Ⅰ 測啤酒酒精度時樣品的制備有哪些方法
啤酒微生物檢驗技術
1.1無菌室
1.1.1無菌室標准
無菌度：10000級；溫度：20℃－25℃；濕度：＜60%；壓力：0.5Pa，正壓，＜1.5Pa。
1.1.2無菌室管理
（1）微生物操作人員必須具有嚴格的無菌意識；
（2）操作人員要換上無菌室專用的工作服、鞋、帽、口罩，經風淋門進入；
（3）無菌室內始終保持正壓，防止外界空氣進入；
（4）外人不得進入無菌室，不用的物品應及時拿出；
（5）定期開紫外燈殺菌，休假日，紫外燈不關；
（6）每周做一次空間衛生檢查；
（7）每天工作之前和結束後，清掃無菌室。
1.1.3培養基
1.1.3.1培養基類型
（1）麥汁瓊脂培養基：檢出酵母；
（2）營養瓊脂培養基：檢出一般細菌；
（3）NBB（NBB－A、NBB－B、NBB－C）培養基：檢查啤酒有害菌。
1.1.3.2培養方法
（1）一般細菌使用營養瓊脂培養基，培養溫度37℃，有氧培養24小時；
（2）酵母使用麥汁瓊脂培養基，培養溫度25℃－28℃，有氧培養48小時；
（3）厭氧菌使用NBB培養基，培養溫度25℃－28℃，厭氧平板培養5天－7天，或液體培養1星期－2星期。
1.1.3.3結果鑒定
（1）鏡檢：液體培養基中觀察混濁沉澱的產生，固體培養基上觀察菌落的形成；
（2）產酸情況的觀察：若細菌產酸，則培養基的pH值在培養後會發生變化；
（3）聞氣味：有些有害菌的代謝產物具有特殊氣味，可根據培養後的氣味幫助鑒定；
（4）革蘭氏染色：用KOH實驗法判定菌落的革蘭氏陽性和陰性；
（5）過氧化氫酶實驗：將純菌落塗到乾燥的載玻片上，滴一滴3%過氧化氫液，好氧菌和兼性好氧菌含有過氧化氫酶，能分解過氧化氫：
過氧化氫酶
2H2O2————→2H2O＋O2
逸出的氧氣形成氣泡，顯示對過氧化氫酶實驗陽性；厭氧菌和兼性厭氧菌不能起反應，為過氧化氫酶實驗陰性。
1.1.4對大腸桿菌的檢測：大腸桿菌對啤酒廠來說是最嚴重的污染元素，因此，日常檢測非常重要。下面，就是我公司的檢測步驟：
1.1.4.1設備和材料
溫箱：36±1℃；水浴：44±0.5℃；天平；顯微鏡；均質器或乳體；溫度計；平皿；試管；吸管；載玻片。
1.1.4.2培養基及乳體
乳糖膽鹽發酵管；伊紅美藍發酵管；乳糖發酵管；蛋白腖水；革蘭氏染色液；靛基質試劑。
1.1.4.3大腸菌群檢驗程序（表1）
1.1.4.4操作步驟
（1）檢樣稀釋
①以無菌操作將檢樣25mL（或25g）放於含有225mL滅菌生理鹽水，或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠），或滅菌乳缽內，經充分震盪或研磨，做成1∶10的均勻稀釋液。②用1mL滅菌吸管吸取1∶10稀釋液1mL，注入含有9mL生理鹽水或其他稀釋液的試管內，振搖試管混勻，做成1∶100的稀釋液。
③另取1mL滅菌吸管，按上項操作依次做10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。
④根據食品衛生標准要求或對檢樣污染情況的估計，選擇3個稀釋度，每個稀釋度接種3管。
（2）乳糖發酵實驗
將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1mL以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管；1mL及以下者，用單料乳糖發酵管。每一稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如果所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。
（3）分離培養
將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內，培養18h—24h，然後取出，觀察菌落形態，並做革蘭氏染色和證實實驗。
（4）證實實驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1個—2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發酵管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陰性。
（5）報告
根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100mL（g）大腸菌群的最可能數。
1.2加強微生物檢測操作人員的培訓
（1）強化微生物檢測人員的無菌意識；
