→誘導表達蛋白→進行SDS-PAGE檢測是否表達出正確大小目的蛋白→大量誘導→得到表達蛋白的DE3
3.純化目的蛋白：將菌進行超聲破碎→引用Ni-His結合樹脂4℃結合過夜→應用不同洗液洗脫得到純化的目的蛋白→應用BSA對蛋白含量進行定量
4.應用得到的純化目的蛋白150mg目的蛋白+弗氏完全佐劑對兔子進行一免,以後每次應用150mg目的蛋白+弗氏不完全佐劑加強免疫2-3次（兩周加強一次）→最後一次免疫10天後采血→這樣就制備得到兔高免血清
5.純化抗體（可做可不做）：應用抗體純化試劑盒對得到的血清進行純化,得到純化的兔免目的蛋白的多克隆抗體

E. 如何用單克隆抗體進行疾病診斷

為研製一種特異性強、靈敏度高、操作簡便快速的甲胎蛋白（AFP）單克隆抗體酶聯免疫診斷試劑盒，用於定量檢測血清中的AFP。方法 將自行研製的AFP單克隆抗體（AFP-McAb）標記辣根過氧化物酶，AFP多抗（AFP-PcAb）包被微孔反應板，研製成AFP單克隆抗體酶聯免疫診斷試劑盒。血清中的AFP與包被於微孔板上的AFP多抗結合，再與AFP酶標抗體結合，在TMB底物液作用下形成肉眼可見的藍色。結果 該診斷試劑盒對305份臨床病人血清進行了檢測，結果與放射免疫法相比總符合率為98．6％；對215份臨床病人血清進行檢測，結果與化學發光法相比總符合率為99

F. 單克隆抗體制備過程中的專一抗體檢測陽性的檢測原理是什麼

專一性抗體是只針對一種抗原的抗體。
陰性指檢測沒有反應，陽性指檢測有反應。如果單一抗體陽性就是有反應的，指示你疑似患該病了。。。

G. 單克隆抗體酶標絨毛膜促性腺激素檢測法是什麼方法

就是用查早早孕的試紙條來檢測的那種啊，知識 說發專業了一點。

H. 單克隆抗體技術怎樣鑒別植物病毒

運用細胞融合技術，將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞雜交，產生雜交瘤細胞。其增殖能力很強，可在體外連續培養產生抗體。選擇其中能產生某單一抗體的細胞株，所產抗體稱「單克隆抗體」。單克隆抗體靈敏度和專一性比多克隆抗體高，而且可以穩定地再繁殖，無需再用免疫動物，因此被廣泛應用於植物病毒等病原的檢測和鑒定。目前已有多種園藝花卉植物病毒的單克隆抗體應用於病毒的鑒定和檢測。

I. 單克隆抗體中兩次篩選分別是什麼方法

第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞，用連續注射抗原，下面具體介紹一下：

1、在實際免疫過程中，由於採用連續注射抗原的方法，且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞，因此，從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的，經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異，所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞；

2、通常採用有限稀釋克隆細胞的方法，將雜交瘤細胞多倍稀釋，接種在多孔的細胞培養板上，使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時，才能保證有些孔中是單個細胞），再由這些單細胞克隆生長，最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養。

拓展資料：

單克隆抗體是由單一B細胞克隆產生的高度均一、僅針對某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常採用雜交瘤技術來制備，雜交瘤（hybridoma）抗體技術是在細胞融合技術的基礎上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。

參考資料：單克隆抗體網路：網頁鏈接