檢測生物大分子的離子化方法

1. 蛋白質、核酸等生物大分子為何能用離子交換色譜分離

蛋白質、核酸等生物大分子都帶有多個帶電荷基團，同時伴隨復雜的空間結構，因此會表現出在不同pH環境下帶不同電荷的表觀現象。以蛋白質為例，蛋白質有多個氨基酸組合而成，而氨基酸本身帶有氨基和羧基，二者在不同的pH環境下可帶正、負電荷，這就導致了氨基酸在不同pH環境下帶不同的電荷。人們根據生物大分子在不同的環境下帶電荷不同設計了離子交換來分離該大分子。當然這只是分離的一種手段，一般來說分離生物大分子會利用多種分子特性如疏水性等設計一系列分離方案，來得到純度較高的生物大分子。

2. LC-MS法 是什麼

高效液相色譜是一種准確度高，分離范圍廣的快速分離方法，它對化合物的結構破壞性小，適合有機分子和生物分子的分離。質譜具有其他分析方法無可比擬的靈敏度，對於未知化合物的結構分析定性十分准確，對相應的標准樣品要求也比較低。質譜可以和氣相聯用如GC/MS,也可以和高效液相色譜聯用如HPLC/MS。由於色譜和質譜靈敏度相當，再加上分離效果很好的色譜可以作為質譜的進樣系統，質譜作為色譜的鑒定儀速度快，分離好，應用廣。色譜-質譜聯用成為最好的用於分析微量有機混合物的儀器。
在1970年後，質譜-質譜法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛發展起來。這種方法讓母離子進一步裂解，從而獲得裂解過程和分子結構的信息，通常我們稱為串聯質譜，二維質譜法，序貫質譜等。
我們知道，質譜的分析建立在物質離子化的基礎上，按照荷質比分離離子，通過測量離子譜峰的強度實現分析目的。通過色譜純化後的樣品氣化離子化形成的離子在電場和磁場的綜合作用下，按照質量數和電荷數的比值大小依次排列成譜被記錄下來。常見的質譜圖的縱坐標是離子信號強度，橫坐標就是離子核質比。在液相色譜質譜中通常所用的離子源有ESI和APCI，我們常用的是ESI。ESI 是比APCI軟電離程度較小的電離方式，應用范圍較APCI 的大，只有少部分有機分子ESI 做不出，可以用APCI 輔助解決問題。 一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的應用范圍更廣一些。
ESI 和APCI通常產生(M+H)+或(M-H)-等準分子離子，源參數調整簡單，容易使用，儀器靈敏度高。對APCI源來說，不足就是給出的結構信息有限，樣品易發生熱裂解，低質量時基線雜訊大。ESI通常只產生分子離子峰，可以直接測定混合物，並可以測定熱不穩定的極性化合物。其易形成多電荷離子的特性可分析蛋白質和DNA 等生物大分子；通過調節離子源電壓控制離子的碎裂（源內CID）得到化合物的部分結構。
當然有機質譜也有自身局限性。有機分子多數有異構體，而質譜在立體化學方面區分能力差；色譜的重復性稍微差一些，需要嚴格控制操作條件，不能像NMR，IR等可以直接動手操作，需要專人負責；質譜有離子源的記憶效應，操作起來也很復雜；盡管如此，色譜-質譜聯用在天然產物的分析〔1〕，葯物代謝結合物（如苯丙酮尿症PKU）的測定〔2〕，葯物合成的監測（如Ractopamine）〔3〕具有重要的應用。美國耶魯大學教授J.Fenn等1984年首次發表ESI－MS的研究成果，並於1988年成功地進行了蛋白質的分析。
先天性疾病中有很大一部分是先天性遺傳代謝疾病，就目前醫學發展已經了解的有一百多種。這些疾病雖不致死，但是對患兒的智力和體格可能造成痴呆、殘缺和畸形，是家庭、社會、國家的沉重負擔。目前有30多種代謝失常遺傳性疾病如各種氨基酸代謝失常血症包括同構胱氨酸尿症、瓜氨酸血症、酪氨酸血症、超苯丙氨酸血症、精氨酸酶缺乏症、精氨琥珀酸尿症和各種超甲硫氨酸血症、短鏈和長鏈醯基輔酶A脫氫酶缺乏症(SCAD和LCAD)、異戊酸血症、丙酸血症、甲基丙二酸血症、戊二酸血症和其它各種有機酸代謝失常疾病等都可用LC/MS/MS進行臨床檢測〔4〕。