（2）提高微生物檢測人員的操作技能；
（3）微生物檢測人員一定要注意個人衛生；
（4）個人物品不準隨便放於無菌室內；
（5）上班後，立即更換工作服，不穿工作服不準進入無菌室；
（6）取樣要准確，確保取樣過程的無菌操作；
（7）加強無菌操作，杜絕因操作有誤引起的菌檢不合格；
（8）嚴格執行無菌室的殺菌程序，定期開紫外燈殺菌；
（9）加強學習，充分利用當前先進的檢測技術，爭取在最短檢測時間內通知車間。
1.3加強對取樣瓶和培養皿的衛生管理
（1）定期對取樣瓶和培養皿蒸汽殺菌，要求溫度在120℃，時間≥30分鍾；
（2）用完後，取樣瓶和培養皿須及時刷洗，以備殺菌再用；
（3）超過20天的取樣瓶和培養皿，不能再取樣使用，必須重新殺菌後再用；
（4）殺菌後的取樣瓶和培養皿保存好，杜絕二次污染。
1.4取樣
保證無菌操作。
1.4.1取樣閥應具備條件
（1）無殺菌死角，保證無菌狀態；
（2）壓縮空氣的取樣閥應設置在過濾器後直接通往使用區的管路上，每一分管可以反映各自的無菌
狀態；
（3）管路盡可能縮短；
（4）高度應距地面1.2m－1.5m，有利於取樣的無菌操作。
1.4.2取樣方法
先用酒精噴燈灼燒取樣口，放掉一部分樣液（防止因取樣口溫度較高，取出的樣品細菌數比實際少），再用酒精噴燈封口，在無菌狀態下快速用無菌瓶取樣。
1.5啤酒病害微生物
1.5.1啤酒有害菌對產品的不良影響
（1）產生異味；
（2）引起混濁和沉澱；
（3）黏度提高；
（4）壓力升高。
1.5.2野生酵母（表2）
指不為啤酒正常生產所用，在啤酒釀造過程中，易引起不正常發酵或產生病害的異種酵母。
1.5.3細菌（表3）
分革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。
2微生物污染途徑（表4）
3啤酒生產過程中的檢測點（表5）
4制麥的衛生管理
4.1微生物對大麥的影響
在田間侵染大麥的微生物被稱為「田間真菌」。麥穗剛從葉梢中露出就受到各種微生物的侵染，潮濕陰雨的天氣會增加大麥受污染的程度，生長後期倒伏也會使微生物大量生長，因此，無論是購買進口大麥還是國產大麥，都要把大麥的生長天氣考慮進去。
4.2微生物對倉儲大麥的影響
污染儲藏大麥的菌群主要是麴黴菌和青黴菌，其主要來源：一是田間感染；二是收獲和儲存過程中感染。因此，大麥的儲存條件，基本上就決定了這些微生物能否在大麥上進一步生長。其中，含水量和溫度很重要，含水量在13%以下，安全溫度為15℃，通常以7℃－9℃為好。4.3微生物對制麥過程的影響
大麥在制麥時的浸麥度達到43%－48%，發芽溫度12℃－18℃，該條件有利於微生物的繁殖。
4.4制麥微生物對啤酒質量的影響
大麥和麥芽微生物的影響是貫穿啤酒生產始終的。制麥時微生物過多，會抑制大麥的發芽，使麥芽溶解不良、增加色度、產生不良異味。同時在啤酒生產中，降低了啤酒的氣體穩定性，可引起啤酒的噴涌。關於啤酒噴涌的原因，目前發現主要是由於大麥和麥芽受到微生物的污染而引起的，如交鏈孢霉、黃麴黴等。此外，污染微生物還能影響膠體的穩定性。
轉自：a href="food.ocn/200884/Info200884471.html" target="_blank"food.ocn/200884/Info200884471.html/a
Ⅱ 微生物生長的常用檢測方法
一、生長量測定法
1.1體積測量法：又稱測菌絲濃度法。
通過測定一定體積培養液中所含菌絲的量來反映微生物的生長狀況。方法是，取一定量的待測培養液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設定一定的離心時間（如5分鍾）和轉速（如5000rpm），離心後，倒出上清夜，測出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測定法是大規模工業發酵生產上微生物生長的一個重要監測指標。這種方法比較粗放，簡便，快速，但需要設定一致的處理條件，否則偏差很大，由於離心沉澱物中夾雜有一些固體營養物，結果會有一定偏差。
1.2稱乾重法：
可用離心或過濾法測定。一般乾重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測培養液倒入離心管中，設定一定的離心時間和轉速，進行離心，並用清水離心洗滌1-5次，進行乾燥。乾燥可用烘箱在105℃或100℃下烘乾，或採用紅外線烘乾，也可在80℃或40℃下真空乾燥，乾燥後稱重。如用過濾法，絲狀真菌可用濾紙過濾，細菌可用醋酸纖維膜等濾膜過濾，過濾後用少量水洗滌，在40℃下進行真空乾燥。稱乾重發法較為煩瑣，通常獲取的微生物產品為菌體時，常採用這種方法，如活性乾酵母（activitydryyeast,ADY）,一些以微生物菌體為活性物質的飼料和肥料。
