無菌檢測方法對比試驗

⑴ 醫療器械的無菌檢查法

無菌檢查是不能用固體培養基的，要用硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁液體培養基，最好用薄膜過濾法。
請參考國標：
GB/T14233.2-2005

⑵ 無菌室潔凈度檢測方法及標準是什麼

無菌室是指將必定空間范圍內之空氣中的微粒子、有害空氣、細菌等之污染物掃除，並將室內之溫度、潔凈度、室內壓力、氣流速度與氣流分布、噪音振動及照明、靜電控制在某一需求范圍內，而所給予特別規劃之房間

隨著我國醫葯行業GMP制度的逐步施行,空氣潔凈技術被廣泛地應用於制葯企業、醫院制劑室、手術室等醫葯衛生領域。因而,普及潔凈度的常識,加強潔凈度的檢測作業,提高潔凈室維護管理的知道,在當前實際作業中就顯得尤為重要。現在,檢測懸浮粒子所用的檢測儀器基本上使用各種類型的塵埃粒子計數器,其性能指標均迥然不同,基本上能契合檢測要求。對潔凈室測驗中一般依據潔凈室的面積、潔凈度的等級確認采樣點數目、方位和采樣量等多因素來決定的。那麼，在潔凈室測驗中簡單呈現哪些問題呢?

1、風速與換氣次數：當潔凈作業台凈化過濾器規劃定型後、房間體積呈固定狀態，依據所測得的風速，就可以核算換氣次數。有的企業只尋求風速大，導致換氣次數太高，過濾器阻尼層被擊穿，塵粒數超支。但如果風速太小，又會使得作業人員使得呼吸不適，對身體產生欠安影響。

2、壓差：空氣潔凈等級不同的相鄰房間之間的靜壓差應大於5Pa，潔凈車間(區)與室外大氣的靜壓差應大於10Pa，並應有指示壓差的裝置。有些單位把靜壓差調得太高（如40～50Pa），使作業人員感到身體不適。而關於有些產塵較大的房間，與相鄰同等級的房間的靜壓差應為負值，才幹有用控制塵粒數。維持室內正壓是一個重要的阻隔手段。

3、 聲級：我們發現，潔凈作業台有些老廠房改造後，其他項目均契合有關規定，但關於聲級的控制卻時常把握欠好。噪音在靜態下，約在60～70dB，動態下將超過70dB，長期處於這樣的環境下會對人體產品影響，是不利於生產的。

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CW-HPC300三通道高精度手持式激光塵埃粒子計數器是深圳賽納威依據國際標准ISO14644-1和GMP設計，有中英文版本可供選擇，能同時對三個粒徑檔（用戶可任意設定待測粒徑）進行檢測，並能通過USB介面高速下載，可廣泛應用於電子工業和制葯工業中的無塵車間環境檢測、室內環境檢測、過濾器效率分析測試、檢查污染源分析、粒徑分布分析等。

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⑶ 無菌檢查和微生物限度檢查的區別

1、檢驗方法不同

（1）無菌檢查是指對葯典規定的葯品、敷料、縫線、無菌器具等品種進行無菌檢查的方法。

（2）微生物限度檢查是檢查非處方殺菌劑及其原料、輔料的微生物污染程度的一種方法。

2、檢驗要求環境不同

（1）無菌檢查是在潔凈的A級單向流通空氣區或隔離系統中進行的。整個過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染。必須驗證單向氣流區域和工作台的清潔度。生物製品的無菌檢驗按照《中國生物製品規程》中有關無菌檢驗的規定執行。

（2）微生物限度檢查：微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級以下的局部潔凈度100級的單向氣流區進行。整個檢驗過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染。

3、判斷結果方法不同

（1）用需氣菌、厭氣菌培養基4管及真菌培養基2管，分別接種金黃色葡萄球菌、產孢梭菌和白色念珠菌。將一管添加到規定數量的試驗產品中，並將所有培養基管放置在規定溫度下3-5天。如果微生物在每種培養基24小時內生長良好，則試樣沒有抑菌作用。

