Ⅰ 熒光定量PCR操作步驟
熒光定量PCR操作步驟詳解：
1. RNA提取
- 從凍存裂解液中取樣並在室溫下溶解。
- 加入氯仿進行兩相分離，離心後，RNA位於水相上層，大約是TRIZOL試劑的60%。
- 將水相轉移到無RNA酶的離心管中，加入異丙醇沉澱RNA，4℃離心，RNA形成膠狀沉澱。
2. RNA處理
- 去除上清液，用75%乙醇清洗RNA沉澱，4℃離心。
- 乾燥RNA沉澱，使用無RNA酶的水溶解並保存。
3. RNA質量檢測
- 通過紫外吸收法測定濃度，稀釋1:100後於260nm和280nm波長處測吸光值。
- 濃度計算：A260 = 0.21，得到RNA濃度為840 μg/ml，總RNA量為29.4 μg。
- 純度檢測：A260/A280比值應在1.8至2.1之間以判斷純度。
4. cDNA合成
- 准備反應體系，包含逆轉錄酶和模板，6000rpm混勻後，依照特定步驟進行逆轉錄和熱處理。
5. PCR擴增
- 制備β-actin標准品梯度，反應體系包括SYBR Green染料、引物和Taq酶，進行40個循環的擴增。
- 對待測樣品和管家基因進行實時定量PCR擴增，配置反應體系。
6. PCR產物分析
- 制備單一特異性擴增條帶的PCR產物，進行10倍梯度稀釋。
- 實時定量PCR後，通過電泳檢測產物，以確認擴增結果的特異性。
7. 引物設計
- 使用Primer Premier 5.0軟體設計引物，確保引物與模板互補，避免形成二聚體或錯配。
8. 結果觀察
- 通過電泳和染色觀察樣品和管家基因的PCR產物，以確認擴增條帶的特異性。
- 整個操作過程中，應嚴格注意細節，確保RNA質量和PCR反應的准確性。
Ⅱ RT-PCR的研究方法
RT-PCR是一種關鍵的分子生物學技術，它通過兩個步驟高效地擴增細胞RNA（mRNA）中的cDNA序列：反轉錄（RT）和聚合酶鏈反應（PCR）。首先，從總RNA或mRNA出發，通過反轉錄酶的作用，將RNA轉化為cDNA，隨後，以cDNA的第一鏈作為模板，通過特異性引物進行PCR擴增，生成大量目標基因的cDNA拷貝。這一過程描繪了基因表達的步驟，從DNA通過轉錄生成RNA，再到蛋白質的合成，通過單拷貝基因的放大機制，如蠶絲心蛋白的實例，突顯了mRNA表達水平調控功能的重要性。
PCR技術則是一個在特定條件下進行的酶促反應，通過變性、退火和延伸三個步驟，實現DNA序列的復制。逆轉錄酶，如RNA病毒內的酶，具有獨特的功能，能將RNA轉化為cDNA，形成完整的雙鏈分子。在RT-PCR實驗中，Ct值是一個關鍵概念，它代表PCR循環中熒光信號達到增長階段拐點的循環次數，具有良好的重現性和與模板拷貝數的線性關系，用於定量分析。
在實際操作中，RT-PCR涉及RNA提取、Ct值的合理范圍（15-35）和注意事項，如使用超微量分光光度計進行精確測量，其特性包括小體積樣本處理、寬測量范圍和實時濃度讀取。同時，OD260/280比值用於評估樣本純度，理想的比值范圍在1.9-2.0，表明RNA純度高。最後，定量PCR儀的開關機順序也應嚴格遵循，以確保實驗結果的准確性。
Ⅲ 求RT-PCR 流程和注意事項
博凌科為-為你解答：RT-PCR實驗有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求： 1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。 2. RT按要求做，一般不會出太大問題。3. PCR，按常規。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。 1）RT和PCR時的引物設計是不是一定要先知道目的基因的序列？必須在RT時，引物設計有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴增的所有的cDNA（理論上），還要用此產物做PCR 的模板繼續擴增。如果用c方法，那麼要去那裡查它的序列呢？http://www.ncbi.nlm.nih.gov問題：在做RT-PCR遇到一怪現象，即對同一動物不同組織擴增同一段基因，結果從一種組織中可以擴出我的目的基因，條帶非常的好， 而另一組織在同樣的條件下卻得到許多非特異性的條帶，嘗試其他條件同樣無法得到滿意的結果，百思不得其解！（註：已肯定該基因在兩種組織中都表達，且內參照在兩種組織都可擴增出來）從這兩種組織中提取的RNA的量是不一樣的，我測過吸光度，差異還很大，會不會和這有關呢？ 請高手指教！解答：1.RT-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推 測是體系更加單一比較利於PCR的進行，當然也可能是我買的kit不太好。（promega）。2.RT-PCR應具備的條件高質量的RNA（保留後可做5，3RACE）；引物的（最好產物短點）；若涉及粗略定量的話還應考慮RNA的濃度或是cDNA的濃度（如果 由內標分子更好，但我發現其實很不容易將RNA的濃度以及內標 分子的表達量調整的完全一樣）；體系的均一性等。3.RACE我做過RACE（3RACE是寶生物的Kit；5RACE是Gibico），但現在再 進行另一個同源基因的3RACE時卻怎麼也P不出來，這兩個基因是由同一對引物擴增出來的，其中一個已經獲得了全序列（RACE的方法），而另一個基因 的3UTR卻增么也擴不出來，我推測是不是該基因的3UTR太長的緣故，我都快綠了，有無 RT-PCR的常用內標b－actin 和GAPDH的使用有選擇性嗎？比如不同的細胞，不同的刺激。