1.3比濁法：
微生物的生長引起培養物混濁度的增高。通過紫外分光光度計測定一定波長下的吸光值，判斷微生物的生長狀況。對某一培養物內的菌體生長作定時跟蹤時，可採用一種特製的有側臂的三角燒瓶。將側臂插入光電比色計的比色座孔中，即可隨時測定其生長情況，而不必取菌液。該法主要用於發酵工業菌體生長監測。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計，在波長600nm處用比色管定時測定發酵液的吸光光度值OD600，以此監控E.Coli的生長及誘導時間。
1.4菌絲長度測量法：
對於絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養基上測定一定時間內菌絲生長的長度，或是利用一隻一端開口並帶有刻度的細玻璃管，到入合適
的培養基，卧放，在開口的一端接種微生物，一段時間後記錄其菌絲生長長度，藉此衡量絲狀微生物的生長
二、微生物計數法
2.1血球計數板法:
血球計數板是一種有特別結構刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個平台，兩嵴的表比兩平台的表面高0.1mm，每個平台上刻有不同規格的格網，中央0.1mm2面積上刻有400個小方格。通過油鏡觀察，統計一定大格內微生物的數量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數。這種方法簡便，直觀，快捷，但只適宜於單細胞狀態的微生物或絲狀微生物所產生的孢子進行計數，並且所得結果是包括死細胞在內的總菌數。
2.2染色計數法：
為了彌補一些微生物在油鏡下不易觀察計數，而直接用血球計數板法又無法區分死細胞和活細胞的不足，人們發明了染色計數法。藉助不同的染料對菌體進行適當的染色，可以更方便的在顯微鏡下進行活菌計數。如酵母活細胞計數可用美藍染色液，染色後在顯微鏡下觀察，活細胞為無色，而死細胞為藍色。
2.3比例計數法：
將已知顆粒（如黴菌孢子或紅細胞）濃度的液體與一待測細胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數出各自的數目，即可得未知菌液的'細胞濃度。這種計數方法比較粗放。並且需要配製已知顆粒濃度的懸液做標准。
2.4液體稀釋法：
對未知菌樣做連續十倍系列稀釋，根據估計數，從最適宜的三個連續的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15隻裝培養液的試管中，經培養後記錄每個稀釋度出現生長的試管數，然後查最大或然數表MPN（mostprobablynumber）得出菌樣的含菌數，根據樣品稀釋倍數計算出活菌含量。該法常用於食品中微生物的檢測，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
2.5平板菌落計數法：
這是一種最常用的活菌計數法。將待測菌液進行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養基在凝固前均勻混合，或將菌液塗布於已凝固的固體培養基平板上。保溫培養後，用平板上出現的菌落數乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數。一般以直徑9cm的平板上出現50-500個菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術。平板菌落計數法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數，而且同時將菌液中的細菌進行了一次分離培養，獲得了單克隆。
2.6試劑紙法：
在平板計數法的基礎上，發展了小型商品化產品以供快速計數用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無色）待蘸取測試菌液後置密封包裝袋中培養。短期培養後在濾紙上出現一定密度的玫瑰色微小菌落與標准紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計數快捷准確，相比而言避免了平板計數法的人為操作誤差。
2.7膜過濾法：
用特殊的濾膜過濾一定體積的含菌樣品，經丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細胞的熒光，活細胞會發橙色熒光，而死細胞則發綠色熒光。
