方法驗證有很多了,論述如下,來源CDE黃曉龍部長的文章
在進行質量研究的過程中,一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制.為規范對各種分析方法的驗證要求,我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則.該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述.但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求.另一方面,大多數葯品研發單位在進行質量研究時,已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性,大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證,但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准,而難以判斷該分析方法是否符合要求.本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求,提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准,供國內的葯品研發單位在進行研究時參考.
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映.驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份,分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率.
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間,9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%.
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示.具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液,分別測定其主峰的面積,計算相應的含量.以含量為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）,進行線性回歸分析.
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998,Y軸截距應在100％響應值的2％以內,響應因子的相對標准差應不大於2.0%.
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液,由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試,所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%.
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液,分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試,所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%.
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾,主成分與各有關物質應能完全分離,分離度不得小於2.0.以二極體陣列檢測器進行純度分析時,主峰的純度因子應大於980.
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3.
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10.另外,配製6份最低定量限濃度的溶液,所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%.
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時,儀器色譜行為的變化,每個條件下各測試兩次.可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%.
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析,主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%,主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離,主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定.
Ⅱ 求 ，水中污染物 實驗室驗證方法！！
我是污水廠化驗室的一名化驗員 以下幾項是水質監測的最基本實驗，希望對你有幫助啊！COD
1.1方法原理
在強酸性溶液中，用一定量的重鉻酸鉀氧化水樣中還原性物質，過量的重鉻酸鉀以試亞鐵靈作指示劑，用硫酸亞鐵氨溶液回滴。根據硫酸亞鐵銨的用量算出水樣中還原性物質消耗氧的量。
1.2 適用范圍
適用於地表水、地下水、飲用水、近岸海域海水、生活污水和工業廢水的監測。用0.2500mol／L濃度的重鉻酸鉀溶液可測定大於50mg/L的COD值，定上限是700mg／L，用0.0250mol／L濃度的重鉻酸鉀溶液可測定5~50mg/L的COD值。
2儀器試劑
2.1迴流裝置：帶250ml錐形瓶的全玻璃迴流裝置。
2.2加熱裝置：變阻電爐。
2.3 50ml酸式滴定管。
2.4重鉻酸鉀標准溶液(1／6K2CrO7=0.2500mol／L)：稱取預先在 120℃烘乾2h的基準或優級純重鉻酸鉀12.258g溶於水中，移 入1000ml
容量瓶，稀釋至標線，搖勻。
2.5試亞鐵靈指示液：稱取1.458g鄰菲啰啉(C12H8N2•H2O,1,10—phenanthroline)，0.695g硫酸亞鐵(FeSO4•7H2O)溶於水中，稀釋至100ml，貯於棕色瓶內。
2.7硫酸亞鐵銨標准溶液[(NH4)2Fe(SO4)2•6H2O≈0.1mol/L]：稱取39.5g硫酸亞鐵銨溶液於水中，邊攪拌邊緩慢加入20ml濃硫酸，冷卻後移入1000ml容量瓶中，加水稀釋至標線，搖勻。臨用前，劇重鉻酸鉀標准溶液標定。
標定方法：准確吸取10.00ml重鉻酸鉀標准溶液於500ml錐形瓶中，加水稀釋至110ml左右，緩慢加入30ml濃硫酸，混勻。冷卻後，加入3滴試亞鐵靈指示液(約0，15mi)，用硫酸亞鐵銨溶液滴定，溶液的顏色由黃色經藍綠色至紅褐色即為終點。
C[(NH4)2Fe(SO4)2]=0。2500*10.00/V
式中：C---硫酸亞鐵銨標准溶液的濃度(mol／L)；
F---硫酸亞鐵銨標准滴定溶液的用量(ml)。
2.8硫酸—硫酸銀溶液：於2500ml濃硫酸中加入25g硫酸銀。放置1~2d，不時搖動使其溶解。
2.9硫酸汞：結晶或粉末。
3 操作步驟
3.1取20.00ml混合均勻的水樣(或適量水樣稀釋至20.00ml)置250ml磨口的迴流錐形瓶中，准確加入10.00ml重鉻酸鉀標准溶液及數粒洗凈的玻璃珠或沸石，連接磨口迴流冷凝管，從冷凝管上口慢慢地加入
30ml硫酸—硫酸銀溶液，輕輕搖動錐形瓶使溶液混勻，加熱迴流2h(自開始沸騰時計時)。
註：①對於化學需氧量高的廢水樣，可先取上述操作所需1/10的廢水樣和試劑，於15mmXl50mm硬質玻璃試管中，搖勻，加熱後觀察是否變成綠色。如溶液顯綠色，再適當減少廢水取樣量，直到溶液不變綠色為止：，從而確定廢水樣分析時應取用的體積。稀釋時，所取廢水樣量不得少於5ml，如果化學需氧量很高，則廢水樣應多次逐級稀釋。
②廢水中氯離子含量超過30mg／L時，應先把0.4g硫酸汞加入迴流錐形瓶中，再加20.00ml廢水(或適量廢水稀釋至20.00ml)、搖勻。以下操作同上。
3.2冷卻後，用90ml水從上部慢慢沖洗冷凝管壁，取下錐形瓶。溶液總體積不得少於 140ml，否則因酸度太大，滴定終點不明顯。
3.3溶液再度冷卻後，加3滴試亞鐵靈指示液，剛硫酸亞鐵銨標准溶液滴定，溶液的顏色由黃色經藍綠色至紅褐色即為終點，記錄硫酸亞鐵銨標准溶液的用量。
3.4測定水樣的同時，以20.00ml重蒸餾水，按同樣操作步驟作空白試驗。記錄滴定空白時硫酸亞鐵銨標准溶液的用量。
4 計算
CODcr(O2,mg/L)=(V0-V1)*C*8*1000/V
式中：C—硫酸亞鐵銨標准溶液的濃度(mol／L);