有關內參： RT-PCR內參照可以在一個管子里做（那樣也是圖好看一些），最好分開兩管，把除了引物之外的mixture統一配，拍照後，算目的基因和內參的比值， 這就是基因表達的相對濃度。問：我曾經作過同一管的PCR，內有actin 和目的基因引物。雖然可見到兩條均一條帶但圖片質量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。請教mxbdna2003 ，你是如何處理同一管的PCR的各成分的濃度？答： it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR. it just was convienent to guess the amount ot the template(for RT and PCR) and bettrer for publication and editor if he don not know the preocere much. but the amount just using accurate piptte is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime. 在同一管中做RT，其實沒有什麼問題，不需要taq魅加量，taq酶本來就是過量的^-^，（平時做pcr的時候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八兩 就可以了，我想這肯定再很多貼子里應該都談到了。Mg就跟不能變了，一變整個體系就變了。能看到均一條帶就很好了。關鍵是摸，十八摸（太少，只爭朝夕，開個玩笑）雖然用不著，但是摸上3、5摸總是必要的，首先遙分開摸，然後再一起摸，直到摸的好了，還要考慮比較的不同 的模板中的量，所以我們不建議再同一管中進行，因為還有互相競爭抑制的問題，即使 不同基因之間。有關內參的建議：一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，著 我在好幾封帖子里都談了，再說一邊我得觀點，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達量，不是絕對表達量，除非你能准確知道來自多少細胞，但是 細胞還有死的呢。2、以電泳為基礎的半定量RT-PCR本身是不可信的，作為實驗的粗篩是可以的，但不能作為最終結果的，3、半定量RT-PCR應該再兩 管中進行，除非內參基因和目的基因表達相同，長度差不多，GC含量相似，或者實在窮的要省PCR管和taq。關於平台期和線性期的問題，實際上線性期是指數期，只不過碰巧2的冥和2的倍數是相同的。看上去任何一個時期都可以，實際上是不對的，因為牽涉到酶促動力 學的問題，這個我也不懂，有一些專門的文章，好像，涉及到很多化學的東西。我們學醫的，也沒必要知道那些，但是其中主要是因為模板引物酶原料和 buffer之間的關系，這種反應單靠改變其中一種成分沒有用的，酶一直是過量，再加酶也沒用，引物ntp都是這樣。煙鬼正傳，最好選線性期的開始階段， 但是要在你的凝膠成像分辨范圍內，所以選一個這兩種的契合點。給你一張圖你就明白了，再開始的時候酸的是切線，這圖我在 *** 帖過。關於引物設計，再可能的情況下，除了常規要求之外，最好兼顧跨內含子（不過，根據要求，還可以專門設計隔內含子的，這樣還可以用於基因組PCR）、長度小於500bp－600bp等等。引物當然要設計成一樣的退火溫度，即使不再一管中，也要一樣的，要在一台機器里啊。我的引物佔了冰箱一格，大部分是一個溫度，這樣任何幾個都可以拿來披， 也不用查。我反復說過了，別用軟體，就用眼睛看，軟體涉及的在好，有些基因在它出軟體 的時候，還沒發現呢，跟不要說在基因組的位置和序列了，怎麼考慮內含子的問題呢？ 18s的引物也和著名的actin一樣是設計的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用總RNA為模板，但是比actin和bubulin等可准多 了，更不要說GAPDH這個破爛了。18s除了在細胞中更相同（量）外，主要是它占的比例遠遠高於看家基因，所以定量更加准確，我想，不知對不對，請幾位 主任和eeflying指教。我認為，就像你用某一種東西的數量去概括，因該選那種多的東西，說一座房子是由2000塊磚造成的，比說又29根梁更准確 吧。更不要說沒有看家基因不看家的缺點，因為他是服務於整個基因組表達譜什麼的。PE有專門的用於實時PCR的內參試劑盒，就是用18s，不過我們看懂使用的那條序列，不 知有沒有人用過，告知其序列和genbank號。正好問一下，我查了一些序列，一直沒有去合成，主要是因為手上的actin的熒光探針還沒有完，當初和成了一堆。有那位高手用過18s的內參，請問您的序列（我指的是模板的序列）？原位雜交最好用RNA做探針，效果好一些，反正你有錢賣roche的盒子，而且量也能保證，因為轉錄過程嘛，沿著一條線突突地跑就是了。正義反義也容易理 清。我覺得做RT-PCR的方法和條件及應注意的事項就是那麼幾條,許多專業書都有詳細的描述,但是許多人還是歷經多次磨難，有時就是得不出結果。因此，我認 為因為每個人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有 他自己的特殊性,我的以下經歷說明：做實驗時各人的情況不同,做不出時還是要好好動一下腦子。記得我開始我的RT－PCR時，按常規方法，提取總RNA後，首先用自己設計的下游引物進行逆轉錄，不斷改變反應條件，進行了N次均沒有結果。