2.8生理指標法：
微生物的生長伴隨著一系列生理指標發生變化，例如酸鹼度，發酵液中的含氮量，含糖量，產氣量等，與生長量相平行的生理指標很多，它們可作為生長測定的相對值。
2.9測定含氮量：
大多數細菌的含氮量為乾重的12.5%，酵母為7.5%，黴菌為6.0%。根據含氮量×6.25，即可測定粗蛋白的含量。含氮量的測定方法有很多，如用硫酸，過氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測N2氣法。Dumas測N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱後產生氮氣，收集在呼吸計中，用KOH吸去CO2後即可測出N2的量。
2.10測定含碳量：
將少量（乾重0.2-2.0mg）生物材料混入1毫升水或無機緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在1000C下加熱30分鍾後冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長下讀取吸光光度值，即可推算出生長量。需用試劑做空白對照，用標准樣品做標准曲線。
2.11還原糖測定法：
還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過還原糖的測定可間接反映微生物的生長狀況，常用於大規模工業發酵生產上微生物生長的常規監測。方法是，離心發酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鍾，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點時加入澱粉溶液，繼續加Na2S2O3至終點，查表讀出還原糖的含量。
2.12氨基氮的測定：
方法是，離心發酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應數刻，加入0.02N的使之變色，根據NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據培養液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長狀況。
2.13其他生理物質的測定：
P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙醯胞壁酸）等含量以及產酸，產氣，產CO2（用標記葡萄糖做基質），耗氧，黏度，產熱等指標，都可用於生長量的測定。也可以根據反應前後的基質濃度變化，最終產氣量，微生物活性三方面的測定反映微生物的生長。如我所在BMP-2的發酵生產上，隨時監測溶氧量的變化和酸鹼度的變化，判斷細菌的長勢。
拓展：微生物的現代定義
肉眼難以看清，需要藉助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物包括細菌、病毒、真菌和少數藻類等。（但有些微生物是肉眼可以看見的，像屬於真菌的蘑菇、靈芝等。）病毒是一類由核酸和蛋白質等少數幾種成分組成的「非細胞生物」，但是它的生存必須依賴於活細胞。根據存在的不同環境分為空間微生物、海洋微生物等，按照細胞結構分類分為原核微生物和真核微生物。
微生物的主要特徵
體小面大
一個體積恆定的物體，被切割的越小，其相對表面積越大。微生物體積很小，如一個典型的球菌，其體積約1mm，可是其表面積卻很大。這個特徵也是賦予微生物其他如代謝快等特性的基礎。
吸多轉快
微生物通常具有極其高效的生物化學轉化能力。據研究，乳糖菌在1個小時之內能夠分解其自身重量1000-10000倍的乳糖，產朊假絲酵母菌的蛋白合成能力是大豆蛋白合成能力的100倍。
生長繁殖快
相比於大型動物，微生物具有極高的生長繁殖速度。大腸桿菌能夠在12.5-20分鍾內繁殖1次。不妨計算一下，1個大腸桿菌假設20分鍾分裂1次，1小時3次，1晝夜24小時分裂24×3=72次，大概可產生4722366500萬億個（2的72次方），這是非常巨大的數字。但事實上，由於各種條件的限制，如營養缺失、競爭加劇、生存環境惡化等原因，微生物無法完全達到這種指數級增長。 已知大多數微生物生長的最佳pH范圍為7.0 (6.6~7.5)附近，部分則低於4.0。
微生物的這一特性使其在工業上有廣泛的應用，如發酵、單細胞蛋白等。微生物是人類不可或缺的好朋友。
適應強 易變異
分布廣 種類多
微生物對我們生活的影響