（2）微生物限度檢查：被檢培養基平均菌落數與對照培養基平均菌落數之比大於70%，菌落大小應與對照培養基相同。確定該介質的適用性符合規定。

⑷ 無菌要檢驗方法須進行方法學驗證嗎

微生物限度檢查法系檢查非規定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法.檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控制菌檢查. 微生物限度檢查應在環境潔凈度10000級下的局部潔凈度 100級的單向流空氣區域內進行.檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作,防止再污染,防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出.單向流空氣區域、工作檯面及環境應定期按《醫工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標准進行潔凈度驗證. 供試品檢查時,如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑,應證明其有效性及對微生物無毒性. 除另有規定外,本檢查法中細菌及控制菌培養溫度為30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養溫度為23℃～28℃. 檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為單位報告,特殊品種可以最小包裝單位報告. 檢驗量檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）. 除另有規定外,一般供試品的檢驗量為10g 或10ml；膜劑為100cm2；貴重品、微量包裝品的檢驗量可以酌減.要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用於陽性對照試驗）. 檢驗時,應從2 個以上最小包裝單位中抽取供試品,膜劑還不得少於4 片. 一般應隨機抽取不少於檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3 倍量供試品. 供試液的制備根據供試品的理化特性與生物學特性,採取適宜的方法制備供試液.供試液制備若需加溫時,應均勻加熱,且溫度不應超過45℃.供試液從制備至加入檢驗用培養基,不得超過1 小時. 除另有規定外,常用的供試液制備方法如下. 1.液體供試品取供試品10ml,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,混勻,作為1∶10 的供試液.油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻.水溶性液體制劑也可用混合的供試品原液作為供試液. 2.固體、半固體或黏稠性供試品取供試品10g,加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為1∶10 的供試液.必要時加適量的無菌聚山梨酯80,並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻. 3.需用特殊供試液制備方法的供試品 (1)非水溶性供試品方法1 取供試品5g（或5ml）,加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中,用無菌玻棒攪拌成團後,慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1∶20 的供試液. 方法2 取供試品10g,加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（採用薄膜過濾法過濾除菌.選用孔徑為0.22μm的脂溶性濾膜,在140℃乾熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解.然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液100ml,振搖5～10 分鍾,萃取,靜置使油水明顯分層,取其水層作為1∶10 的供試液. (2)膜劑供試品取供試品100cm2,剪碎,加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（必要時可增加稀釋液）,浸泡,振搖,作為1∶10 的供試液. (3)腸溶及結腸溶制劑供試品取供試品10g,加pH6.8 無菌磷酸鹽緩沖液（用於腸溶制劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩沖液（用於結腸溶制劑）至100ml,置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1∶10 的供試液. (4)氣霧劑、噴霧劑供試品取規定量供試品,置冰凍室冷凍約1 小時,取出,迅速消毒供試品開啟部位,用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔,放至室溫,並輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出.用無菌器吸出全部液,加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液（若含非水溶性成分,加適量的無菌聚山梨酯80）中,混勻,取相當於10g或10ml 的供試品,再稀釋成1∶10 的供試液. (5)貼劑供試品取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上.用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起.然後將其置於適宜體積並含有表面活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中,用力振盪至少30 分鍾,製成供試液.貼劑也可以其他適宜的方法制備成供試液. (6)具抑菌活性的供試品當供試品有抑菌活性時,採用下列方法進行處理,以消除供試液的抑菌活性後,再依法檢查.常用的方法如下. ①培養基稀釋法 取規定量的供試液,至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少,至不含抑菌作用.測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時,取同稀釋級的供試液2ml,每1ml 供試液可等量分注多個平皿,傾注瓊脂培養基,混勻,凝固,培養,計數.每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為1ml的菌落數,計算每1ml 供試液的平均菌落數,按平皿法計數規則報告菌數；控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量. ②離心沉澱法 取一定量的供試液, 500 轉/分鍾離心3 分鍾,取全部上清液混合,用於細菌檢查. ③薄膜過濾法 見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的「薄膜過濾法」. ④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品,可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分.中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養基中. 細菌、黴菌及酵母菌計數計數培養基的適用性檢查細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養基應進行培養基的適用性檢查,成品培養基、由脫水培養基或按培養基處方配製的培養基均應檢查. 菌種 試驗用菌株的傳代次數不得超過5 代（從菌種保存中心獲得的冷凍乾燥菌種為第0 代）.並採用適宜的菌種保藏技術進行保存,以保證試驗菌株的生物學特性. 大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕黑麴黴（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基或營養瓊脂培養基中,培養18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基或改良馬丁瓊脂培養基中,培養24～48 小時.上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含菌數為50～100cfu 的菌懸液.接種黑麴黴的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基中,培養5～7 天,加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫.然後,採用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含孢子數50～100cfu 的孢子懸液. 菌懸液在室溫下放置應在2 小時內使用,若保存在2～8℃可在24 小時內使用.黑麴黴孢子懸液可保存在2～8℃,在驗證過的貯存期內使用. 適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注營養瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置30～35℃培養48 小時,計數；取白色念珠菌、黑麴黴各50～100cfu,分別注入無菌平皿中,立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數；取白色念珠菌50～100cfu,注入無菌平皿中,立即傾注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,平行制備2 個平皿,混勻,凝固,置23～28℃培養72 小時,計數.同時,用相應的對照培養基替代被檢培養基進行上述試驗. 結果判定 被檢培養基上的菌落平均數與對照培養基上的菌落平均數的比值大於70%,且菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致,判該培養基的適用性檢查符合規定. 計數方法的驗證當建立產品的微生物限度檢查法時,應進行細菌、黴菌及酵母菌計數方法的驗證,以確認所採用的方法適合於該產品的細菌、黴菌及酵母菌數的測定.若產品的組分或原檢驗條件發生改變可能影響檢驗結果時,計數方法應重新驗證. 驗證時,按供試液的制備和細菌、黴菌及酵母菌計數所規定的方法及下列要求進行.對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證. 菌種及菌液制備 同計數培養基的適用性檢查. 驗證方法 驗證試驗至少應進行3 次獨立的平行試驗,並分別計算各試驗菌每次試驗的回收率. （1）試驗組 平皿法計數時,取試驗可能用的最低稀釋級供試液1ml 和50～100 cfu 試驗菌,分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基,每株試驗菌平行制備2個平皿,按平皿法測定其菌數.薄膜過濾法計數時,取規定量試驗可能用的最低稀釋級供試液,過濾,沖洗,在最後一次的沖洗液中加入50～100cfu 試驗菌,過濾,按薄膜過濾法測定其菌數. （2）菌液組 測定所加的試驗菌數. （3）供試品對照組 取規定量供試液,按菌落計數方法測定供試品本底菌數. （4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時,應增加稀釋劑對照組,以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度.試驗時,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml 供試液含50～100cfu,按試驗組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數. 結果判斷 在3 次獨立的平行試驗中,稀釋劑對照組的菌回收率（稀釋劑對照組的平均菌落數占菌液組的平均菌落數的百分率）應均不低於70%.若試驗組的菌回收率（試驗組的平均菌落數減去供試品對照組的平均菌落數的值占菌液組的平均菌落數的百分率）均不低於70%,照該供試液制備方法和計數法測定供試品的細菌、黴菌及酵母菌數；若任一次試驗中試驗組的菌回收率低於70%,應採用培養基稀釋法、離心沉澱法、薄膜過濾法、中和法（表1）等方法或聯合使用這些方法消除供試品的抑菌活性,並重新進行方法驗證. 表1 常見干擾物的中和劑或滅活方法干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 戊二醛 亞硫酸氫鈉 酚類、乙醇、吸附物 稀釋法 醛類 稀釋法、甘氨酸、硫代硫酸鹽 季銨類化合物（QACs）、對羥基苯甲酸酯 卵磷脂、聚山梨酯 汞類制劑 亞硫酸氫納、巰基乙酸鹽、硫代硫酸鹽 雙胍類化合物 卵磷脂 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 干擾物 可選用的中和劑或滅活方法 鹵化物 硫代硫酸鹽 乙二胺四乙酸（EDTA） 鎂或鈣離子 磺胺類 對氨基苯甲酸 ?-內醯胺類抗生素 ?-內醯胺酶 若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用,那麼驗證試驗中微生物回收的失敗可看成是因供試品的抗菌活性引起的,同時表明該供試品不能被試驗菌污染.但是,供試品也可能僅對試驗用菌株具有抑製作用,而對其他菌株沒有抑製作用.因此,根據供試品須符合的微生物限度標准和菌數報告規則,在不影響檢驗結果判斷的前提 下,應採用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗.若驗證試驗符合要求,應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗. 計數方法驗證時,採用上述方法若還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那麼選擇回收情況最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢驗. 驗證試驗也可與供試品的細菌、黴菌及酵母菌計數同時進行. 供試品檢查計數方法包括平皿法和薄膜過濾法.檢查時,按已驗證的計數方法進行供試品的細菌、黴菌及酵母菌菌數的測定. 按計數方法的驗證試驗確認的程序進行供試液制備.用稀釋液稀釋成1∶10、1∶102、1∶103等稀釋級的供試液. 1.平皿法根據菌數報告規則取相應稀釋級的供試液1ml,置直徑90mm 的無菌平皿中,注入15～20ml 溫度不超過45℃的溶化的營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基,混勻,凝固,倒置培養.每稀釋級每種培養基至少制備2 個平板. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml,置無菌平皿中,注入培養基,凝固,倒置培養.每種計數用的培養基各制備2 個平板,均不得有菌生長. 培養和計數 除另有規定外,細菌培養3 天,黴菌、酵母菌培養5 天.逐日觀察菌落生長情況；點計菌落數.必要時,可適當延長培養時間至7 天進行菌落計數並報告.菌落蔓延生長成片的平板不宜計數.點計菌落數後,計算各稀釋級供試液的平均菌落數,按菌數報告規則報告菌數.若同稀釋級兩個平板的菌落平均數不小於15,則兩個平板的菌落數不能相差1 倍或以上. 一般營養瓊脂培養基用於細菌計數；玫瑰紅鈉瓊脂培養基用於黴菌及酵母菌計數；酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基用於酵母菌計數.在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有黴菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計黴菌和酵母菌、細菌菌落數.然後將營養瓊脂培養基上的黴菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的黴菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數高的培養基中的菌數為計數結果. 含蜂蜜、王漿的液體制劑,用玫瑰紅鈉瓊脂培養基測定黴菌數,用酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基測定酵母菌數,合並計數. 菌數報告規則 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數小於300cfu、黴菌宜選取平均菌落數小於100cfu 的稀釋級,作為菌數報告（取兩位有效數字）的依據.以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數的值報告1g、1mL 或10cm2 供試品中所含的菌數. 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均菌落數小於1 時,以＜1 乘以最低稀釋倍數的值報告菌數. 2.薄膜過濾法採用薄膜過濾法,濾膜孔徑應不大於0.45μm,直徑一般為50mm,若採用其它直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整.選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留.濾器及濾膜使用前應採用適宜的方法滅菌.使用時,應保證濾膜在過濾前後的完整性.水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜.油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分乾燥.為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面.供試液經薄膜過濾後,若需要用沖洗液沖洗濾膜,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml,以避免濾膜上的微生物受損傷. 取相當於每張濾膜含1g、1ml 或10cm2 供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾；若供試品每1g、1ml 或10cm2 所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml 進行試驗.用pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量同「計數方法的驗證」.沖洗後取出濾膜,菌面朝上貼於營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養基平板上培養.每種培養基至少制備一張濾膜. 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml 照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照.陰性對照不得有菌生長. 培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100 個. 菌數報告規則 以相當於1g、1ml 或10cm2 供試品的菌落數報告菌數；若濾膜上無菌落生長,以

