㈠ 普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟（二）
在科學研究中，每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世，從而推動著各學科的發展。縱觀形態研究領域，50年代電子顯微鏡引入形態學觀察領域，帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究；60-70年代，免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用，又將觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平，使細胞內眾多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位，對醫學生物學的發展無疑產生了深刻的影響。70年代，分子生物學技術在形態學中的廣泛應用，隨著原位雜交技術的出現，使組織細胞內特定的DNA或RNA序列能夠被定位，將蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位，從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化；80年代，分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鏈反應技術問世了，很快地就被引入形態學觀察的領域，使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世，必將帶來更多的研究成果，使形態學的研究又向前邁出一大步。
1基本原理
原位PCR技術的基本原理，就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來，從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。
PCR技術是在DNA聚合酶的作用下，經過模板的變性、退火和引物延伸三種循環，將引物引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增，經過擴增的靶序列（一般能擴增106倍），很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來，因此，PCR技術具有靈敏度高，特異性強的優勢，隨著熱循環自動化的提高與穩定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是，PCR技術是在液相中進行的，在擴增前，需將細胞破壞，從中提取核酸作為模板，因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態結構聯系起來，同時，也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。
原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來，保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定，以保持組織細胞的良好形態結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性，當進行PCR擴增時，各種成分，如引物，DNA聚合酶，核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內，以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板，於原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大，或互相交織，不易穿過細胞膜或在膜內外彌散，從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增，擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。
2 基本類型
根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記，原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類，此外，還有反轉錄原位PCR技術等。
2.1直接法原位PCR技術
直接法原位PCR技術是將擴增的產物直接攜帶標記分子，即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時，標記的分子就摻入到擴增的產物中，顯示標記物，就能將特定的DNA或RNA在標本（原位）中顯現出來。
常用的標記物有放射性同位素35S，生物素和地高辛，用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。
直接法原位PCR技術的優點是操作簡便，流程短，省時。缺點是特異性較差，易出現假陽性，擴增效率也較低，特別是在石蠟切片上，上述缺點更為突出。因為在製片過程中，無論是固定，脫水還是包埋，都會導致DNA的損害，而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復，這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中，造成假陽性。若用標記引物的方法進行直接法原位PCR，其擴增的效率比不標記更低。
2.2 間接法原位PCR技術
間接法原位PCR技術師現在細胞內進行特定DNA或RNA擴增，再用標記的探針進行原位雜交，明顯提高了特異性，是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。
間接法原位PCR與直接法不同的是，反應體系與常規PCR相同，所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現先擴增的目的，然後用原位雜交技術去檢測細胞內已擴增的特定的DNA產物，因此，實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術，故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。