我們知道，保證葯品質量的一個重要方面是雜質檢查及限度控制，使用LC/MS/MS可以很方便的對葯品進行監控。Nicolas建立了不同批次抗癌葯物DuP941的LC/MS/MS譜圖達到質量控制目的；Rourick建立了鑒定葯品雜質的方法，利用LC/MS/MS功能鑒定頭孢羥氨苄降解產物的結構。對分析化學家來說是一個挑戰的體內葯物分析利用LC/MS/MS也顯示很大的優越性。有報道Takeshi對血液和尿液中11個添加的吩噻嗪類葯物進行分析，採用SPME和LC分離經MS/MS檢測。Wong開展了微透析-LC/MS/MS生物活體分析，將微透析探針插入動物的頸動脈，實時了解松果體素在體內的生化過程和代謝情況。LC/MS/MS還可以鑒別體液中很多葯物，這在很多文獻中都有報道〔5,6〕。
LC/MS/MS也用於生物技術中分子量的測定〔7〕。對分子量10000以上的蛋白質用離子噴霧技術進行精確的質量測定是常規的分析。有研究用離子噴霧測定甲硫酸氨基-人體生長激素(MET-HGH)的分子量為22,256.32±0.44Dr，與實際計算分子量22,256.2Dr相差很小。同聚丙烯醯胺凝膠電泳、蔗糖密度離心法等經典的蛋白質分子量測定技術相比，分析時間短，樣品消耗少，測定快捷准確。還有研究者利用LC/MS/MS開展DNA-葯物結合態的分析，蛋白質與金屬離子配位研究〔8〕。
司法鑒定中LC/MS/MS也是毒品檢測的一個有力工具〔9〕。Soenoff建立了新生嬰兒血液中苯甲醯愛康寧的確證方法，這就可以對可疑吸毒者出生的嬰兒進行鑒定。Clauwean用LC/MS/MS和LC/熒光檢測了頭發中可卡因及其代謝物，得到的結果是一致的，並且在很低的濃度時仍可以進行MS/MS全掃描。Wang對可卡因和它的15個代謝物的裂解機理在改變CID源和標准品的條件下進行了深刻探討，取得很大的成就。
LC/MS/MS在食品檢測中的地位更是不可低估。例如蜂蜜中氯黴素的LC/MS/MS 分析，魚肉中孔雀石綠的LC/MS/MS 分析，LC/MS/MS同時分析多種抗生素，動物組織中19種β腎上腺素興奮劑的檢測，蘇丹紅的LC-MS/MS方法的測定，水果和蔬菜中100種農葯及其代謝物的同時檢測，干炸食品中丙烯醯胺的測定。硝基呋喃是國際動物源性食品貿易的必檢項目,硝基呋喃類葯物主要包括呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因,用於治療和預防由埃希氏菌和沙門氏菌引起的哺乳動物消化道疾病。研究發現,呋喃西林、呋喃唑酮及其代謝物具有致癌作用〔10〕。
1995年歐盟禁止在食用動物中使用硝基呋喃類葯物, 2002年我國頒布了禁止使用該類獸葯的禁令〔11〕。雖然硝基呋喃類葯物代謝快而且對光敏感,母體化合物在動物體及產品中很快就降至檢出限以下,但其代謝物以蛋白結合物的形式在體內可殘留較長時間〔12，13〕。
目前,各國均將硝基呋喃代謝物作為指示硝基呋喃類葯物殘留的標示物。彭濤用高效液相色譜/串聯質譜(LC/MS/MS)法同時測定奶粉中呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因的代謝物。各界對此都進行了積極的研究〔14,15〕。
隨著科技發展，分析領域對儀器的要求的不斷提高，制葯行業對0.1%含量的雜質要求定性和定量，在增加檢測的選擇性和靈敏度基礎上得到更多化合物的信息和增加可分析化合物種類，對我們分析人員也是一種挑戰。HPLC/MS/MS結合了LC的強大的分離分析能力和MS靈敏的鑒定及結構解析能力，提供了可靠、精確的相對分子質量及結構信息，簡化了試驗步驟，節省了樣品准備時間和分析時間，作為當今最重要的分離和鑒定方法之一，在分析化學領域中發揮著更加重要的作用