⑸ 進行菌種質量檢測的常用方法有哪些

菌種質量檢測的目標包括菌絲形態、菌落特徵以及子實體形態等方面。質量檢測常用方法如下：

（1）建立標準的培養和觀察方法

對於一個栽培品種各菌種的質量檢測，實際上是以該品種典型的生物學特性（包括形態特徵、生理生態特性、栽培習性）為參照標准進行比較，以檢驗菌種是否存在品種退化、菌種老化、病菌侵染、雜菌污染和品種混雜等質量問題。同時，菌種質量檢測不僅要考慮從哪些方面來評價一個菌種的質量優劣，也要考慮用怎樣的標准方法對菌種質量進行評價的問題。因為一定的結果來源於一定的方法和一定的條件。方法和條件不同，結果就失去了可比性，也就無法鑒別，因此，需要建立標准。這些標准包括：培養基、培養條件（溫度、濕度、pH、光照等）、菌種的菌齡等。

（2）連續觀察

在菌種生長過程中，要連續觀察，一切不正常的現象只有在生長過程中才能表現出來。而當菌種長滿培養基表面後，其不正常現象往往會被菌種的過齡而掩蓋。

（3）宏觀檢查

對食用菌母種、原種及栽培種的宏觀檢查要根據其培養特徵來進行（參見前述有關內容），這是菌種生產者及使用者普遍使用的方法，簡單易行，但需要有多年的從業經驗與技術沉澱。如被檢菌種表現出菌落生長速度不一致、氣生菌絲變稀疏或出現扇變菌落、菌落上過早出現色素、或不同特徵的菌落混雜共存、或菌落上出現黑褐色、青灰色、黃褐色或紅色的孢子堆，均可以確定該菌種存在質量問題。優質菌種外觀菌絲潔白、密集粗壯，生長速度一致，齊發並進。

在生產實踐中，廣大菇農和專業工作人員總結出「純、正、壯、潤、香」的質量檢查方法。這種應用感官識別菌種優劣，是經驗的總結，能大致、快速地鑒定出菌種的優劣。具體方法是：

「純」指菌種的純度高，無雜菌感染，無斑塊、無抑制線，無「退菌」、「斷菌」現象等。

「正」指菌絲無異常，具有親本正宗的特徵，如菌絲純白、有光澤，生長整齊，連結成塊，具彈性等。

「壯」指菌絲發育粗壯，長勢旺盛，分枝多而密，在培養基上恢復、定植、蔓延速度快。

「潤」指菌種含水量適中，基質濕潤，與瓶壁緊貼，瓶頸略有水珠，無干縮、鬆散現象。

「香」指具該品種特有的香味，無霉變、腥臭、酸敗氣味。

通過檢測各種食用菌菌絲生長的色澤、速度、均勻度等特徵是否正常，來判斷菌種生長是否正常、是否可用，但辨別不了是否優質高產。

（4）顯微鏡檢查

對菌絲體進行顯微觀察，可以確定菌絲粗細、分枝、隔膜、鎖狀聯合等特性是否均一，是否與該栽培品種的典型特徵一致（參見前述相關內容）。具有不同形態特徵的菌絲體存在於同一菌種體中，表明該菌種存在質量問題；如果出現菌絲體重寄生現象，常表現出不同特徵的菌絲體相互纏繞，或菌絲體中空變細，或在寄生點出現吸器等不正常現象。

鏡檢的方法是：挑取少量菌絲，置載玻片中央的水滴上，用解剖針或接種針撥散，蓋上蓋玻片，也可加碘酒或美藍等染色後進行鏡檢。正常的菌絲一般透明、分枝狀，有橫隔和明顯的鎖狀聯合；異宗結合的食用菌，如僅有單核菌絲，不具結實性，不宜作菌種用；雙核菌絲中，鎖狀聯合多而密，則結菇力強，一般可認為是好菌種。如：

①雙孢菇 觀察雙孢菇單孢子萌發後的菌絲生長形態。凡菌絲潔白、健壯，保存時間較長時菌絲顏色不變，較耐28℃以上氣溫，生長在基質上平貼培養基表面，氣生菌絲不多的，為同化能力較強，產量較高的菌株。相反，菌絲生長初期好，很快變黃變稀，如蜘蛛絲一樣，長出培養基表面菌絲較多的菌株產量較低。

②香菇 觀察香菇的雙核菌絲，在斜面培養基上生長速度達到1.2厘米/天以上的，菌絲不十分粗壯和潔白，鎖狀連合頻繁，鎖狀連合在菌絲間相距較近，且在觀察面上分布均勻，一般均是高產和抗雜能力較強的菌株。香菇出菇的密度與鎖狀連合有一定關系。