間接法PCR技術的優點是特異性較高，擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。
2.3 原位反轉錄PCR技術
原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術應用到組織細胞標本中的一種新技術，與RT-PCR（液相）不同點在於，進行原位反轉錄PCR反應之前，組織標本要先用DNA酶處理，以破壞組織中的DNA酶，這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA，而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。
3 基本步驟
原位PCR技術的基本步驟包括標本的制備。原位擴增（PCR）及原位檢測等基本環節，現分述如下（重點以石蠟切片為例）。
3.1 標本的制備
原位PCR技術可應用於細胞懸液、細胞塗片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言，以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好，石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決，近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的，如：玻片上做PCR，熱傳導較差，熱對流不均勻，TaqDNA酶被玻璃片吸附等，更為主要的原因，可能是標本經製片後，細胞缺乏完整的胞漿或核膜，擴增產物易發生彌漫而導致擴增的產物在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定，石蠟包埋的形式保存的，若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題，意義顯然是十分重大的。
組織細胞的固定 一般認為組織細胞以10%的緩沖福爾馬林或4%的多聚甲醛固定後進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長，視組織的大小，一般以4℃4-6小時為宜。
切片的厚度 一般而言，切片若厚一些，原位PCR的效果也較好一些，因為切片越厚，靶DNA的含量也就越多，同時膜結構也較多，防止擴增產物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多，形態學觀察的效果就差了，解析度也將下降。
玻片的處理 為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落，在玻片應作防脫片處理，常用的方法是塗以多聚賴氨酸或用硅烷化處理，一般能防止組織脫落。
蛋白酶的消化作用 在進行原位擴增之前，組織標本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞，可增加其通透性，充分允許反應體系中的各成分進入細胞內，並能很好的暴露靶序列，以利於擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K，胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化後，要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除，因為只要有少量的殘留酶存在，都將對隨後進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產生毀滅性的影響。
蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性，有利於後續進行的各反應成分進入細胞內或核內，但同時也使得擴增產物的彌散機會增多，有可能帶來假陽性或假陰性的結果。
原位擴增（PCR）
原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應，其基本原理與液相PCR完全相同。
引物 PCR所用的引物一般為15-30bp為宜，擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp，RNA很少超過200bp，較長序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。
反應體系 原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同，由於是在經過固定的組織切片上進行，為獲得較好的擴增效果，有人主張反應體系中的引物，TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高於液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白（BSA）,以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。
熱循環 原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行，操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行，通常在樣品台上覆蓋一層鋁箔，製成平台，樣品台上的空間用礦物油或水充填，將載玻片至於平台上，即可進行熱循環的步驟。
為了保證進行充分的擴增，原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些，另外，也可採用熱啟動（hot start）的方法，即玻片加熱到80-94℃時，再立即加入TaqDNA聚合酶。
為了保證反應體系在熱循環過程不過多丟失，可用清亮的指甲油，礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。
洗滌 原位擴增結束後，標本應清洗，以除去彌散到細胞外的擴增產物。洗滌不充分，會導致擴增產物在檢測時顯現，造成背景過深或假陽性結果的出現。但是，洗滌過度，也會造成細胞內擴增的產物被洗脫，是陽性信號減弱或丟失。