3. MALDI和ESI哪個是更合適的離子化方法

和ESI
相比，相應的MALDI
對有較大分子量、更強疏水性和更低
等電點
的肽的檢測能力更強。對MS
檢測器的最優選擇基於何種應用。
離子化:
個人覺得MALDI
更高，因為相對來說單位的樣品可以得到的能量更為集中，且激光的能量更為可控，所以我個人的理解是其離子化的效率更高些。ESI
在氮吹過程中應該存在大部分樣品損失的情況。
傳輸效率:
我覺得這個仍然是
MALDI
更為有優勢。大家知道，MS
的性能與其真空度是正相關的，MALDI
對真空度不存在直接的對應
使用環境
，即可以實現很好的真空度。而
ESI
則不行。MALDI
類型的質譜儀高靈敏度的實現我想有以上事實很大一部分的功勞。
兩種離子源應該都是在其最優狀態下進行工作，而且樣品也是各自更為適用的類型。這樣的討論才具有可行性。
MALDI
在離子化效率問題上是弱於ESI
的，在離子傳輸效率上是強於ESI
的
ESI:
大分子且不易揮發。要加附加
電解質
使中性大分子帶電而被分離。主要看
分子離子峰
(正離子分離:+
Na+,
K+等;負離子分離:+
Cl-等)
MALDI:
一般有機分子到大分子都可以。分子先被離子化，成碎片進入質譜分析儀。能看到
碎片離子
峰。能得到較多的
化學信息
。

4. 用於微生物檢測鑒定的質譜技術主要有哪些

用於微生物檢測鑒定的質譜技術主要有哪些
質譜隨著科學技術的進步，20世紀80年代以來，有4種軟電離技術產生，分別為等離子體解吸（PD-MS）、快原子轟擊（FAB ）、電噴霧（ESI ）和基質輔助激光解吸/電離（MALDI）。
等離子體解吸的原理是：採用放射性同位素的核裂變碎片作為初級粒子轟擊樣品使其電離，樣品以適當溶劑溶解後塗布於0.5-1µm 厚的鋁或鎳箔上，核裂變碎片從背面穿過金屬箔，把大量能量傳遞給樣品分子，使其解吸電離。在制備樣品時，採用硝化纖維素作為底物使得PD-MS 可用以分析分子量高達14 000 的多肽和蛋白質樣品。
快原子轟擊的原理是，一束高能粒子，如氬、氙原子，射向存在於液態基質中的樣品分子而得到樣品離子，這樣可以得到提供分子量信息的準分子離子峰和提供化合物結構信息的碎片峰。快原子轟擊操作方便、靈敏度高、能在較長時間里獲得穩定離子流。當用於絕大多數生物體中寡糖及其衍生物的分析時，可測分子量達6000。而且在該質量范圍內，其靈敏度遠高於在15000 范圍
內新一代全加速儀器的靈敏度。此外，Camim 等採用FAB-MS 分析從Hafnia alvei中得到的四個寡糖組分，檢測到了NMR 不能觀測到的寡糖、並揭示了寡糖結構的非均一性。
電噴霧電離的原理是：噴霧器頂端施加一個電場給微滴提供凈電荷；在高電場下，液滴表面產生高的電應力，使表面被破壞產生微滴；荷電微滴中溶劑的蒸發；微滴表面的離子「蒸發」到氣相中，進入質譜儀。為了降低微滴的表面能，加熱至200～250℃，可使噴霧效率提高。FAB-MS 可以顯示碎片離子，但只能產生單電荷離子，因此不適用於分析分子量超過分析器質量范圍的分子。ESI 可以產生多電荷離子，每一個都有準確的小m/z 值。此外還可以產生多電荷母離子的子離子，這樣就可以產生比單電荷離子的子離子更多的結構信息。而且，ESI-MS 可以補充或增強由FAB 獲得的信息，即使是小分子也是如此。
質譜儀
基質輔助激光解吸離子化質譜（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS) 是20世紀80 年代末問世並迅速發展起來的質譜分析技術。這種離子化方式產生的離子常用飛行時間(time of flight，TOF)檢測器檢測，因此MALDI常與TOF一起稱為基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技術，使傳統的主要用於小分子物質研究的質譜技術發生了革命性的變革，從此邁入生物質譜技術發展新時代。該技術的特點是採用被稱為「軟電離」方式，一般產生穩定分子離子，因而是測定生物大分子分子量的有效方法，廣泛地運用於生物化學，尤其對蛋白質、核酸的分析研究已經取得了突破性進展。MALDI-MS 在糖研究中的應用，也顯示出一定的潛力和應用前景。另外在高分子化學、有機化學、金屬有機化學、葯學等領域也顯示出獨特的潛力和應用前景，已經成為廣大科技工作者研究於分析大分子分子質量、純度、結構的理想工具。其廣泛應用於生物化學領域，

5. 實驗室測定蛋白質分子量的方法有哪些

測定蛋白質分子量的常用方法：

粘度法、凝膠過濾層析法、凝膠滲透色譜法、SDS-凝膠電泳、滲透壓法、質譜法包括電噴霧離子化質譜技術和基質輔助激光解吸電離質譜技術、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速離心法）。