③草菇 觀察草菇菌絲，發現菌絲分枝角度大的，出菇率高，產量高。菌絲分枝角度小、平行排列的，產量低。

各種食用菌的菌絲生長是否正常、是否可用，一般都以色澤、速度、均勻度等特徵加以檢測，但這並不能說明其是否優質高產。

（5）拮抗試驗

也稱對峙反應。同一種食用菌，經分離或雜交，將選育出許多不同的菌株，這些菌株的菌絲在形態上很難區別。如不同編號的香菇菌種，都是白色絨毛狀菌絲，鏡檢時均具有鎖狀聯合等。在當前菌種管理工作尚不十分健全的情況下，「同名異種」、「同種異名」的現象普遍發生，要識別異同，可採用「拮抗試驗」加以區別。具體方法是：

用1支20毫米×200毫米的無底試管，中央部位裝入長 5～7厘米的木屑麩糠培養基，兩端壓平並蓋棉塞，滅菌後，兩端各接入兩株受檢的菌種 1小塊，25℃左右條件下培養，當兩端菌絲往中央生長並相互接觸後，把試管移至20℃、約300勒克斯的漫射光下繼續培養，觀察菌絲接觸區有無對峙反應。若無褐色的帶線出現，表示兩個受檢菌株的基因極相似或相同，是相同的菌株，僅編號不同，即同種異名。如果受檢菌株間形成帶線，則表示是不同的菌株。

用平板進行拮抗試驗測試，方法是在無菌的PDA培養基平板上各接入2個或多個被檢菌株的菌種，在上述條件下培養，觀察菌絲相接觸部分有無帶線，以區別相同或不同的菌株。也可用菌種瓶（袋）進行拮抗測試（圖2-11）。

圖2-11 拮抗現象

（6）菌絲長速測定

在適宜的條件下，若菌絲生長迅速、粗壯有力、濃密整齊，一般為優質菌種。若菌絲生長緩慢、中斷或長速極快、稀疏無力、參差不齊和易枯黃萎縮，則為不良菌種。菌絲生長速度測定，可在PDA平板中心接種培養，測量菌落兩個直交直徑，取其平均值。同理，還可在原種、栽培種瓶（袋）壁上劃線測定。

（7）菌絲生長量測定

將等面積的菌苔接入無菌的液體培養基內，在相同的條件下，進行搖床振動培養，經過一定時間後，過濾收集菌絲，反復沖洗干凈後置容器內，80～100℃烘箱中烘乾至恆重後稱重。凡菌絲增殖快、重量重的為優質菌株，而增殖慢、重量輕的為不良菌株。

（8）耐高溫測定

以雙孢菇為例，把菌種置於20～22℃下培養，待菌絲長到1/2試管斜面時，每一菌株取出2～3支試管，置於35℃溫度下，經24小時作抗熱性試驗，然後放到22～23℃下培養，觀察菌絲恢復情況。若菌絲恢復萌發快，仍健壯、旺盛生長，則表明該菌株具有耐較高溫的優良性狀；如果菌絲生長緩慢，出現發黃倒伏，萎縮無力，則為不良菌株。

（9）均一性測定

將母種接種於標准培養基的平板上，並置於標準的環境條件下，每批做30～50個重復，進行長勢和長速的連續觀察記錄。均一性好的品種，每個重復之間長勢和長速幾乎沒有肉眼可見的差異。如果長勢和長速不一，則表明原始的母種的遺傳均一性不良，不宜作生產用種。

（10）純度測定

菌種純度高低是鑒定菌種質量好壞的關鍵環節。優質菌種要求同一管、瓶或袋內只含有所需要的菌種菌絲體，而不能含有其他種類的雜菌。這里所說的雜菌包括細菌、放線菌、酵母菌和各種黴菌，以及含有兩種食用菌菌絲體或同一種食用菌的兩個品種菌絲。凡是被雜菌污染的菌種都是不純菌種，必須予以淘汰。在三角瓶內裝入淺層液體培養基，滅菌後接入經搗散的菌種，25℃條件下培養，約1周觀察，若有氣泡和菌膜發生，並具酸敗味，說明菌種不純，混有雜菌；如果無上述現象則菌種純正無雜。

（11）長勢測定

菌絲長勢包括菌絲生長的狀態和速度。凡是菌絲生長迅速、整齊濃密、健壯有力的菌種為優良菌種。如果菌絲生長緩慢，或長速特快、稀疏無力、參差不齊、易於衰老，則表明是劣質菌種。在鑒別菌絲長勢時，必須注意，在不同培養基上、不同培養條件下，同一種食用菌菌絲的長勢不同，因此，判斷食用菌的菌種長勢，應採用相同的培養基，這樣，結果就可靠一些。在外界環境條件相同的情況下，菌絲生長旺盛、生長量多、生長速度快的要好於菌絲生長弱、生長量少、生長速度慢的菌種。還有一種方法是在三角瓶內裝入淺層液體培養基，滅菌後接入經搗散的菌種，25℃條件下培養，約1周觀察浮在液面的菌種。如果菌絲向旁邊迅速生長、健壯有力、邊緣整齊，且不斷增厚，說明該菌株生長勢強；若表面生長慢、稀疏、菌絲層薄，說明長勢弱，不宜用於生產。

（12）抗霉性測定

以木耳為例：制備平板，在平板的一邊分別接入不同的木耳菌株，每一菌株3個重復，在26～28℃下培養。待木耳菌絲長到平板一半左右時，在平板的另一邊接上木黴菌絲，繼續培養。之後注意觀察木黴菌絲與木耳菌絲的交界處，出現拮抗線的表示木耳菌株抗霉能力強，木黴菌絲無法長過去，為抗霉能力強的菌株。如果木黴菌絲很快蓋過木耳菌絲，說明這個木耳菌株的抗霉能力差或沒有抗霉力。

（13）出菇試驗

對引進或分離的同一品種的若干菌株進行出菇對比試驗，必須是在各級菌種的培養基成分、培養溫度、培養時間及栽培條件基本一致的情況下進行。出菇試驗可按菇類的常規栽培方法進行，數量可少些。為使試驗准確，每一菌株設3～4個重復，以避免試驗的偶然性。在位置排放上盡可能按菌名拉丁文排列，以相同的措施管理，在管理過程中對環境因子的變化、管理措施及生長歷程、品種本身性狀等要詳細全面記錄。以香菇為例記載內容如下：

①母種菌絲生長情況，如菌絲濃淡、生長快慢、菌苔韌性等。

②原種、栽培種中菌絲生長情況，如菌絲萌動、吃料、生長快慢；菌種表面有無菌皮或菌皮厚薄，白色顆粒狀物有無或多少；培養基轉色情況等。

③栽培階段應記載：菇木轉色快慢、顏色深淺；出菇快慢、菇生長密度；子實體經濟性狀，包括菇的大小、厚度、色澤、圓整程度、菌柄長度、粗細等；轉潮快慢；對水分的敏感程度；產量及產量分布；出口菇比例等。

通過對記載資料分析，選出綜合性狀符合要求的菌株，供大面積生產或出售。

出菇試驗因季節推遲或其他原因，可採用一種較簡單的方法來彌補，即直接將接有各菌株並已發好菌的瓶（袋）裝菌種，小心地敲破瓶頸或打開塑料袋口，使培養料外露（如果是雙孢菇，則要覆土調好土粒的濕度），置最適宜的溫、濕度條件下進行出菇（耳）管理，觀察記載各項指標，最後進行評比。但這種方法的結果只能提供參考。