後來考慮到 本人的克隆的PCR的片斷位於我們實驗另一位同學克隆的片斷當中，而該同學已經用RT-PCR克隆出她的片斷（盡管她用這些RT－PCR產物做模版再進行 PCR時也沒辦法重復出她的產物），因此，我先用她的引物和條件擴增出她的片斷，然後用她的RT－PCR產物作模板（有點改進，逆轉錄反應換用了 9mers隨機引物），用我的引進物進行一般PCR，終於得到我的產物，測序結果完全正確。盡管我的這個經歷別人很人遇到，但足可以說明實驗可以有自己的 模式，書本的知識和別人的經驗很重要，但有時也不定要受到書本框框和別人經驗的限制請問： 1 引物的特異退火溫度怎樣設定？可以根據gc 和at含量算出嗎？可以用引物報告單上的Tm值嗎？ 2 PCR時20微升體系中cDNA應加多少比較合適？MgCl2應加多少？各個成分的量有無確定標准？ 3 PCR結果跑電泳，actin有，但跑不出目的條帶，有幾種原因？與cDNA的量少有關嗎？Mg離子太多是否會抑制Taqase的活性？一般來說引物報告單傷得是對的,也可以自己算,實際上重要的各條引物一致,剩下的可以摸的. 20中是指體積還是量?只要不明顯改變體系的離子強度,加1,2ul都可以的.mg要調的,但我總覺得沒有書里講的那麼玄乎,我都是常年不變的. 如果內參照有,目的沒有,至少證明不是美麗惹的禍.原因書里應該都說了. 在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩 定，一般反應不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整 性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外 源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量 內源性的RNA酶。一、 防止RNA酶污染的措施 1. 所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。 2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。 3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。 4. 配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的 無菌雙蒸水配製，然後經0.22m濾膜過濾除菌。 5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。 6. 設置RNA操作專用實驗室，所有器械等應為專用。二、常用的RNA酶抑制劑 1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。 2. 異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強 烈的變性作用。 3. 氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。 4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結 合，使其失活。 5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。 mRNA的分離與純化真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特徵是具有5端帽子結構（m7G）和3端的Poly(A)尾巴。絕大多數哺乳類動物細胞mRNA的3端存在 20-30個腺苷酸組成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維 素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在於此。 mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。此法利用mRNA 3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或 在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經過兩次寡聚（dT）纖維柱後，即可得到較高純度的mRNA。寡聚(dT)纖維素柱純化mRNA 一、試劑准備 1．3M醋酸鈉（pH 5.2） 2．0.1M NaOH 3．1上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6)；0.5M NaCl；1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS(十二烷基氨酸鈉。配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒後按各成分確切含量，經混合後再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。 4．洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6)；1mM EDTA(pH 8.0)；0.05% SDS 5．無水乙醇、70%乙醇 6．DEPC 二、操作步驟 1．