V0—滴定空白時硫酸亞鐵銨標准溶液用量( ml);
V1—滴定水樣時硫酸亞鐵銨標准溶液的用量 (ml);
V—水樣的體積(m1);
8--氧(1／2O)摩爾質量(g／mol)。
5 儀器維護
5.1操作人員應嚴格按照本規程及操作說明書操作，使用後應做好使用登記並搞好儀器周邊衛生。
5.2儀器長期沒使用時，保管人要定期開機運行一次，檢查儀器運轉是否正常，每年定期由計量局派專業人員負責校準，並作好記錄。
總磷
1概述
1．1方法原理
在酸性條件下，正磷酸鹽與鉬酸鹽、酒石酸銻氧鉀反應，生成磷鉬雜多酸，被還原劑抗壞血酸還原，則變成藍色絡合物，通常即稱磷鉬藍。
1．2干擾及消除
砷含量大於2mg/L有干擾，可用硫代硫酸鈉除去。硫化物量大於2mg/L有干擾，在酸性條件下通氮氣可以除去。六價鉻大於50mg/L有干擾，用亞硫酸鈉除去。亞硝酸鹽大於1mg/L有干擾，用氧化消解或加氨磺酸均可以除去。鐵濃度為20mg/L，使結果偏低5%；銅濃度達10mg/L不幹擾；氟化物小於70mg/L也不幹擾。水中大多數常見離子對顯色的影響可以忽略。
1．3方法的適用范圍
本方法最底檢出濃度為0.01mg/L(吸光度A=0.01時所對應的濃度)；測定上限為0.6mg/L。
可適用於測定地表水、生活污水及化工、磷肥、機加工金屬表面磷化處理、農葯、鋼鐵、焦化等行業的工業廢水中的正磷酸鹽分析。
2儀器及試劑
2．1儀器
分光光度計。
2．2試劑
①（1+1）硫酸；
②10%抗壞血酸溶液：溶解10g抗壞血酸於水中，並稀釋至100ml。該溶液貯存在棕色玻璃瓶中，在約4℃可穩定幾周。如顏色變黃，則棄去重配。
③鉬酸鹽溶液：溶解13g鉬酸銨[（NH4）6Mo7O24•4H2O]於100ml水中。溶解0.35 g酒石酸銻氧鉀[K(SbO)C4H4O6•1/2H2O] 於100ml水中。
在不斷攪拌下，將鉬酸銨溶液徐徐加到300ml（1+1）硫酸中，加酒石酸銻氧鉀溶液並且混合均勻。貯存在棕色的玻璃瓶中於約4℃保存。至少穩定兩個月。
④濁度―色度補償液：混合兩份體積的（1+1）硫酸和一份體積的10%抗壞血酸溶液。此溶液當天配製。
⑤磷酸鹽貯備溶液：將優級純磷酸二氫鉀（KH2PO4）於110℃乾燥2h，在乾燥器中放冷。稱取0.2197g溶於水，移入1000ml溶量瓶中。加（1+1）硫酸5ml，用水稀釋至標線。此溶液每毫升含50.0μg磷（以P計）。
⑥磷酸鹽標准溶液：吸取10.00 ml磷酸鹽貯備液於250ml溶量瓶中，用水稀釋至標線。此溶液每毫升含2.00μg磷。臨用時現制。
3步驟
（1） 校準曲線的繪制
取數支50ml具塞比色管，分別加入磷酸鹽標准使用液：0、0.50、1.00、3.00、5.00、10.0、15.0 ml，加水至50ml。
①顯色：向比色管中加入1ml 10%抗壞血酸溶液，混勻。30s後加2ml鉬酸鹽溶液充分混勻，放置15min。
②測量：用10mm或30 mm比色皿，於700nm波長處，以零濃度溶液為參比，測量吸光度。
（2） 樣品測定
分取適量經濾膜過濾或消解的水樣（使含磷量不超過30μg）加入50ml比色管中，用水稀釋至標線。以下按繪制標准曲線的步驟進行顯色和測量。減去空白試驗的吸光度，並從標准曲線上查出含磷量。
4計算
m
磷酸鹽（P，mg/L）= ———
V
式中：m——由校準曲線查得的磷量（μg）；
V——水樣體積（ml）。
氨氮
1概述
水樣的預處理
水樣帶色或渾濁以及含其他一些干擾物質，影響氨氮的測定。為此，在分析時需作適當的預處理。對較清潔的水，可採用絮凝沉澱法；對污染嚴重的水或工業廢水，則用蒸餾法消除干擾。
絮凝沉澱法
1.1方法原理
加適量的硫酸鋅於水樣中，並加氫氧化鈉使呈鹼性，生成氫氧化鋅沉澱，再經過濾除去顏色和渾濁。
2儀器試劑
2.1 10%硫酸鋅溶液：稱取10g硫酸鋅溶於水，稀釋至100ml。
2.2 25%氫氧化鈉溶液：稱取25g氫氧化鈉溶於水，稀釋至100ml，貯於聚乙烯瓶中。
2.3 硫酸，ρ=1.84。
3 操作步驟
取100ml水樣於具塞量筒或比色管中，加入1ml10%硫酸鋅溶液和0.1~0.2ml25%氫氧化鈉溶液,調節PH至10.5左右，混勻。放置使沉澱，用經無氨水充分洗滌過的中速濾紙過濾，棄去初濾液20ml。
蒸餾法
1概述
1.1方法原理
調節水樣的PH使在6.0~7.4的范圍,加入適量氧化鎂使呈微鹼性,蒸餾釋放出的氨被吸收於硫酸或硼酸溶液中.採用納氏比色法或酸滴定法時,以硼酸溶液為吸收液;採用水楊酸-次氯酸鹽比色法時,則以硫酸溶液為吸收液.