有作者在擴增後用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鍾進行後固定，以使擴增的產物在檢測時能很好地保留在細胞內，提高檢測的敏感性和特異性。
原位檢測 原位PCR的擴增產物檢測方法，取決於原位PCR的設計方案，直接法則根據標記分子的性質對擴增產物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。
4 原位PCR技術的應用
原位PCR技術的突出優勢，就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質，可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。
4.1用於外源性基因的檢測
4.1.1病毒基因的檢測
感染病毒的細胞常無較好的檢測手段，但當原位PCR技術應用後，使這一極為困難的問題有望解決。
對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測，使我們能夠成功等觀察到這些病毒在艾滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用，能夠及時發現受感染的人群。
4.1.2細菌基因的檢測
最突出的應用是在結核桿菌的檢測上，當結核病變不夠典型時，經過特殊染色的方法很難在鏡下找到結核桿菌，而應用原位PCR技術可幫助明確診斷，當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。
4.1.3導入基因的檢測
在轉基因動物的研究中，是否導入了基因，在接受基因治療的患者體內，是否接受了導入的基因，均可用原位PCR技術來證實。因此，原位PCR技術成為重要的檢測手段。
4.2 用於內源性基因的檢測
4.2.1異常基因的檢測
機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測，原癌基因，抑癌基因的突變，惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排，對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。
4.2.2固有基因的檢測
對於機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因，原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力，液相PCR雖可進行擴增檢測出來，但不能確定含有該基因的細胞類型，原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足，使得我們能夠對人類各種基因進行檢測，而完成人類基因圖的繪制。
㈡ 血清學診斷 分子生物學診斷 什麼叫
常規血清學診斷技術
1.1血清凝集抑制試驗(HI)
因為許多動物病毒能夠凝集某種類動物的紅細胞,由於血凝反應可被特異性抗體所抑制,抗體與病毒結合後,血凝素即不能吸附於紅細胞表面的受體上。HI不象其它血清學試驗,不需要種屬特異的結合〔1,2〕,因此特異性不好。一般檢測快速,用於大量篩選野生或飼養的動物樣品中的抗體。
1.2 補體結合試驗(CF)
由於一個抗體分子與抗原結合後,可以導致數百個補體分子的激活,呈現一定的放大作用,所以補體結合試驗是一個比較敏感的方法。雖然在某些病毒型的鑒定上,補體結合試驗的檢測能力有時不及中和試驗和血凝抑制試驗,但補體結合試驗穩定,特異性高,重復性好,一直仍用於動物血清學中特異性抗體的定量檢測〔3〕。
1.3 免疫熒光抗體技術
通過顯微鏡標本的免疫熒光染色而顯示其結果,由於病毒抗原的標記比較困難,常用標記抗體檢查未知抗原,此技術具有抗原抗體反應的特異性和染色技術的快速性,並可以在細胞水平上進行抗原定位,故在病毒學研究和診斷中都是一種應用很廣的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可檢測海洋微生物,尤其是細菌〔8〕,避免了細菌培養,從而提供了特異、快速的檢測方法。
1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
ELISA是應用最廣的一項免疫學診斷技術,以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固相載體上,隨後的一系列免疫學和生物化學反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定試驗,無論是病毒病、禽傳染性支氣管炎抗體檢測〔9〕、禽多瘤病毒特異性抗體檢測〔10〕,還是細菌,例如牛布魯氏桿菌病〔11,12〕,或是寄生蟲引起的疾病、犬弓形體病〔13〕、羊肝片吸蟲〔14〕,都應用到了酶聯免疫吸附試驗技術。因此,ELISA在各種動物疾病診斷上發揮了重要的作用。ELISA作為根除控制計劃的初篩方法是非常理想的,費用相對較少,比常用的血清學方法有明顯的優點,不需要抗體的第二特徵,例如血凝性、結合補體的能力〔11〕,用時少,敏感性、重復性、特異性好,可篩選檢測大量的樣品〔15〕。利用純化的抗原,單克隆抗體可提高反應檢測的特異性〔9,10,11〕。
1.5 斑點酶聯免疫吸附試驗
將酶標反應板換成硝酸纖維膜,即為斑點酶聯免疫吸附試驗,將少量的試劑點在硝酸纖維膜或其它能結合蛋白的膜上,同抗原特異的抗體以及酶結合抗體反應,加入能形成不溶性有色沉澱的底物,使固相膜染色,形成有顏色的斑點,直接判讀結果。利什曼原蟲病〔16〕,牛呼吸道合包體病毒〔17〕,無鉤絛蟲〔18〕,免疫寄生蟲〔19〕,克服了顯微鏡檢查的麻煩。因硝酸纖維素膜吸附性能強,一般在包被後須再進行封閉。如將硝酸纖維素膜裁剪成膜條,並在同一張膜條上點有多種抗原,將整個膜條與同一份血清反應,則可同時獲得對多種疾病的診斷結果,3種主要禽類疾病的同時檢測〔20〕,多種蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已廣泛應用於動物疾病的診斷。
免疫血清學技術的發展趨向一直是高度特異性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,試驗電腦化,反應微量化,方法標准化和試劑商品化,以及方法簡便、快速。隨著生物化學和分子生物學等學科迅速發展,相繼出現了許多新的診斷技術,可以從分子水平對疾病的致病機理,診斷、治療和預防進行研究。