將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮於0.1M的NaOH溶液中。 2．用DEPC處理的1ml注射器或適當的吸管，將寡聚（dT）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。 3．使用1上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小於8.0。 4．將RNA溶解於DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫後加入等體2上樣緩沖液，混勻後上柱，立即收集流出液。當RNA 上樣液全部進入柱床後，再用1上樣緩沖液洗柱，繼續收集流出液。 5．將所有流出液於65℃加熱5min，冷卻至室溫後再次上柱，收集流出液。 6．用5-10倍柱床體積的1上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很 高，其內含物為無Poly(A)尾的RNA。後部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。 7．用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。 8．OD260測定Poly(A+)RNA分布，合並含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9．4℃離心，10000g15min，小心吸棄上清。用70%乙醇 洗滌沉澱。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉澱往往看不到]。4℃離心，10000g5min，棄上清，室溫晾乾。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。三、注意事項 1．整個實驗過程必須防止Rnase的污染。 2．步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫 育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結 合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。 3．十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下 溶解度下降，會阻礙柱內液體流動，若室溫低於18℃最好用LiCl替代NaCl。 4．寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯 存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。 5．一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5g Poly(A+)RNA，約相當於上柱總RNA量的1%-2%。RNA酶保護試驗((RNase Protection Assay,RPA)是通過液相雜交的方式,用反義RNA探針與樣品雜交，以檢測RNA表達的技術。與Northern雜交和RT-PCR比 較，RPA有以下幾個優點： 1． 檢測靈敏度比Northern雜交高。由於Northern雜交步驟中轉膜和洗膜都將造成樣品和探針的損失，使靈敏度下降，而RPA將所有雜交體系進行電 泳，故損失小，提高了靈敏度。 2． 由於PCR擴增過程中效率不均一和反應平台問題，基於PCR產物量進行分析所得數據的可靠性將下降，而RPA沒有擴增過程，因此，分析的數據真實性較 高。 3． 由於與反義RNA探針雜交的樣品RNA僅為該RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA樣品仍可進行分析。 4． 步驟較少，耗時短。與Northern雜交相比，省去了轉膜和洗膜的過程。 5． RNA-RNA雜交體穩定性高，無探針自身復性問題，無須封閉。 6． 一個雜交體系中可同時進行多個探針雜交，無競爭性問題。 7． 檢測分子長度可以任意設置，靈活性大。 RPA的缺點是需要同位素標記探針。一、試劑准備 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78l、100mM UTP 0.06l，加DEPC H2O至100l。 2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20l、5M NaCl 0.8ml、甲醯胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120l、1M Tris-HCl(pH7.4) 20l、0.5M EDTA（pH8.0）20l、RNase A(10mg/ml) 8l、RNase T1(250U/l) 1l，加DEPC H2O至2ml 二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制 備，本文介紹後者。