（14）栽培指標

採用一定的栽培規模，通過不同地區、不同原料、不同栽培方式，進行多次反復栽培觀察，詳細記錄、評比後，具有優質、高產、高抗、高效和遺傳性、穩定性強的菌株，才是優質和可推廣的品種。其鑒定的內容、方法和指標有：

①吃料能力鑒定 將菌種接入最佳配方的原種培養料中，置適宜的溫、濕度條件下培養，1周後觀察種菇（耳）菌絲的生長情況。如果菌種塊能很快萌發，並迅速向四周和培養料中生長伸展，則說明該品種的吃料能力強；反之，菌種塊萌發後生長緩慢，遲遲不向四周的料層深處伸展，則表明該品種對培養料的適應能力差。對菌種吃料能力的測定，不僅用於對菌種本身的考核，同時還可以作為對培養料選擇的一種手段。

②成活率 將菌種接在適宜的培養基上，若菌絲能很快恢復、定植和蔓延生長，成活率很高，是質量好的菌種；反之，接種後恢復慢，成活率不高是質量差的菌種。

③出菇快慢 一般說，高溫型的出菇快，低溫型的出菇慢，中溫型的介於兩者之間。而以菇的質量來說，高溫型的質量差，低溫型的質量好。但同一溫型食用菌品種的不同菌株，其菌種接種後若菌絲分解培養料能力強，培養前後培養料失重大，出菇快而多，總產高，即是好菌種；否則為劣質菌種。

④菇峰間隔 在一個生產周期中，子實體發生可分數潮次，產菇最多時稱菇峰，最低時稱菇谷，每個菇峰和菇谷構成一潮菇。凡菇潮多，間隔時間短，說明菌絲分解能力強，供子實體發生的養分積累多，因此轉潮快，是好的菌種；反之，菇潮間隔時間長，或不明顯，零星出菇，產量低，即為劣質菌種。

⑤乾燥率 鮮菇經干制後乾燥率高，說明轉化率高，子實體含水分低，為優質菌種。

⑥生物學效率 生物學效率，指每100千克乾料可產多少千克鮮菇。生物學效率高，則菌種質量好，反之為劣質菌種。

（15）經濟指標

高產不一定高效、豐產不等於豐收，要佔領市場，獲得較高利潤，還必須具備商品的要求，如產品的色、香、味、形，檔次，上市時間，貨架期和保質期等。凡是鮮菇上市時間早，產量高、品質好、檔次高、含水量低，不易變色、變質、破碎、失重，無農葯殘毒、殘臭，符合食品衛生標准和得到的利潤高等，均表示經濟指標高，則為優質菌株；而上市有效時間短，易變色、變味、變質，含水量高，失水嚴重，易破碎，利潤低的菌種均為劣質菌種。如香菇以大小適中、肉厚、色深、邊緣內卷，柄短細為優良；雙孢菇以色白、子實體大小適中，菌柄短，不易開傘等為優良；銀耳以色白、開片好、蒂頭小、松泡率高為優良等。

⑹ 簡述無菌檢查中陽性對照試驗的概念和意義。

為便於研究觀察成葯制劑中，某些含有防腐劑和抑制菌成分的干擾作用，以及測試常規檢驗方法和培養基、試劑等的靈敏度時，可將定量的已知陽性對照菌加在供試品稀釋液中，按檢驗供試品的操作方法進行陽性菌的對照試驗，陽性對照菌應生長。
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⑺ 無菌程度的檢驗方法

無菌程度是指接菌室、接菌箱、超凈工作台等接菌環境，經葯物熏蒸、葯物噴霧、紫外線燈照射和綜合消毒處理後的無菌情況。檢驗方法主要有兩種：一種是平板檢驗法。採用肉湯瓊脂或PDA培養基，滅菌後於培養皿內製成平板，在滅菌後的箱室內不同方位各放置一平皿，打開皿蓋5～10分鍾，其中一隻不開蓋作對照。而後蓋好蓋子倒置於30±2℃條件下，培養3～5天，觀察菌落數，平均每平皿內菌落數不超過3個為合格。若對照皿也出現菌落則說明培養基本身帶菌，檢驗無效。第二種檢驗方法是斜面檢驗法。將滅菌後的試管斜面直立放在箱內各部位，打開棉塞30分鍾（對照組不打開），然後塞好棉塞置32℃±2℃條件下培養3～5天，如未發現菌落即為合格。