2與分子生物學技術相結合的診斷技術
2.1PCR-ELISA
將PCR技術與ELISA相結合的一種抗原檢測技術,又稱免疫PCR。該技術是由Sano T等在1992年建立的,其本質是一種以PCR技術代替酶反應來放大顯示抗原抗體結合率的改進ELISA,利用ELISA技術檢測PCR擴增的產物〔3〕。利用了PCR的指數擴增效率帶來極高的敏感度,同時又具有高的特異性的抗原檢測系統。用親和素包被微孔板,封閉後,加入標記於捕獲探針3』端的生物素,而捕獲探針5』端和待檢靶序列5』端的一段互補,通過生物素和親和素的交聯作用,將捕獲探針固定在微孔板上,製成固相捕獲系統。其次PCR緩沖液中加入一定比例的地高辛標記的DUTP,經PCR擴增後,擴增產物與微孔板上的捕獲探針進行液相雜交,帶有地高辛的靶序列即被捕獲,再在微孔板中加入用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗地高辛抗體,再加入底物如TMB顯色,進行ELISA檢測。
此法具有高靈敏度,檢測結果可靠,可以進行半定量檢測的優點,可用於病毒的檢測、疾病診斷和目的基因檢測。此方法較常規PCR靈敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鑒定PCR產物更快速,判定結果客觀,易於操作,尤其在篩選大量品時,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常規PCR中,由於非特異的產物和不名原因引起的條帶反應,而作出的主觀解釋〔23〕。可篩選大量食源性病原體,幫助加工廠監測食品的污染水平,進行危險品分析〔24〕。尤其在寄生蟲檢測方面,以前多用血塗片,而現在應用PCR-ELISA檢測牛巴
㈢ 什麼是PCR檢測他的原理是什麼需要什麼材料
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。
PCR技術簡史
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：「經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重復該過程便可克隆tRNA基因」。
PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之 間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點：①耐高溫，在70℃下反應2h後其殘留活性大於原來的90%，在93℃下反應2h後其殘留活性是原來的 60%，在95℃下反應2h後其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時不會被鈍化，不必在每次擴增反應後再加新酶。③大大提高了擴增片段特異性和擴增效 率，增加了擴增長度(2.0Kb)。由於提高了擴增的特異性和效率，因而其靈敏性也大大提高。為與大腸桿菌多聚酶I Klenow片段區別，將此酶命名為Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。此酶的發現使PCR廣泛的被應用。
PCR技術基本原理
PCR技術的基本原理 類似於DNA的 天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：①模板DNA的變性：模板DNA經加 熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引 物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸：DNA模板--引物結合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需 2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平台期(Plateau)所需循環次數取決於樣品中模板的拷貝。
PCR的反應動力學 PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數上升。反應最終的DNA 擴增量可用Y＝(1＋X)n計算。Y代表DNA片段擴增後的拷貝數，X表示平(Y)均每次的擴增效率，n代表循環次數。平均擴增效率的理論值為100%， 但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數增加，而進 入線性增長期或靜止期，即出現「停滯效應」，這種效應稱平台期數、PCR擴增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產物的竟爭等因素。大多數情 況下，平台期的到來是不可避免的。
PCR擴增產物 可分為長產物片段和短產物片段兩部分。短產物片段的長度嚴格地限定在兩個引物鏈5』端之間，是需要擴增的特定片段。短產物片段和長產物片段是由於引物所 結合的模板不一樣而形成的，以一個原始模板為例，在第一個反應周期中，以兩條互補的DNA為模板，引物是從3』端開始延伸，其5』端是固定的，3』端則沒 有固定的止點，長短不一，這就是「長產物片段」。進入第二周期後，引物除與原始模板結合外，還要同新合成的鏈(即「長產物片段」)結合。引物在與新鏈結合 時，由於新鏈模板的5』端序列是固定的，這就等於這次延伸的片段3』端被固定了止點，保證了新片段的起點和止點都限定於引物擴增序列以內、形成長短一致的 「短產物片段」。不難看出「短產物片段」是按指數倍數增加，而「長產物片段」則以算術倍數增加，幾乎可以忽略不計， 這使得PCR的反應產物不需要再純化，就能保證足夠純DNA片段供分析與檢測用。
PCR反應體系與反應條件
標準的PCR反應體系：
10×擴增緩沖液 10ul
4種dNTP混合物 各200umol/L
引物 各10～100pmol
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水至 100ul
PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產物的特異性取決於引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3』端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3』端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列資料庫的其它序列無明顯同源性。
引物量： 每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。
酶及其濃度 目前有兩種Taq DNA聚合酶供應， 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶，另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時)，濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。
dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度後，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0～7.5，小量分裝， -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配製)，如其中任何一種濃度不同於其它幾種時(偏高或偏低)，就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度，是PCR成敗與否的關鍵環節之一，傳統的DNA純化方法通常採用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。 SDS的主要功能是： 溶解細胞膜上的脂類與蛋白質，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離細胞中的核蛋白，SDS 還能與蛋白質結合而沉澱；蛋白酶K能水解消化蛋白質，特別是與DNA結合的組蛋白，再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份，用乙醇或異丙醇沉澱 核酸。提取的核酸即可作為模板用於PCR反應。一般臨床檢測標本，可採用快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離，直接 用於PCR擴增。RNA模板提取一般採用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響，在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200umol/L時，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高，反應特異性降低，出現非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性，使反應產物減少。
PCR反應條件的選擇
PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。
溫度與時間的設置： 基於PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標准反應中採用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火並結合到靶序列上，然後快速升溫至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對於較短靶基因(長度為100～300bp時)可採用二溫度點法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般採用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。
①變性溫度與時間：變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低於93℃則 需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性，就會導致PCR失敗。
②退火(復性)溫度與時間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發生結合。由於模板DNA 比引物復雜得多，引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長 度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)
復性溫度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允許范圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。
③延伸溫度與時間：Taq DNA聚合酶的生物學活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高於90℃時， DNA合成幾乎不能進行。
PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間，可根據待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min是足夠 的。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些。
循環次數 循環次數決定PCR擴增程度。PCR循環次數主要取決於模板DNA的濃度。一般的循環次數選在30～40次之間，循環次數越多，非特異性產物的量亦隨之增多。
PCR反應特點
特異性強 PCR反應的特異性決定因素為：
①引物與模板DNA特異正確的結合；
②鹼基配對原則；
③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；
④靶基因的特異性與保守性。
其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。