2儀器試劑
2.1 帶氮球的定氮蒸餾裝置:500ml凱氏燒瓶、氮球、直形冷凝管和導管。
2.2 水樣稀釋及試劑配製均用無氮水。無氮水制備：
2.2.1 蒸餾法：每升蒸餾水中加0.1ml硫酸，在錢玻璃蒸餾器中重蒸餾，棄去50ml初餾液，接取其餘餾出液於具塞磨口的玻璃瓶中，密封保存。
2.2.2 離子交換法：使蒸餾水通過強酸性陽離子交換樹脂柱。
2.3 1mol/L鹽酸溶液。
2.4 1mol/氫氧化鈉溶液。
2.5 輕質氧化鎂（MgO）：將氧化鎂在500℃下加熱，以除去碳酸鹽。
2.6 0.05%溴百里酚藍指示液（PH6.0~7.6）
2.7防沫劑，如石臘碎片。
2.8吸收液：
2.8.1 硼酸溶液：稱取20g硼酸溶於水，稀釋至1L。
2.8.2硫酸（H2O4）IPIY：0.01mol/L
3 操作步驟
3.1 蒸餾裝置的預處理：加250ml水樣於凱氏燒瓶中，加0.25g輕質氧化鎂和數粒玻璃珠，熱蒸餾至餾出液不含氮為止，棄去瓶內殘液。
3.2 分取250ml水樣（如氨氮含量較高，可分取適量並加水至250ml，使氨氮含量不超過2.5mg），移入凱氏燒瓶中，加數滴溴里酚藍指示液，用氫氧化鈉溶液或鹽酸溶液調節至PH7左右。加入0.25g輕質氧化鎂和數粒玻璃珠，立即連接氮球和冷凝管，導管下端插入吸收液液面下。加熱蒸餾，至餾出液達200ml時，停止蒸餾，定容至250ml。
3.3 採用酸滴定法和納氏比色法時，以50ml硼酸溶液為吸收液；採用水楊酸-次氯酸鹽比色法時，改用50ml0.01mol/L硫酸溶液為吸收液。
納氏試劑光度法
1概述
1.1 方法原理
碘化汞和碘化鉀的鹼性溶液與氨反應生成淡紅棕色膠態化合物，此顏色在較寬波長內具強吸收。通常測量用波長在410~425nm范圍。
1.2 適用范圍
本方法最低檢出濃度為0.025mg/L(光度法)，測定上限為2mg/L。採用目視比色法，最低檢出濃度為0.02mg/L。水樣作適當的預處理後，本法可適用於地表不、地下水、工業廢水和生活污水中的氨氮的測定。
2儀器試劑
2.1 分光光度計。
2.2 PH計。
2.3 配製試劑用均應為無氨水。
納氏試劑：
2.3.1 稱取20g碘化鉀溶於約10ml水中,邊攪拌邊分次少量加入二氯化汞(HgCl2)結晶粉末(約10g),至出現朱紅色沉澱不易溶解時,停止滴加氯化汞溶液.，並充分攪拌，當出現微量朱紅色沉澱不溶解時，停止滴加氯化汞溶液。另稱得上20克氫氧化鉀溶於水，並稀釋至
ml，充分冷卻至室溫後，將上述溶液在攪拌下，徐徐注入氫氧化鉀溶液中，用水稀釋至400ml，混勻。靜置過夜。將上清液移入聚乙烯瓶中，密塞保存。
2.4 酒石酸鉀鈉溶液：稱取50g酒石酸鉀鈉溶於100 ml水中，加熱煮沸以除去氨，放冷，定容至100ml。
2.5 銨標准貯備液：稱取3.819g經100℃乾燥過的優級純氯化銨溶於水，移入1000ml容量瓶中，稀釋至標線。此溶液每毫升含1.00mg氨氮。
2.6 銨標准使用溶液：移取5.00ml銨標准貯備液於500ml容量瓶中，用水稀釋至標線。此溶液每毫升含0.010mg氨氮。
3、操作步驟
3.1 標准曲線的繪制
3.1.1 吸取0、0.50、1.00、3.00、5.00、7.00和10.0ml銨標准使用液於50ml比色管，加水至標線，加1.0ml酒石酸鉀鈉溶液，混勻。加1.5ml納氏試劑，混勻。放置10min後，在波長420nm處，用光程20mm比色皿，以水為參比，測量吸光度。
3.1.2 由測得的吸光度，減去零濃度空白的吸光度後，得到校正吸光度，繪制以氨氮含量（mg）對校正吸光度的校準曲線。
3.2 水樣的測定
3.2.1 分取適量經絮凝沉澱預處理後的水樣（使氨氮含量不超過0.1mg），加入50ml比色管中，稀釋至標線，加1.0ml酒石酸鉀鈉溶液。以下同校準曲線的繪制。
3.2.2 分取適量經蒸餾預處理後的餾出液，加入50 ml比色管中， 加一定量1mol/L氫氧化鈉溶液以中和硼酸，稀釋至標線。加1.5ml納氏試劑，混勻。放置10min後，同校準曲線的步驟測量吸光度。
3.3 空白試驗
以無氨水代替水樣，做全程序空白測定。
4 計算
由水樣測得的吸光度減去空白試驗的吸光度後，從校準曲線上查得氨氮含量（mg）。
氨氮（N，mg/L）=m/V×1000
式中：m——從校準曲線上查得氨氮含量（mg）；
V——水樣體積（ml）。
Ⅲ 如何對一種分析方法做驗證試驗
1. 緒論