1、粘度法

一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。

如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之間的經驗關系式為：

8、電噴霧離子化質譜技術

電噴霧離子化質譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最後液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質譜技術。ESI-MS 測定蛋白質大分子是根據一簇多電荷的質譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質的分子量，由於ESI-MS可以產生多電荷峰，因此使得測試的分子質量范圍大大擴大。

優缺點：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費；（2）對樣品分子質量測試靈敏度、分辨力和准確度都相當高；（3）能夠方便地與多種分離技術聯用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發性、熱不穩定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。

9、基質輔助激光解吸電離質譜技術

基質輔助激光解吸電離質譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量後，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化並離子化。基體的作用在於保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質子轉移到生物分子或從生物分子得到質子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。

優缺點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質量分析器的不斷改進、新的基質的不斷發現和應用以及延遲萃取技術的使用，使得MALDI-MS 的最高解析度不斷提高，甚至超過ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰佔主要部分，碎片峰少，非常有利於對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發成分，降低了對樣品預處理的要求；（4）MALDI-TOF 質譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣的。

6. 什麼是基質輔助激光解吸附離子化質譜法

MALDI(Matrix Assisted Laser Desorption)
基質輔助激光解吸離子化，是一種用於大分子離子化方法，利用對使用的激光波長范圍具有吸收並能提供質子的基質（一般常用小分子液體或結晶化合物），將樣品與其混合溶解並形成混合體，在真空下用激光照射該混合體，基體吸收激光能量，並傳遞給樣品，從而使樣品解吸離子化。MALDI的特點是準分子離子峰很強。通常將MALDI用於飛行時間質譜和FT-MS，特別適合分析蛋白質,多肽等大分子。
它是一種脈沖式電離源

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7. 質譜法中EIS離子化和EI電離有什麼不同

電噴霧電離(electrospray ionization,ESI )電離源.質譜儀中較為常用的一種離子化方式.電噴霧離子源屬於一種軟電離源,能使大質量的有機分子生成帶多電荷的離子,通常認為電噴霧可以用兩種機制來解釋.（1）小分子帶電殘基機制：在噴針針頭與施加電壓的電極之間形成強電場,該電場使液體電,帶電的溶液在電場的作用下向帶相反電荷的電極運動,並形成帶電的液滴,由於小霧滴的分散,比表面增大,在電場中迅速蒸發,結果使帶電霧滴表面單位面積的場強極高,從而產生液滴的「爆裂」重復此過程,最終產生分子離子.(2)大分子離子蒸發機制：首先也是電場使溶液帶電,結果形成帶電霧滴&帶電的霧滴在電場作用下運動並迅速去溶,溶液中分子所帶電荷在去溶時被保留在分子上,結果形成離子化的分子.一般來講,電噴霧方法適合使溶液中的分子帶電而離子化.離子蒸發機制是主要的電噴霧過程,但對質量大的分子化合物,帶電殘基的機制也會起相當重要的作用.電噴霧也可測定中性分子,它是利用溶液中帶電的陽離子或陰離子吸附在中性分子的極性基團上而產生分子離子.EI:電子電離源(Electron Ionization EI) 電子電離源又稱EI源,是應用最為廣泛的離子源,它主要用於揮發性樣品的電離.圖9.1是電子電離源的原理圖,由GC或直接進樣桿進入的樣品,以氣體形式進入離子源,由燈絲F發出的電子與樣品分子發生碰撞使樣品分子電離.一般情況下,燈絲F與接收極T之間的電壓為70伏,所有的標准質譜圖都是在70ev下做出的.在70ev電子碰撞作用下,有機物分子可能被打掉一個電子形成分子離子,也可能會發生化學鍵的斷裂形成碎片離子.由分子離子可以確定化合物分子量,由碎片離子可以得到化合物的結構.對於一些不穩定的化合物,在70ev的電子轟擊下很難得到分子離子.為了得到分子量,可以採用1020ev的電子能量,不過此時儀器靈敏度將大大降低,需要加大樣品的進樣量.而且,得到的質譜圖不再是標准質譜圖.離子源中進行的電離過程是很復雜的過程,有專門的理論對這些過程進行解釋和描述.在電子轟擊下,樣品分子可能有四種不同途徑形成離子：樣品分子被打掉一個電子形成分子離子.分子離子進一步發生化學鍵斷裂形成碎片離子.分子離子發生結構重排形成重排離子.通過分子離子反應生成加合離子.此外,還有同位素離子.這樣,一個樣品分子可以產生很多帶有結構信息的離子,對這些離子進行質量分析和檢測,可以得到具有樣品信息的質譜圖.電子電離源主要適用於易揮發有機樣品的電離,GC-MS聯用儀中都有這種離子源.其優點是工作穩定可靠,結構信息豐富,有標准質譜圖可以檢索.缺點是只適用於易汽化的有機物樣品分析,並且,對有些化合物得不到分子離子

