菠蘿蛋白酶檢測方法

A. 在菠蘿蛋白酶的提取、初步純化及活性測定中,用硫酸銨鹽析為什麼要選擇0%~30%的飽和度

那是因為在這個飽和度時這個蛋白酶可以沉澱析出,不同的蛋白在不同的飽和度時才能析出,這個飽和度下其他蛋白還是溶解狀態,利於分離目的蛋白.

B. 菠蘿蛋白酶的修飾是怎樣的呢

菠蘿蛋白酶的提取純化及化學修飾對其活性的影響
目的要求
1、掌握從原料物中提取活化分離菠蘿蛋白酶的方法。2、學習酶活力測定的方法。
3、了解某些因素對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩定性的影響。
4、掌握用聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進行化學修飾的原理。
5、比較修飾酶與未修飾酶的活力。
二、實驗原理
1、本實驗先從新鮮的菠蘿汁中使用單寧沉澱法提取出菠蘿蛋白酶，菠蘿蛋白酶將酪蛋白水解產生酪氨酸，通過測定吸光度的變化，可以測得菠蘿蛋白酶的活力。
2、 以陶瓷層析結合超濾法純化菠蘿蛋白酶，吸附材料化學性質好，可用於柱層析。
3、溫度恆定時,菠蘿中菠蘿蛋白的熱失活遵循一級蛻變規律dE/dt=-Kd*t,失活半壽期是常數，可以用作衡公菠蘿蛋白酶熱穩定性的指標。
本實驗應用動力學方法，以菠蘿蛋白酶的熱失活半衰期為熱穩定性的指標，定量研究了梭酸鹽和Ca2+,Zn2+士對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩定性的影響，以期找到一種高效、可行的增強菠蘿蛋白酶熱穩定性的方法。
4、修飾的菠蘿蛋白酶對溫度和pH值的穩定性均比天然酶有很大程度的提高。菠蘿蛋白酶是一種巰基蛋白酶,但它的穩定性較差,影響了它的應用。此外,菠蘿蛋白酶易受有關因素的影響而失活。聚乙二醇(PEG) 為一種無毒且具親水性的免疫惰性大分子，本實驗採用聚乙二醇對菠蘿蛋白酶進行修飾,提高了其對環境的穩定性,使其半衰期延長。
實驗材料
試劑和材料
1、新鮮菠蘿(0.735kg)、0.1mg/ml牛血清蛋白
2、檸檬酸鈉、單寧、0.1%EDTA溶液、1.5%氯化鈉溶液、1%酪蛋白溶液、1mol/L氫氧化鈉溶液、0.05mol/L磷酸緩沖液、激活劑
3、Brolain試劑、牛血清白蛋白、0.1mol/L檸檬酸鹽緩沖液、PEG活性酯。
（二）實驗儀器
1、榨汁機；
2、離心機；
3、紫外可見分光光度計（1cm石英比色皿）；
4、恆溫水浴鍋（37℃）；
5、試管、試管架；
6、燒杯、容量瓶；
7、移液管；
四、試驗方法
（一）從菠蘿中提取菠蘿蛋白酶
操作步驟：
將菠蘿切碎→加檸檬酸鈉，榨汁→菠蘿汁→紗布過濾→澄清液→2000r/min，7min離心→上清液→加Vc,0.2%單寧溶液攪拌15min,靜置40min4200r/min,5min離心→沉澱物→加100ml0.1%EDTA溶液，200ml1.5%氯化鈉液→4200r/min,5min離心→酶復合物→加適量1.5%氯化鈉溶液，4000r/min,7min離心→酶復合物沉澱→凍存備用
菠蘿蛋白酶活力的測定
1、取酶製品溶解於0.05mol/L磷酸緩沖液（PH7.0)至10ml,離心得上清液；
2、取5支試管，分別標號1、2、3、4、5，各加1ml溶液酶和0.9m激活劑；
3、另取5支試管，分別對應標號1、2、3、4、5，各加1ml緩沖液和0.9ml激活劑；
4、將10支試管置於37℃水浴；
5、然後按下表操作
試管號 1 2 3 4 5 6 7 8
標准酪蛋白
（0.1mg/mL） 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0
待測酶蛋白
（mL） 0 0 0 0 0 0 0 1.0