本指南旨在為申請者提供建議，以幫助其提交分析方法，方法驗證資料和樣品用於支持原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力方面的文件。
本指南旨在幫助申請者收集資料，遞交樣品並資料以支持分析方法。這些建議適用於NDA，ANDA，BLA，PLA及其它們的補充中所涉及的原料葯和制劑。
這些原則同樣適用於二類DMF所涉及的原料葯和制劑。如果使用了其它方法，鼓勵申請者事先和FDA葯品評審中心的官員進行討論，以免出現這種情況，那就是花了人力物力所准備起來的遞交資料後來發現是不可用的。
本指南中所述的分析方法驗證的原則適用於各種類型的分析方法。但是，本指南中特定的建議可能不適用於有些產品所用的特殊分析方法，如生物葯，生物技術葯，植物葯或放射性葯物等。
比如說，許多生物分析是建立在動物挑戰模式，免疫原性評估或其它有著獨特特性的免疫分析基礎上的，在遞交分析方法和分析方法驗證資料時需考慮這些獨特的性質。
而且，許多原料葯和制劑的界定和質量控制所需的生物和免疫化學檢測並不在本指南的范圍之內。
盡管本指南並不專門敘述原料，中間體，賦形劑，包裝材料及原料葯和制劑生產中所用的其它物料的分析方法及分析方法驗證資料的遞交，但是應該應用驗證過的分析方法來分析檢測這些物質。
對於本指南中未提及的關於分析方法驗證和資料提交方面的問題，請向FDA相關的化學評審人員咨詢。
本指南，一旦定稿，將取代FDA於1987年2月份發布的工業指南：分析方法驗證所需提交的樣品和分析資料。
II. 背景
每個NDA和ANDA都必需包括必要的分析方法以確保原料葯和制劑的認定，劑量，質量，純度和效力，還包括制劑的生物利用度(21 CFR 314.50(d)(1) 和314.94(a)(9)(i))。
FDA驗證文件現場備查，可以不與DMF一起交。
必須要有資料來論證所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性標準的。
分析方法驗證是論證某一分析方法適用於其用途的過程。分析方法的驗證過程是從申請者有計劃地系統性收集驗證資料以支持分析方法開始的。
審評化學家會對NDA或ANDA中的分析方法和驗證資料進行評審。
一旦FDA有要求，則NDA或ANDA的申請者必須提交制劑，原料葯，非葯典對照品和空白以使FDA實驗室能對申請者所用分析方法進行評審(21 CFR 314.50(e) and 314.94(a)(10))。
FDA實驗室的分析會論證該分析方法在實驗室內是可以重現的。審評化學家和實驗室分析家會從法規的角度確定該分析方法的適用性。
FDA檢查官會對分析實驗室進行檢查確保用於放行和穩定性實驗的分析方法符合現行的GMP（21CFR part 211)和GLP (21 CFR part 58)。
每個BLA和PLA都必須要有詳細的生產工藝描述，包括分析方法，以說明所生產的產品是符合規定睥安全，純充和效力標準的(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(iv))。
必須要有資料證明所用的分析方法是符合一定的准確度和可靠性要求的(21 CFR 81211.194(a)(2))。對於BLA，PLA及它們的補充，在所提交的許可證申請中應當要有分析方法和方法驗證這部分的資料，審評委員會會對這部分資料進行評審。
需提供代表性樣品及該樣品所代表批號的檢測結果總結(21 CFR 601.2(a) and 601.2(c)(1)(vi))。評審委員會主席會要求CBER實驗室的分析人員進行分析實驗對申請者的分析方法進行評估，並確認其分析結果。
從驗證的角度來看，所有的分析方法有著同樣的重要性。一般來說，應當要應用已驗證過的分析方法，而不論其是被用於過程式控制制，放行，合格或穩定性實驗。高等每個定量分析方法時都應當要減少其分析誤差。
分析方法和驗證資料應當擺在申請的分析方法和控制章節中提交。本指南的第III到IX章和XI章給出了所需提供資料方面的建議。向FDA實驗室提供樣品和遞交NDA和ANDA中的分析方法驗證資料的信息見第X章。
III分析方法的類型
A. 法定分析方法
法定分析方法是被用來評估原料葯或制劑的特定性質的。USP/NF中的分析方法是法定的用於葯典項目檢測的分析方法。為了確認符合法規，需使用法定分析方法。
B. 替代分析方法
替代分析方法是申請者提出用於代替法定分析方法的分析方法。只有當一替代分析方法相當於或優於法定分析方法時，才可以應用驗證過的替代分析方法。