（1）設計含T7啟動子的PCR引物由於PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5-端要含T7啟動子序列:T7啟動子序列為：5-TAATACGACTCACTATAGGG 引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好採用巢式 PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示：上游引物下游引物Ⅱ T7 啟動子序列下游引物Ⅰ（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。（3）探針合成標記與純化在0.5ml 離心管中加入下列試劑： RNasin （40U/l） 0.5lGACU POOL GAC（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61M） 2l[-32P]UTP(10Ci/l) 2.5lDTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1l5轉錄 buffer 2l模板（50ng/l） 1lT7 RNA 聚合酶 (15U) 1l混合後，短暫離心，37OC保溫1hr。加入DNaseⅠ（10U/l）1l, 37OC 15min, 然後75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。加入：飽和酚 50l氯仿 50l酵母tRNA（2g/l） 4lDEPC H2O 100l室溫下充分混勻，離心10000g2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100l氯仿，混勻，離心10000g2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10l、預冷無水乙醇250l，混勻後，-20OC靜置30min。4OC離心13500g10min。棄上清液，沉澱用75%乙醇100l洗 滌，4OC離心13500g2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50l雜交緩沖液溶解沉澱，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步 驟）。2．雜交（1） RNA提取後溶解在雜交緩沖液中，濃度為1g/l。（2）取8l RNA加入1-3l探針（根據探針檢測結果調整）於0.5ml 離心管中。（2） 80OC保溫2min，然後40-45OC下雜交12-18hr。3. 消化(1) 雜交管於37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。(2) 加入10%SDS 10l、10g/l蛋白酶K 20l，混勻，37 OC保溫10min。(3) 加入65l飽和酚和65l氯仿，混勻，室溫離心，10000g2min。(4) 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10l酵母tRNA和3M NaAc 15l，再加入200l異丙醇，混勻後，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g10min。(5) 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8l上樣緩沖液溶解沉澱。4、電泳與放射自顯影（1）配製凝膠：(50ml)40%丙烯醯胺-亞甲雙丙烯醯胺（19：1） 6.25ml 5TBE 10ml 尿素 24g 加H2O至50ml 溶解後加入25%過硫酸胺50l，TEMED 50l，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。（2）預電泳以1TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓後進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，准備加樣。（3）加樣將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。（3） 電泳結束後，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置於暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束後，將X光 片顯影、定影、水洗、晾乾。三、注意事項1．本實驗大部分為RNA操作，注意RNA酶的污染。2．RNase消化液消化未雜交的單鏈RNA和探針RNA，當探針與樣品之間有鹼基錯配時，錯配位點也將被消化，因此會產生片段較小的雜交片段。因此進 行PCR時，採取盡量減少錯配的措施。 3、 同位素對RNA合成有一定影響，有時會產生非全長的探針。因此，標記時間不宜過長。 4、 RNase消化液有時會產生過度消化而無檢測信號，可以將消化液稀釋10-100倍後使用。可能問題出在標本的保存：一般四小時之內就應處理，分離出細胞說的是套式PCR,可以在你的第一次PCR兩個引物內,再設計一對引物進行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR剛好包括目的片段,那隻好設計個更長的了第二次的引物設計要求可以低一點以50l體系為例引物各1l 第一次PCR產物5l 二次PCR和巢式PCR，即設計兩對引物進行擴增，不是一個概念，它是拿第一次的PCR產物，稀釋100-1000倍做模板，加入底物，從新進行擴增反 應，以期增加產物的量我做RT-PCR時,提總RNA時,都是用滅菌DEPC水,按1:100稀釋後測OD260和OD280,後根據公式:RNA濃度=OD260*稀釋度 /25(ug/ul),後用1mg total RNA分離mRNA.