⑻ 生物製品的無菌檢查法的實驗原理，准備工作及操作步驟

1. 目的：建立無菌檢查的標准操作規程，確保檢驗結果的准確性。 2. 范圍：適用於本廠質監科化驗室對本廠生產的注射劑進行無菌檢查。3. 責任：化驗員有責任按本操作規程操作，並對檢驗結果負責。4. 定義：無菌檢查法系指檢查葯品是否無菌的一種方法。5.內容：5. 1無菌操作設備：無菌操作室或超凈工作台，無菌衣、口罩、帽子、消毒鞋、酒精燈等。5.1.1無菌室分無菌操作室和緩沖間。在緩沖間內應有洗手盆、干手器、無菌衣放置架及掛鉤、拖鞋等。無菌操作室應具有空氣除菌過濾的層流裝置，局部潔凈度100級超凈工作台。緩沖間及操作室內均設置能達到空氣消毒的紫外光燈和照明燈，操作室或工作台應保持空氣正壓。5.1.2無菌室應每周和每次操作前用0.1％新潔爾滅或2％甲酚液擦拭操作台及可能污染的死角，開動無菌空氣過濾器及紫外光燈殺菌1小時。在每次操作完畢，同樣用2％甲酚或0.1％新潔爾滅溶液擦拭工作檯面，用紫外光燈殺菌半小 時。5.1.3無菌室的無菌程度檢查：無菌室在消毒處理後，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數。取直徑90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將雙碟半開注入溶化的營養瓊脂培養基約20ml，製成平板：在35-37℃預培養48小時，證明無菌後將3個平板以無菌方式帶入無菌操作間的潔凈區域左、中、右各放1個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鍾後將蓋蓋好，置35-37℃培養48小時，取出檢查，3個平板上生長的菌落數相加總數不得超過10個。 無菌操作檯面或超凈工作台應定期請有關部門檢測其潔凈度，應達到100級（一般用塵埃粒子計數儀），檢測塵埃粒徑≤5μm的粒數不得超過3.5個／升；空氣流量應控制在0.75-1.0m3/s；細菌菌落數平均<1個，可根據無菌狀況定期置換過濾器。5.1.4無菌室內應准備好盛有消毒用5％甲酚的玻璃缸、酒精燈、火柴、鑷子、75％酒精棉及拖鞋等。5.2儀器、用具：5.2.1真空泵、恆溫培養箱、生物顯微鏡、托盤天平（精度0.1g）、抽濾瓶（500ml）、 三角瓶（100、500 ml）、移液管（1、10ml）、注射器（要求規格）、試管、雙碟（9cm）、注射針、鑷子、剪刀、白金耳、橡皮管、紗布、棉花（原棉）、不銹鋼吸管筒、接種環、微孔濾膜（直徑約5cm），孔徑應在0.45±0.02μm )載玻片、灑精燈、取樣勺、吸耳球、噴霧瓶。5.2.2用具的包紮：5.2.2.1移液管在移液管上端管內,鬆鬆地塞進少許原棉,然後放入不銹鋼滅菌筒內。5.2.2.2試管在管口塞上紗布棉塞。5.2.2.3無菌衣、褲、帽、口罩將洗凈的衣褲、帽子、口罩配套後裝入布袋，扎緊袋口，再用牛皮紙包好。5.2.2.4注射器洗滌干凈的注射器及注射針頭裝配好後，放入墊有紗布的帶蓋容器內（飯 第3頁/共7頁盒）一層層放好，上面蓋上紗布，然後蓋上容器的蓋子，用牛皮紙包好。5.2.2.5濾器 將檢驗合格後微孔濾膜先有水中浸泡濕潤，取出後固定在細菌過濾器的濾板上，濾板下、濾膜上均用耐高溫墊圈墊好，上好濾器。在滅菌前濾器的螺勿擰太緊，濾器上口用8層紗布及牛皮紙包紮，裝妥後放入容器內，再將盛濾器的容器蓋好蓋子，用牛皮紙包紮。5.2.3用具的滅菌：將包紮好的用具，在121±0.5℃蒸汽滅菌櫃中滅菌30分鍾，物品取出時切勿立即置冷處，以免急速冷卻滅菌物品內蒸汽冷凝造成負壓，易致染菌，應置溫箱或或加溫烘乾。5.3培養基、試劑：5.3.1一般採用商品乾燥培養基，臨用時按照使用說明書進行配製，需注意培養基的pH值應符合規定，否則必須校正後，滅菌使用。使用前，按要求分裝滅菌好的細菌培養基須經30-35℃培養48小時，真菌培養基須經20-25℃培養72小時，證明無菌生長後方可使用。 制備的需氣菌、厭氣菌培養基應半個月內用完，在供試品接種前，培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5，否則須經水浴煮沸加熱，只限加熱一次。5.3.2革蘭氏碘液：先用3-5ml蒸餾水溶解2.0g碘化鉀，再加入1.0g碘片，攪拌溶解後，加蒸餾水稀釋至300ml，搖勻。置密閉棕色瓶中備用。5.3.3結晶紫染色液：將結紫1.0g溶解於20ml95%乙醇中後，與80ml1%草酸銨溶液相混合，靜置48小時使用。此液穩定，置密閉的棕色瓶中可儲存數月。5.3.4沙黃染色液：將0.2g沙黃溶解於10ml95%乙醇中，待完全溶解後再加蒸餾水至100ml。5.3.5生理鹽水：稱取9g氯化鈉，加水1000ml溶解，分裝後於121±0.5℃濕熱滅菌30分鍾。供作稀釋劑用。 第4頁/共7頁5.3.6 75%乙醇量取無水乙醇75ml,加水稀釋至100ml，搖勻，即得。5.3.7 0.1%新潔爾滅：量取5%新潔爾滅20ml，加水稀釋至約1000ml，搖勻，即得。5.4培養基靈敏度檢查：5.4.1新購的乾燥培養基或採用不同牌號原材料的新鮮培養基，其質量均應符合靈敏度檢查要求。 (1)取藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B） 28001］的營養瓊脂斜面和白色念珠菌[Candida albicans CMCC（F）98001］的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻的菌懸液；取生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC（B）64941]不含瓊脂的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，用滅菌毛細管將其吸至滅菌離心管內，離心，棄去上清液，沉澱菌體用0.9%無菌氯化鈉溶液製成均勻菌懸液。然後以10倍系列稀釋後，製成1ml中含10-100個菌並計數。 (2)取藤黃微球菌、生孢梭菌的需氣、厭氣培養基新鮮培養物，白色念珠菌的真菌培養基瓊脂斜面的新鮮培養物，取接種至黴菌培養基內，20-25℃用0.9%無菌氯化鈉溶液作10倍稀釋，製成1ml中含10-100個菌並計數。 將藤黃微球菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為9ml的需氣、厭氣菌培養基3管，生孢梭菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，分別接種至每管裝量為12ml的需氣、厭氣菌培養基3管，白色念珠菌的上述(1)或(2)的稀釋液各1ml，接種至每管裝量為9ml的真菌培養基3管，以未接種的培養基作對照，按規定的溫度培養5天並逐日記錄結果。結果判定：以每株菌接種後的培養基不得少於2管呈現生長，即該培養基的靈敏度檢查符合要求。5.4.2配製的培養基應在涼暗處保存，一般不得超過2周，臨用前細菌和黴菌培養基分別經30-35℃和20-25℃培養不少於48小時和72小時，證明無菌生長後方可使用。5.4.3需氣菌、厭氣菌培養基在試管中裝量高度不得少於7Cm，其指示劑氧化層不得超過培養基深度的1／5，否則須經水浴煮沸10分鍾，但只限加熱一次。 第5頁/共7頁無菌試驗培養時間結束時，指示劑氧化層應不超過培養基深度的1／2。5.5對照用菌液的制備：5.5.1試驗用菌種、菌種的復甦、菌種的接種與保存等均應按照「抗生素微生物檢定法」標准操作規程項下操作。5.5.2金黃色葡萄球菌菌液用接種環取金黃色葡萄球菌[Staphy-lococcus aureus CMCC（B）26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物少許，接種至營養肉湯培養基內，在30-35℃培養16-18小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:1065.5.3生孢梭菌菌液用接種環取生孢梭菌[CMCC（B）64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳，接種至相同培養基內，在30-35℃培養18-24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:106。5.5.4白色念珠菌菌液用接種環取白色念珠菌[CMCC（F）98001]的真菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳，接種至真菌培養基內，在20-25℃培養24小時後，用滅菌生理鹽水稀釋成1:105。5.5.5上述制備的菌液，一般當日使用。5.6進入無菌室的操作要點：5.6.1根據試驗程序,將用具物品搬入緩沖間,打開紫外光燈和空氣過濾裝置並使其工作1小時以上。5.6.2操作人員用肥皂水刷洗雙手,關閉緩沖間紫外光燈,進入緩沖間內,關閉第一層門,用2%來蘇爾或0.1%新潔爾滅溶液洗雙手,用消毒毛巾擦乾,換上無菌衣、帽、口罩及消毒鞋。5.6.3關閉無菌室內紫外光燈，進入第二層門並將用具搬至無菌室內，關閉無菌室門。5.6.4凡進入無菌室後不應再外出取物品，因此，在每次試驗中所用物品必須計劃好，並准備好備用物品。從進入第一層門直至無菌室內，隨操作人員的進入應噴霧2%來蘇爾或0.1 %新潔爾滅溶液。5.7檢查法：5.7.1無菌檢查法包括：直接接種法和薄膜過濾法。前者適用於非抗菌作用的供試品；後者適用於有抗菌作用的或大容量的供試品。5.7.2操作時，應先用0.1%新潔爾滅浸泡或擦拭容器表面後，以無菌的方法取 第6頁/共7頁內容物。5.7.3凡無菌檢查中，均應取相應溶劑和稀釋劑同法操作，作陰性對照。5.7.4供試品制備： 用滅菌鑷取出注射器，在火焰旁將針芯插入針管並安上針頭，蓋為橡皮塞時，用注射器在已消毒好的橡皮塞中心位置刺入吸取葯液。按規定須稀釋或滅活的供試品，可直接或將瓶內供試液抽出至滅菌玻璃容器內進行滅活處理並稀釋至規定的體積和濃度；抽取瓶中內容液體時，應將供試品倒置並使針頭在液面下。5.7.5直接接種法：按規定量取供試品，以無菌操作將該供試品分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基6管，其中1管接種金黃色葡萄球菌液1ml，作陽性對照，另接種於真菌培養基5管。輕輕搖動，使供試品與培養基混合。需氣菌、厭氣菌培養基管置30-35℃、真菌培養基管置20-25℃培養7日。在培養期間應逐日觀察並記錄是否有菌生長。陽性對照管在24小時內應有菌生長，如在加入供試品後，培養基出現渾濁，培養7天後，不能從外觀上判斷有無微生物生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮培養基中或斜面培養基上繼續培養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再出現渾濁或斜面有無菌生長，或用接種環取培養液塗片，染色，用顯微鏡觀察是否有菌。5.7.6薄膜過濾法： 將微孔濾膜過濾裝置、抽濾瓶、排氣管與真空泵相連，真空泵可置無菌室外。取規定量供試品，按規定的方法處理後，加入0.9%無菌氯化鈉溶液100ml中，混合後，通過裝有孔徑不大於0.45μm 的薄膜過濾器，減壓抽干後，用0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次，每次至少100ml，取出濾膜分成3等份，分別加入上述二種培養基中，按規定溫度和時間培養。陽性對照管應根據供試品特性加入相應對照菌液1ml（抗細菌葯物，以金黃色葡萄球菌為對照菌；抗厭氧菌葯物，以生孢梭菌為對照菌；抗真菌葯物，以白色念珠菌為對照菌）。陽性對照管細菌應在培養24-48小時，真菌應在培養24-72小時有菌生長。5.8結果判斷： 第7頁/共7頁當陽性對照管顯渾濁並確有菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管均為澄清或雖渾濁但經證明並非有菌生長，均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及真菌培養基管中任何1管顯渾濁並確證有菌生長，應重新取2倍量供試品，分別依法復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。6 培訓6.1 培訓對象：化驗員。6.2 培訓時間：二小時。7 記錄 記錄名稱 保存部門 保存時間 無菌檢驗記錄 質監科 葯品有效期後一年 QF-01-007-00無 菌 檢 驗 記 錄品 名： 批 號： 規 格： 檢驗日期： 年 月 日培養基名稱需氣、厭氣菌培養基真菌培養基培養培養溫度30—35℃20—25℃培養時間管 號1234512345培養天數及結果1234567結 論備 注 復核人： 檢驗人：