8. 檢測生物大分子在細胞組織中分布的常用方法有哪些

1.PAS反應顯示糖原
2.福爾根反應後的DNA吸收546nm可見光特性，採用顯微分光光度檢測細胞中的含量
3.米倫反應檢測蛋白質
4.蘇丹Ⅲ，四氧化鋨脂類顯色

9. 質譜的技術

質譜隨著科學技術的進步，20世紀80年代以來，有4種軟電離技術產生，分別為等離子體解吸（PD-MS）、快原子轟擊（FAB ）、電噴霧（ESI ）和基質輔助激光解吸/電離（MALDI）。
等離子體解吸的原理是：採用放射性同位素的核裂變碎片作為初級粒子轟擊樣品使其電離，樣品以適當溶劑溶解後塗布於0.5-1µm 厚的鋁或鎳箔上，核裂變碎片從背面穿過金屬箔，把大量能量傳遞給樣品分子，使其解吸電離。在制備樣品時，採用硝化纖維素作為底物使得PD-MS 可用以分析分子量高達14 000 的多肽和蛋白質樣品。
快原子轟擊的原理是，一束高能粒子，如氬、氙原子，射向存在於液態基質中的樣品分子而得到樣品離子，這樣可以得到提供分子量信息的準分子離子峰和提供化合物結構信息的碎片峰。快原子轟擊操作方便、靈敏度高、能在較長時間里獲得穩定離子流。當用於絕大多數生物體中寡糖及其衍生物的分析時，可測分子量達6000。而且在該質量范圍內，其靈敏度遠高於在15000 范圍
內新一代全加速儀器的靈敏度。此外，Camim 等採用FAB-MS 分析從Hafnia alvei中得到的四個寡糖組分，檢測到了NMR 不能觀測到的寡糖、並揭示了寡糖結構的非均一性。
電噴霧電離的原理是：噴霧器頂端施加一個電場給微滴提供凈電荷；在高電場下，液滴表面產生高的電應力，使表面被破壞產生微滴；荷電微滴中溶劑的蒸發；微滴表面的離子「蒸發」到氣相中，進入質譜儀。為了降低微滴的表面能，加熱至200～250℃，可使噴霧效率提高。FAB-MS 可以顯示碎片離子，但只能產生單電荷離子，因此不適用於分析分子量超過分析器質量范圍的分子。ESI 可以產生多電荷離子，每一個都有準確的小m/z 值。此外還可以產生多電荷母離子的子離子，這樣就可以產生比單電荷離子的子離子更多的結構信息。而且，ESI-MS 可以補充或增強由FAB 獲得的信息，即使是小分子也是如此。
質譜儀
基質輔助激光解吸離子化質譜（Matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry，MALDI-MS) 是20世紀80 年代末問世並迅速發展起來的質譜分析技術。這種離子化方式產生的離子常用飛行時間(time of flight，TOF)檢測器檢測，因此MALDI常與TOF一起稱為基質輔助激光解吸離子化飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)。MALDI-TOF-MS技術，使傳統的主要用於小分子物質研究的質譜技術發生了革命性的變革，從此邁入生物質譜技術發展新時代。該技術的特點是採用被稱為「軟電離」方式，一般產生穩定分子離子，因而是測定生物大分子分子量的有效方法，廣泛地運用於生物化學，尤其對蛋白質、核酸的分析研究已經取得了突破性進展。MALDI-MS 在糖研究中的應用，也顯示出一定的潛力和應用前景。另外在高分子化學、有機化學、金屬有機化學、葯學等領域也顯示出獨特的潛力和應用前景，已經成為廣大科技工作者研究於分析大分子分子質量、純度、結構的理想工具。其廣泛應用於生物化學領域，

10. 如何用液相色譜法分離生物大分子

疏水作用層析（Hydrophobic Interaction Chromatography,HIC）是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法.蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團,我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁,疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合.不同的分子由於疏水性不同,它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同,疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的.反向液相色譜RPC一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液,常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間.它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後,在非極性固定相中溶解度增大,從而使其分離效果改善.疏水作用層析：溶液配置簡單,性狀溫和,能保持蛋白活性,但操作復雜,分離效率低反向液相色譜：洗脫液要求高,蛋白變性,操作簡單,分離效率高