做逆轉錄及PCR,效果很好. luoyu10 wrote: 各位大哥：我有一個問題請教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低為多少，如果太低是不是會影響結果？最低到1.8，最好2.0，我感覺稍微低一點影響不算太大。問：我是RT－PCR的新手，想請教引物如何設計？好的引物所具有的令人滿意的特點： *典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著 更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。 *選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。 *設計5端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。 *避免引物對3末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。 *避免3末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。 *避免3末端的錯誤配對。3端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。 *避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互 補性和內部二級結構的檢測。有時候，僅有有限的序列信箱可供用於引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡並引物。簡並引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同鹼基可能性的不同 序列的混合物。為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的鹼基使用偏好，減少簡並性。次黃嘌呤可以同所有的鹼基配對，降低引物的退火溫度。不 要在引物的3端使用簡並鹼基，因為3端最後3個鹼基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度（1M到3M），因為許多簡並混合物中的 引物不是特異性針對目的模板。【經驗】如何確認RNA的質量各位都知道，提取到質量良好的RNA（包括總RNA和mRNA，以下同）是非常困難，關於RNA的提取技術，我就不說了，為什麼呢？或許各位非常關心呢， 我是這樣想的，我可以看到的資料或者是廠家的說明書，各位也同樣可以看到的，內容當 然都是一樣的了，所以實驗做的好不好，主要是心的投入多少的問題，所以希望大家自己多多思考啊！以下兩種方法，相信大家都知道的： 1）檢測RNA溶液的吸光度 280、320、230、260nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾濁度）、鹽濃度和蛋白等有機物的值。一般的，我們只看 OD260/OD280（Ratio，R）。 1.82.0時，我們認為RNA中蛋白或者時其他有機物的污染是可以容忍的，不過要注意，當你用Tris作為緩沖液檢測吸光度時，R值可能會大於2（一般 應該是2.2的）。當R1.8時，溶液中蛋白或者時其他有機物的污染比較明顯，你可以根據自己的需要決定這份RNA的命運。當 R2.2時，說明RNA已經水解成單核酸了。如果RNA的量夠，可在260nm（A260）用分光光度法測定RNA的得率，1個單位等於40ug/mlssRNA。純RNA的A260/A280的比 值為2.0。A260/A230的比值還表明RNA的純度，其值小於2.0表明裂解液中有亞硫氰胍和belta-巰基乙醇殘留，其值大於2.4，需用乙酸 鹽，乙醇沉澱RNA。 2）RNA的電泳圖譜一般的，RNA的電泳都是用變性膠進行的，但是根據我的經驗，如果你僅僅是為了檢測RNA的質量是沒有必要進行如此麻煩的實驗的，用普通的瓊脂糖膠就可以 了。電泳的目的是在於檢測28S和18S條帶的完整性和他們的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S條帶明亮、清晰、條帶銳利（指條帶的邊緣清晰），並且28S的亮度在18S條帶的兩倍以上，我們認為 RNA的質量是好的（見下圖）。以上是我們常用的兩種方法，但是這兩種方法都無法明確的告訴我們RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我們很難 察覺，但是大部分後續的酶學反應都是在37度以上並且是長時間進行的。這樣，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那麼在後續的實驗中就會有非常適合的 環境和時間發揮它們的作用了，當然這時你的實驗也就完了。下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。 3）保溫試驗方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。如果你的RNA樣本通過了保溫實驗的檢測並且你在後續的實驗中還是非常小心的防範RNA酶的騷擾，那麼你的實驗應該是很難失敗了！