靈敏度高 PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12g)量級的起始待測模板擴增到微克(ug=10-6g)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。
簡便、快速 PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
對標本的純度要求低 不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及總RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等粗製的DNA擴增檢測。 PCR擴增產物分析
PCR產物是否為特異性擴增 ，其結果是否准確可靠，必須對其進行嚴格的分析與鑒定，才能得出正確的結論。PCR產物的分析，可依據研究對象和目的不同而採用不同的分析方法。
凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB溴乙錠染色紫外儀下觀察，初步判斷產物的特異性。PCR產物片段的大小應與預計的一致，特別是多重PCR，應用多對引物，其產物片斷都應符合預訐的大小，這是起碼條件。
瓊脂糖凝膠電泳： 通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。
聚丙烯醯胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯醯胺凝膠電泳分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，可用於科研及檢測分析。
酶切分析：根據PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離後，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。
分子雜交：分子雜交是檢測PCR產物特異性的有力證據，也是檢測PCR 產物鹼基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈(內部寡核苷酸)標記後做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用於科研。
斑點雜交： 將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用於PCR產物特異性鑒定及變異分析。
㈣ pcr核酸檢測是什麼意思方法及步驟
核酸檢測是目前全球用來對是否攜帶新冠病毒進行確定的一種有效方式。目前大家主要使用的是鼻拭子、咽拭子以及抗體血清lgm進行參考。但是根據最新的新加坡入境要求是進行pcr核酸檢測，那麼pcr核酸檢測是什麼意思呢？
PCR的意思是聚合酶鏈式反應，能夠用來擴增DNA，從而將微量的DNA擴增到能夠檢測的程度。有些病毒的核酸是DNA，需要採用這個方法進行檢測。所以PCR並不是進行的檢查，而是檢測DNA的一種方法。比如乙肝病毒DNA定量，用的就是這一種方法。檢查DNA的目的，一方面是可以診斷疾病，如果連病原體的DNA都能檢測到，就說明感染了這種病原體;另一方面是判斷病毒復制的多少，從而判斷病情嚴重程度或者治療效果。
進行核酸檢驗，需要經過取樣、留樣、留存、核酸提取、上機檢測五個步驟。
核酸檢測的第一步就是採集人體分泌物，用鼻試子或咽試子擦拭鼻腔或咽後壁及雙側咽扁桃體處。
第二步醫務人員進行留樣，將試子頭浸入細胞保存液中，折斷尾部後立即旋緊管蓋。
第三部要將樣本放入密閉袋中，保存好並及時送檢。
第四步將樣本送進實驗室，提取核酸。
第五步，將提取物進行熒光PCR擴增反應。
核酸(nucleicacid)，是一類由核苷酸(nucleotide)構成的生物大分子，分為核糖核酸(ribonucleic
acid，宴前者RNA)和脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic
acid，DNA)兩類，其中RNA多為單鏈結構，DNA多為雙鏈結構。除朊病毒(prion)外，核酸是構成生命所必需的生物大分子，其主要作用是構成生命體的遺傳信息載體，除此之外，還有部分核酸可作為及參與構成具有生物活性的酶分子或晌薯其他分子機器
。
核酸檢測顧名思義就是針對核酸開展檢測。
核酸檢測有何獨特的優勢呢?為何能作為新冠病毒確診的「金標准」呢?
其實每一種檢測方法都有其擅長的應用場景。以病毒檢測為例，通常的免疫學檢測方法(膠體金、ELISA、化學發光等)的檢測對象是病毒的抗原或抗體，相當於「側面描繪」。由於從感染到可檢測存在一個時間窗口期，因此免疫學檢測方法一般不合適作為早期診斷。
1、假陽性
假陽性通常比較少。一般實驗室人員操作不當會導致樣本間交叉污染或擴增產物的遺留污染，該種情況下可能會導致假陽性。
不過假陽性可以通過嚴格控制檢測流程、以及執行若干個陰性樣本隨機參與檢測的策略而有效規避。
2、假陰性
在這里需要說明的是，PCR檢測的假陰性與臨床的假陰性實際上不是一個概念。
以網路上激烈討論的新冠病毒的診斷為例，臨床假陰性是指臨床症狀和影像學高度疑似被感染、但PCR檢測卻多次或始終為陰性的情況;而PCR檢測假陰性是指所採集樣本中存在足夠量的新型冠狀病毒但卻沒有檢出悔簡的情況。
避免核酸檢測的假陰性，主要需要解決：(1)被感染者的細胞中有足量的病毒、(2)採集樣本中可以採集到含有病毒的細胞、以及(3)檢測出樣本中的病毒這三個環節。
其中PCR試劑盒的技術參數優劣主要影響第三個檢測環節。
僅針對第三個檢測環節，若樣本中病毒數量低於一個程度(低於最低檢測限)，PCR試劑盒就無法檢出。從這個角度看，PCR檢測的假陰性是無法完全避免的。這也是為何需要補充開發病毒的特異抗體檢測的原因所在。
實驗室建設堅持高標准、嚴要求，嚴格按照國家《醫學生物安全二級實驗室建築技術標准》進行建設，建設面積100餘平方米，分為試劑貯存和准備區、標本制備與提取區、擴增和產物分析區三個區域。實驗室內配置全自動核酸提取儀、實時熒光定量PCR儀、擴增儀、高壓滅菌器、B2型生物安全櫃、超凈工作台、超低溫冰箱等儀器，消毒和防護設施齊全，符合相關生物實驗室安全標准。為防止實驗室外的區域被污染，實驗室的氣壓均為負壓，有效降低感染風險。此外，實驗室配備了污水處理系統，達到了廢液的合理排放和處理。
*目前我國多地區建設了PCR核酸檢測實驗室用以進行新冠病毒核酸檢測