磷酸緩沖液
（mL） 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
考馬斯亮藍
（mL） 4 4 4 4 4 4 4 4
通過測定不同試管中菠蘿蛋白酶的吸光度A的值，進而確定酶活力的大小。
（三）聚乙二醇對菠蘿蛋白酶的化學修飾
1.1修飾酶的制備
60gPEG6000溶於400mL乾燥吡啶,加入1.01g琥珀酸酐後60℃保溫2h,然後在60℃減壓蒸餾除去溶劑。加入苯直至殘余物溶解,再加100mL冷己烷,4℃振盪2h過濾,殘渣溶於蒸餾水後透析。PEG活性酯和菠蘿蛋白酶按摩爾比50：1投料,加入到0.1molPL檸檬酸鹽緩沖液中,4℃反應4h。產物在pH4.6的檸檬酸緩沖液中透析,凍干後得到白色的PEG-菠蘿蛋白酶(修飾酶)。
1.2 TNBS法測定修飾率
取1mL蛋白酶溶液(1mgPmL),加入1mL4 %的碳酸氫鈉溶液,1mL10%的十二烷基磺酸鈉溶液,20min 後加入1mL0.1%的TNBS 溶液,40℃保溫2h ,用0.5mL 1mol/L的鹽酸終止反應。325nm測光吸收值。同樣濃度蛋白酶溶液在修飾後與修飾前的光吸收值之比即為殘留氨基率。修飾率=1-殘留氨基率
（四）某些因素對菠蘿中菠蘿蛋白酶熱穩定性
1.1 菠蘿蛋白酶熱穩定性實驗方法
新鮮菠蘿榨汁100mL加人到55℃預保溫的一定濃度梭酸鹽溶液中，不同保溫時間測定菠蘿蛋白酶活力，按熱失活遵循一級蛻變規律dE/dt=-Kd*t方法求出菠蘿蛋白酶的半衰期。
1.2 有機羧酸鹽對菠蘿蛋白酶熱穩定性的影響。
pH7.0時草酸鈉對菠蘿蛋白酶有明顯穩定作用，100 mmol/l草酸鈉使tl/2延長6倍，丁二酸、酒石酸甲鈉也有一定的保護作用。醋酸鈉、檸檬酸鈉、硼酸鈉都有一定程度的保護作用，且濃度變化對保護作用的影響不大。
結果與討論
1、修飾率的測定
測定結果按下式進行計算:修飾率= 1 - 殘留氨基率= 1
- 修飾後的光吸收值P修飾前的光吸收值= 1 - 0. 502P0. 887 =
0. 4340 = 43. 40 %
2、菠蘿蛋白酶在提取分離和乾燥過程中，酶的活性中心巰基易被氧化而使酶活性降低。在提取過程中適當加入某些抗氧化劑，對阻止酶被氧化失活有良好作用。作為菠蘿蛋白酶活性保護劑，硫代硫酸鈉與半胱氨酸組合使用，可獲較好的效果。
3、維系酶分子三維構象的作用力包括:氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用、范德華力，有些還包括共價二硫鍵，蛋白質分子不管是變性、還是增強穩定性，都是通過影響這些作用力來實現的。但總的來看，氫鍵、疏水相互作用在增強酶的穩定性方面起著主要作用。
4、本實驗通過用琥珀酸酐法活化後的PEG修飾菠蘿蛋白酶,經聚丙烯醯胺凝膠電泳測定其分子量,並對其生化性質與混合酶和天然酶進行了對比研究。所得到的修飾酶在對溫度和pH值的穩定性上均比天然酶有一定程度的提高，這說明PEG分子對酶有一定的保護作用,推測這種作用應來自分子間的作用力。
參考文獻:
1、趙武嶺,吳瑋,李藏銘,等. 果實菠蘿蛋白酶的動力學研究[J ] . 中國
農業大學學報,1999 ,4(1) :11 - 13.
2、章佩芬,郭勇,羅煥敏. 菠蘿蛋白酶的研究與應用進展[J ] . 華西葯學
雜志,2002 ,17(2) :128 - 129.
3母敬郁,麥蔭喬,李小梅,等. 甲基化聚乙二醇(5000) 修飾超氫化物
歧化酶的研究[J ] . J. N. Bethuneuniv. Med. ,SCL ,1995 ,2 (12) .
4、梁楚泗,李樹瑜,楊政蓓. 毛花獼猴桃蛋白酶的提純和性質[J ] . 植物
資源與環境,1999 ,8(3) :1 - 6.