微生物對人類最重要的影響之一是導致傳染病的流行。在人類疾病中有50%是由病毒引起。微生物導致人類疾病的歷史，也就是人類與之不斷斗爭的歷史。在疾病的預防和治療方面，人類取得了長足的進展，但是新現和再現的微生物感染還是不斷發生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療葯物。一些疾病的致病機制並不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強大的選擇壓力，使許多菌株發生變異，導致耐葯性的產生，人類健康受到新的威脅。一些分節段的病毒之間可以通過重組或重配發生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導致感染的株型發生了變異，這種快速的變異給疫苗的設計和治療造成了很大的障礙。而耐葯性結核桿菌的出現使原本已近控制住的結核感染又在世界范圍內猖獗起來。
微生物千姿百態，有些是腐敗性的，即引起食品氣味和組織結構發生不良變化。當然有些微生物是有益的，它們可用來生產如乳酪，麵包，泡菜，啤酒和葡萄酒。微生物非常小，必須通過顯微鏡放大約1000 倍才能看到。比如中等大小的細菌，1000個疊加在一起只有句號那麼大。
微生物能夠致病，能夠造成食品、布匹、皮革等發霉腐爛，但微生物也有有益的一面。最早是弗萊明從青黴菌抑制其它細菌的生長中發現了青黴素，這對醫葯界來講是一個劃時代的發現。後來大量的抗生素從放線菌等的代謝產物中篩選出來。抗生素的使用在第二次世界大戰中挽救了無數人的生命。一些微生物被廣泛應用於工業發酵，生產乙醇、食品及各種酶制劑等；一部分微生物能夠降解塑料、處理廢水廢氣等等，並且可再生資源的潛力極大，稱為環保微生物；還有一些能在極端環境中生存的微生物，例如：高溫、低溫、高鹽、高鹼以及高輻射等普通生命體不能生存的環境，依然存在著一部分微生物等等。看上去，我們發現的微生物已經很多，但實際上由於培養方式等技術手段的限制，人類現今發現的微生物還只佔自然界中存在的微生物的很少一部分。
微生物間的相互作用機制也相當奧妙。例如健康人腸道中即有大量細菌存在，稱為正常菌群，其中包含的細菌種類高達上百種。在腸道環境中這些細菌相互依存，互惠共生。食物、有毒物質甚至葯物的分解與吸收，菌群在這些過程中發揮的作用，以及細菌之間的相互作用機制還不明了。一旦菌群失調，就會引起腹瀉。
隨著醫學研究進入分子水平，人們對基因、遺傳物質等專業術語也日漸熟悉。人們認識到，是遺傳信息決定了生物體具有的生命特徵，包括外部形態以及從事的生命活動等等，而生物體的基因組正是這些遺傳信息的攜帶者。因此闡明生物體基因組攜帶的遺傳信息，將大大有助於揭示生命的起源和奧秘。
工業微生物涉及食品、制葯、冶金、采礦、石油、皮革、輕化工等多種行業。通過微生物發酵途徑生產抗生素、丁醇、維生素C以及一些風味食品的制備等；某些特殊微生物酶參與皮革脫毛、冶金、採油采礦等生產過程，甚至直接作為洗衣粉等的添加劑；另外還有一些微生物的代謝產物可以作為天然的微生物殺蟲劑廣泛應用於農業生產。通過對枯草芽孢桿菌的基因組研究，發現了一系列與抗生素及重要工業用酶的產生相關的基因。乳酸桿菌作為一種重要的微生態調節劑參與食品發酵過程，對其進行的基因組學研究將有利於找到關鍵的功能基因，然後對菌株加以改造，使其更適於工業化的生產過程。國內維生素C兩步發酵法生產過程中的關鍵菌株氧化葡萄糖酸桿菌的基因組研究，將在基因組測序完成的前提下找到與維生素C生產相關的重要代謝功能基因，經基因工程改造，實現新的工程菌株的構建，簡化生產步驟，降低生產成本，繼而實現經濟效益的大幅度提升。對工業微生物開展的基因組研究，不斷發現新的特殊酶基因及重要代謝過程和代謝產物生成相關的功能基因，並將其應用於生產以及傳統工業、工藝的改造，同時推動現代生物技術的迅速發展。
經濟作物柑橘的致病菌是國際上第一個發表了全序列的植物致病微生物。還有一些在分類學、生理學和經濟價值上非常重要的農業微生物，例如：胡蘿卜歐文氏菌、植物致病性假單胞菌以及中國正在開展的黃單胞菌的研究等正在進行之中。日前植物固氮根瘤菌的全序列也剛剛測定完成。借鑒已經較為成熟的從人類病原微生物的基因組學信息篩選治療性葯物的方案，可以嘗試性地應用到植物病原體上。特別像柑橘的致病菌這種需要昆蟲媒介才能完成生活周期的種類，除了殺蟲劑能阻斷其生活周期以外，只能通過遺傳學研究找到毒力相關因子，尋找抗性靶位以發展更有效的控制對策。固氮菌全部遺傳信息的解析對於開發利用其固氮關鍵基因提高農作物的產量和質量也具有重要的意義。[10]
在極端環境下能夠生長的微生物稱為極端微生物，又稱嗜極菌。嗜極菌對極端環境具有很強的適應性，極端微生物基因組的研究有助於從分子水平研究極限條件下微生物的適應性，加深對生命本質的認識。