⑼ 什麼是無菌檢查法

無菌檢查法
無菌檢查法系指檢查葯品與敷料是否無菌的一種方法。
無菌檢查的全部過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物的污染。
生物製品應按衛生部《生物製品製造及檢定規程》中有關無菌檢查的規定辦理。
培養基及其制備方法
1.需氣菌、厭氣菌培養基(硫乙醇酸鹽液體培養基)
酪腖（胰酶水解）
15g
氯化鈉
2.5g
葡萄糖
5g
新鮮配製的0.1％刃天青溶液
1.0ml
L－胱氨酸
0.5g
(或新鮮配製的0.2％亞甲藍溶液 0.5ml)
硫乙醇酸鈉
0.5g
瓊酯
0.5～0.7g
(或硫乙醇酸0.3ml)
水
1000ml
酵母浸出粉
5g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，按量加入葡萄糖和刃天青溶液，搖勻，調節pH值使滅菌後為7.1±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
在無菌檢查接種前, 培養基指示劑氧化層的顏色不得超過培養基深度約1/5。否則,須經水浴煮沸加熱, 只限加熱一次。
2.黴菌培養基
腖
5g
磷酸氫二鉀（K2HPO4)
1g
酵母浸出粉
2g
硫酸鎂（MgSO4·7H2O）
0.5g
葡萄糖
20g
蒸餾水
1000ml
除葡萄糖外，取上述成分加入水內，微溫溶解後，調節pH約6.8，煮沸,加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾。
3.選擇性培養基
(1) 對氨基苯甲酸培養基(用於磺胺類葯物的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加對氨基苯甲酸0.125g，溶解後搖勻，分裝，115℃滅菌30分鍾。
(2) 吐溫培養基(用於油劑葯品的無菌檢查)
照上述需氣菌、厭氣菌培養基及黴菌培養基的處方及製法，各加10ml的吐溫80，搖勻後，分裝，115℃滅菌30分鍾。
4.營養肉湯培養基
腖
10g
肉浸液
1000ml
氯化鈉
5g
取腖與氯化鈉，加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
5.營養瓊脂培養基
照上述營養肉湯培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2，分裝，115℃滅菌30分鍾。
6.0.5％葡萄糖肉湯培養基
腖
10g
葡萄糖
5g
氯化鈉
5g
肉浸液
1000ml
取腖與氯化鈉加入肉浸液內，微溫溶解後，調節pH為弱鹼性，煮沸，加葡萄糖溶解後，搖勻，濾清，調節pH值使滅菌後為7.2±0.2， 分裝，115℃滅菌30分鍾。
7.黴菌瓊脂培養基
照黴菌培養基的處方及製法，加入15～20g瓊脂，調節pH值使滅菌後為6.4±0.2，分裝，115℃滅菌20分鍾，趁熱斜放使凝固成斜面。
上述培養基分別按15ml與40ml分裝於試管中，裝量約為試管高度的2/5，在115℃滅菌30分鍾。細菌培養基經30～35℃培養48小時，黴菌培養基經20～25℃培養72小時後，應無菌生長。
培養基的質量應通過靈敏度檢查。
培養基靈敏度檢查法
1.菌種
(1)藤黃微球菌(Micrococcus Lutea)[CMCC(B)28001]

(2)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B)64941]
(3)白色念珠菌(Candida albicans)[CMCC(F)98001]
2.操作
取藤黃微球菌的營養瓊脂斜面和白色念珠菌的黴菌瓊脂斜面的新鮮培養物分別用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻的菌懸液;將生孢梭菌的不含瓊脂需氣菌、厭氣菌培養基的新鮮培養物,吸入滅菌離心管，離心，棄去上清液，菌體用0.9％滅菌氯化鈉溶液製成均勻菌懸液。分別取上述菌懸液用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至與細菌濁度標 准管相同的濃度，然後，作10倍系列稀釋並計數。