（五）結果討論
從上述結果可知菠蘿蛋白酶的比活力較低，可能的原因有：
1、所加入的有機酸單寧的量對菠蘿蛋白酶沉澱有的影響；
2、在實驗中是否把單寧溶液弄混而導致菠蘿蛋白酶很少沉澱析出；
3、菠蘿蛋白酶對熱不穩定，試驗中溫度的控制是否合理；
4、在活力測定的步驟中所加入的酪蛋白的量不足，導致結果偏低；
5、在活力的測定步驟中，設置了幾個梯度，最後的結果中應該有至少兩支試管中的溶液的吸光度的值相同，但本組實驗沒有得到這種結果。6、活力測定中，由於操作不當，導致部分沉澱溶解在了上清液中，溶液微渾濁，對吸光度的測定有影響。

C. 菠蘿蛋白酶的提取純化及化學修飾對其活性的影響

你所要的文章，中國知網的相關文獻有如下：
（菠蘿果浸提液中菠蘿蛋白酶的穩定性研究 ，影響菠蘿蛋白酶活力因素的研究進展 ，
聚乙二醇對菠蘿蛋白酶的化學修飾 ，TiO_2吸附及超濾法部分純化果菠蘿蛋白酶的研究
Ca2+對菠蘿蛋白酶熱穩定性和二級結構的影響 ，不同添加物對菠蘿蛋白酶酶活穩定性和抑製作用的影響 ，菠蘿蛋白酶的保存穩定性研究 ，菠蘿蛋白酶的提取和分離 ，提取菠蘿蛋白酶工藝的研究 ，鹽法提取菠蘿蛋白酶的研究 ，超濾濃縮提取菠蘿蛋白酶的研究 ，菠蘿中蛋白酶的提取研究 。）
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D. 果菠蘿蛋白酶含量的計算

菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同，蔗糖酶的提取及初提純試驗中影響酶得率得因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度、抑制劑、激活劑等。

菠蘿中所含的糖、酶有一定的利尿作用，對腎炎和高血壓者有益，對支氣管炎也有輔助療效。由於纖維素的作用，對便秘治療也有一定的療效。當出現消化不良時，吃點菠蘿能開胃順氣，解油膩，能起到助消化的作用，還可以緩解便秘。

生產方法

取新鮮干凈的菠蘿皮、刺、芯等出汁率達45%以上的下腳料，壓榨，取汁濾除果屑。濾液添加0.025-0.05%的苯甲酸，加5%高嶺土進行吸附。將高嶺土吸附物用飽和碳酸鈉溶液調pH6.7-7.0後，加5%氯化鈉，攪拌後壓濾。取濾液用鹽酸調pH4.8-5.1，加硫酸銨，靜置沉澱，取沉澱減壓乾燥，即為菠蘿蛋白酶。對菠蘿下腳料計，收率0.054-0.103%。

E. 在菠蘿蛋白酶活力測定中，氫氧化鈉為什麼能終止酶反應 具體是怎麼作用的，改變PH使沒失活嗎

強酸和強鹼還有重金屬都能使蛋白酶失去活性，不可逆的過程。氫氧化鈉是強鹼，所以破壞了酶活性所以終止反應

F. 目前蛋白質的精確定量檢測方法都有哪些

蛋白質鑒定是指對復配類蛋白品通過前處理提純並通過生物質譜鑒定蛋白種類及含量（包括具體的分子量、定性、定量結果）或對純蛋白品通過生物質譜鑒定具體的蛋白類型（包括具體的分子量、定性、定量結果）。
蛋白質種類鑒定業務范圍：

水溶性蛋白、水解酶、蛋白酶、脂肪酶； 血清蛋白（白蛋白和球蛋白）、牛血清（白）蛋白、血清球蛋白； 乳清蛋白、復合蛋白質、乳清蛋白粉、β-乳球蛋白，α-乳白蛋白，免疫球蛋白，乳鐵蛋白； 大豆分離蛋白、小麥蛋白（谷朊粉）、酪蛋白、纖維素酶、β-葡聚糖酶、內切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、澱粉酶、葡萄糖氧化酶、木聚糖酶、糖化酶； 鹼性蛋白酶、果膠酶、聚半乳糖醛酸水解酶、脂肪酶、過氧化氫酶、木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、彈性蛋白酶。 動物飼料，大米，油料種子、谷類食品、谷類，大豆、玉米、魚肉、果汁等各種食物中蛋白種類及含量。

G. 菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同，為什麼

菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同
蔗糖酶的提取及初提純試驗中影響酶得率得因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度、抑制劑、激活劑等。