將藤黃微球菌1:10<5>～1:10<8>菌液、生孢梭菌1:10<6>～1:10<9>菌液、白色念珠菌1:10<5>～1:10<8>菌液各1ml,分別接種至9ml試驗培養基中,每個稀釋度至少接種3管,以未接種的培養基管作對照，細菌試驗管置30～35℃培養3天,白色念珠菌試驗管置20～25℃培養5天。逐日記錄結果。
3.結果判定
以接種後培養基管數的2/3以上呈現生長的最高稀釋度為該培養基的靈敏度（且接種菌量均應小於10個），三次試驗中，以兩次達到的最高靈敏度為判定標准。
需氣菌、厭氣菌培養基靈敏度為藤黃微球菌1:10<6>；生孢梭菌1:10<7>，黴菌培養基靈敏度為白色念珠菌1:10<6>。
[附註]
肉浸液制備法
取新鮮牛肉，除去肌腱及脂肪，切細，絞碎後,每1000g加水3000ml，充分拌勻，在2～10℃浸泡20～24小時，煮沸1小時，濾過，壓干肉渣，補足液量，分裝，121℃滅菌30分鍾，置冷暗處備用。也可用牛肉浸出粉3g，加水1000ml,配成溶液代替。
對照用菌液
1.金黃色葡萄球菌（Staphylococcus
aureus）菌液
取金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的營養瓊脂斜面新鮮培養物1白金耳，接種至需氣菌、厭氣菌培養基內,在30～35℃培養16～18小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋成1:10<6>。
2.生孢梭菌（Clostridium sporogenes）菌液
取生孢梭菌[CMCC(B)64941]的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養物1白金耳,再接種至相同培養基內，在30～35℃培養18～24小時，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<6>。
3.白色念珠菌（Candida albicans）菌液
取白色念珠菌[CMCC(F)98001]的黴菌瓊脂培養基斜面新鮮培養物1白金耳,接種至黴菌培養基內，在20～25℃培養24小時後，用0.9％滅菌氯化鈉溶液稀釋至1:10<5>。
檢查法
1. 直接接種法
(1) 供試品如為注射液、供角膜創傷及手術用的滴眼劑或滅菌溶液, 任取供試品2支（瓶）以上，用適當消毒液清潔供試品容器的外表面後,以無菌操作吸取規定接種量的供試品溶液，分別接種於需氣菌、厭氣菌培養基5管，其中1管接種對照用菌液1ml，供作陽性對照；取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照, 另接種於黴菌培養基2管，供試品溶液的每管接種量與培養基的分裝量，應根據供試品的裝量,按下列規定取用：
供試品裝量
每管接種量
培養基分裝量
2ml或2ml以下
0.5ml
15ml
2ml以上至20ml
1.0ml
15ml
20ml以上
5.0ml
40ml
接種後輕輕搖動,使勻。需氣菌、厭氣菌培養基在30～35℃培養5日, 黴菌培養基在20～25℃培養7日，抗生素類葯品均培養7日，放射性葯品培養5～7日。培養期間應逐日檢查是否有菌生長（陽性對照在24小時內應有細菌生長）；如在加入供試品溶液後，培養基出現渾濁或沉澱，經培養後不能從外觀上判斷時,可取該培養液轉種入另1支相同的培養基中或斜面培養基上，培養48～72小時後，觀察是否再現渾濁或在斜面上有無菌落生長，並在轉種的同時，取培養液少量，塗片製成染色標本，用顯微鏡觀察是否有菌生長。
(2) 供試品如為注射用滅菌粉末或無菌凍干品，照該葯品項下的規定或按該葯品劑量項下的溶劑用量，加入滅菌水或0.9％滅菌氯化鈉溶液,使內容物溶解成均勻的供試品溶液，取規定接種量的供試品溶液，接種於上述培養基中。
(3) 供試品如為供直接分裝成注射用無菌粉末的原料葯，按各該葯品項下的規定製成溶液，依法接種於培養基中。
(4) 供試品如為外科敷料，取供試品2個包裝，以無菌操作拆開包裝,於不同部位剪取約1cm×3cm的樣品，分別接種於40ml培養基中。
(5) 供試品如有抑菌作用或含有抑菌物質時，可選用適宜的培養基，或種入較大量的培養基中，使該供試品稀釋至不具有抑菌使用的濃度；或照下述「薄膜過濾法」處理並接種於培養基中。
(6) 供試品如為抗生素葯品,取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下,取最大規格量2份，分別加入足夠使青黴素滅活的無菌青黴素酶溶液適量，搖勻，分別等量接種於每管裝量為40ml的培養基中。
(7) 供試品如為放射性葯品，取供試品1瓶(支)，以每管接種量為0.2ml，接種於每管裝量為7.5ml的培養基中。
2. 薄膜過濾法
(1)供試品如為抗生素葯品，取該品種正文中最大規格量的供試品不少於2瓶(支)。原料葯按制劑規格項下取最大規格量2份, 分別按該葯品項下規定的方法處理後, 加入0.9％滅菌氯化鈉溶液至少100ml或其他適宜的溶劑中, 搖勻, 以無菌操作加入裝有直徑約50mm、孔徑不大於0.45±0.02μm微孔濾膜的薄膜過濾器內,減壓抽干後,用0.9％滅菌氯化鈉溶液或其他適宜的溶劑沖洗濾膜3次,每次至少100ml；取出濾膜,分成4片, 取3片分別放在3管各40ml需氣菌、厭氣菌培養基中, 其中1管接種對照用菌液1ml,供作陽性對照, 另1片放在黴菌培養基管中。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。

(2) 供試品如為抗厭氧菌葯品，取規定量的供試品，按上述方法經薄膜過濾器處理後，取出濾膜，分成4片，其中3片放在3管需氣菌、厭氣菌培養基管中，1管接種生孢梭菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。另1片放在黴菌培養基管中。 取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
(3) 供試品如為抗真菌葯品，取規定量的供試品,按上述方法經薄膜過濾器處理後,取出濾膜,分成4片，取2片分別放在2管需氣菌、厭氣菌培養基管中；2片分別放在2管黴菌培養基管中,其中1管接種白色念珠菌對照用菌液1ml，供作陽性對照。取1支需氣菌、厭氣菌培養基管作陰性對照。
結果判斷
當陽性對照管顯渾濁並確有細菌生長，陰性對照管陰性時,可根據觀察所得的結果判定：如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管均為澄清或雖顯渾濁但經證明並非有菌生長,均應判為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及黴菌培養管中任何1管顯渾濁並確證為有菌生長，應重新取樣，分別依法倍量復試，除陽性對照管外，其他各管均不得有菌生長，否則應判為供試品不合格。