實驗原理：
蔗糖酶分離提純原理： 酵母中的蔗糖酶含量很豐富，實驗以安琪酵母粉為原料，首先採用自溶法破碎細胞壁、再用乙醇分級和DEAE—纖維素柱層析兩步分離提純，制備純度較高的蔗糖酶制劑。酶分離提純的原理與蛋白質的相同。但酶是有催化活性的蛋白質，在分離提純過程中必須注意：防止酶變性失活；隨時測定酶的比活力，並跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度及得率。
有機溶劑分級純化蔗糖酶原理： 利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑—乙醇中溶解度的差異將蔗糖酶蛋白與其它蛋白質雜質進行有機溶劑分級沉澱，而使提取的蔗糖酶得以純化（32％的乙醇飽和度沉澱分離雜蛋白，47.5％的乙醇飽和度沉澱分離酶蛋白）。操作必須在低溫下進行且避免有機溶劑局部過濃；分離後應立刻除去有機溶劑並用水或緩沖溶液溶解沉澱的酶蛋白（復溶），確保酶的活性；pH多選在酶蛋白的等電點附近；有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度減少變性，提高分離效果。
蔗糖酶的離子交換層析法純化原理： 本實驗採用DEAE-纖維素（DEAE-C11）微粒狀的、弱鹼性的陰離子纖維素為柱料，進行蔗糖酶的進一步純化。它具有解析度高、化學性質穩定、有開放性的長鏈結構、有較大的表面積、對蛋白質的吸附容量大等優點；纖維素上離子基團的數量不多，排列疏散，對蛋白質的吸附不是太牢固，用緩和的洗脫條件即可達到分離的目的，不致引起蛋白質的變性。
蔗糖酶活力與比活的測定：在蔗糖酶的純化過程中，通過3、5-二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化蔗糖生成還原糖的量，測定酶活力大小，跟蹤酶的活力。在本實驗條件下，每3min釋放lmg還原糖所需的酶量定義為一個活力單位；通過Folin法測定酶蛋白的含量，計算蔗糖酶的比活。單位質量的酶蛋白中所含酶的活力稱為酶的比活。
主要實驗器材：
1. 試管、血糖管； 2. 秒錶； 3. 冰鹽浴； 4. 恆溫水浴； 5.離心機；6. 721- 型分光光度計；7. 柱層析裝置； 8. 梯度洗脫裝置；9. 部分收集器；10. 電磁攪拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纖維素。

H. 什麼是菠蘿蛋白酶

是一種蛋白質水解酶（異性蛋白）。提煉出來以後有很強的分解纖維蛋白和血凝塊的作用，所以在醫療上有用。菠蘿中的少量菠蘿蛋白酶吃到胃裡後就被胃液分解破壞。但是有少數人對這種酶有過敏反應。吃後15分鍾到1小時左右出現劇烈腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉，四肢潮紅、蕁麻疹，頭痛、頭暈、口舌發麻等症狀。嚴重的還會發生呼吸困難、神志模糊、休克，危及生命。 因此，鮮菠蘿最好不要直接食用，安全的方法是將菠蘿切塊，然後浸在鹽水中半小時後食用。這樣一來可去除以上三種危險物質，二來增加口感，酸酸甜甜的更加爽口喲，不妨一試。

I. 菠蘿蛋白酶的提取

菠蘿蛋白酶(Bromelain，簡稱菠蘿酶，亦稱為鳳梨酶或鳳梨酵素)是從菠蘿果莖、葉、皮提取出來，經精製、提純、濃縮、酶固定化、冷凍乾燥而得到的一種純天然植物蛋白酶。其外觀為淺灰色粉末狀，分子量為 33000 ，等電點為 9.55 。品質最佳的菠蘿蛋白酶是利用菠蘿的中莖加工,採用超濾方法進行過濾濃縮,低溫冷凍乾燥而得的。產品已被廣泛應用於食品、醫葯等行業。

一、菠蘿蛋白酶在食品加工業的應用

1、焙烤食品：將菠蘿蛋白酶加入生面團中，可使麵筋降解

J. SDS-PAGE測定純化的菠蘿蛋白酶分子質量實驗的關鍵是什麼

其分子量約33KD吧，我認為該實驗的關鍵是選擇合適的分離膠中丙烯醯胺的濃度，SDS-PAGE中不同濃度的膠適用於對不同大小的蛋白的電泳分離，33KD在10%-15%的膠中電泳是比較合適的，能夠和marker准確比較，從而得到准確結果。
你可參考：
丙烯醯胺在凝膠中的百分比(%) 分離膠的分辨范圍(KDa)
15 15-45
12.5 15-60
10 18-75
7.5 30-120
5 60-212