I如果提交了替代分析方法，申請者還應當提供其理由，並標明其用途（如，放行，穩定性實驗），驗證資料及其與法定分析方法的對比資料。
C. 穩定性指示分析
穩定性指示分析是能檢測出原料葯或制劑的某些性質隨著時間的延長而出現的變化的定量分析方法。
穩定性指示分析能不受降解產物，工藝雜質，賦形劑或其它潛在雜質的影響而准確測定其中的活性成分。
如果申請者遞交了用於放行檢測的非穩定性指示分析方法，則應當要有能定性和定量地監測雜質，包括降解產物，的分析方法對其進行補充。穩定性試驗中所用的含量分析方法應當要有穩定性指示能力，除非有科學的理由能證明其合理性。
IV 標准品
A．標准品的類型
可以從USP/NF處或其它官方(比如說，CBER，21CFR 610.20)獲得標准品 (也就是一級對照品)。如果不能確定一標准品的來源是否會被FDA認為是官方來源，申請者應當要向適當的化學評審人員咨詢。如果沒有官方來源，則被用來作標准品的物質應當要有盡可能高的純度，並得到充分界定。
工作對照品 (也就是內部標准品或二級標准品)是根據一級對照品標定的，並用來代替一級對照品的。
B．分析報告單
對於非官方標准品，在申請的分析方法和控制章節中應當要提供該標准品的分析報告單。對於從官方獲得的標准品，用戶應當要確保標准品的適用性。應當正確儲存標准品並在已確定的時間段內使用該標准品。
C．標准品的界定
從USP/NF及其它官方來源獲得的標准品是不需要進一步界定的。非官方對照品要有盡可能高的純度，並進行充分地界定以確保其結構，劑量，質量，純度和效力。
T用於界定標准品的定性和定量分析方法應當要不同於用於控制原料葯或制劑的結構，劑量，質量，純度和效力的分析方法，要比它們更深入。用於標准品界定的分析方法不應僅僅是和先前的指定標准品進行比較實驗。
一般來說，界定資料應當要包括：
標准品的簡單工藝描述，如果其生產工藝是否於其相應的原料葯的話。應當要敘述制備標准品時所用的補充精製過程。
相關光譜圖，色譜圖，TLC照片及其它儀器輸出的清晰復印件。建立純度的資料。應當要應用適當的檢測方法來獲得這些資料，比如說TLC，GC，HPLC，相溶解分析，適當的熱分析方法及其它必要的分析方法。
適當的化學性質資料，比如結構式，經驗式和分子量等。結構確證資料應當要包括適當的分析測試，比如元素分析，IR，UV,NMR和MS，及適用的官能團分析。還應當要提供具體的結構解析資料。
物理性質的描述，包括顏色和物理形態。 適當的物理常數，比如說熔程，沸程，折射率，離解常數(pK值)和旋光度。用於界定標准品的分析程序的詳細敘述。
至於生物技術/生物產品的標准品，應當要考慮上述建議，可能可以應用。然而，其它確定物理化學性質，結構特性，生物活性和/或免疫化學活性的補充檢測和/或其它檢測將是非常重要的。
物理化學性質包括異構體，電泳和液相色譜行為及光譜性質等。結構界定可能包括氨基酸序列，氨基酸組成，縮氨酸圖和碳水結構。確定生物和/或免疫化學活性的分析方法應當要和用來確定產品效力的分析方法一樣。
Th這些分析方法可以包括基於動物的，細胞培養的，生物化學的或配位體/接受體螯合的分析方法。如果這些檢測需用於某些標准品的界定，生物和免疫化學檢測的分析方法驗證方面的特殊建議並不在本指南的范圍之內。
V．IND中的分析方法驗證
對於IND而言，每個階段的研究都需要有足夠的資料以確保合適的認定，質量，純度，劑量和/或效力。所需的分析方法和方法驗證方面的資料會隨著研究的階段變化而變化(21CFR312.23(a)(7))。
N關於在第1階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的內容和格式（1995年11月）。
第2和第3階段研究所需提交的分析方法和方法驗證資料方面的指南，發起人將可以參考FDA的指南：葯品（包括結構確定的，有療效的，生物技術產品）第1階段研究的IND申請的CMC內容和格式（草案，1999年4月）。
在遞交NDA，ANDA，BLA或PLA時，所有的分析方法都應當要開發出來，並得到驗證。
VI．NDA，ANDA，BLA和PLA中分析方法的內容和格式
NDA，ANDA，BLA和PLA中所提交的任一分析方法都應當要有詳細的描述，以使合格的分析人員能重現出所需的實驗條件並獲得和申請者相當的實驗結果。應當要敘述分析方法中需要特殊注意的地方。
如果所用的分析方法是USP/NF或其它FDA認可參考文獻（如，<>）中且所參考的分析方法未經過修改的話，則需提供該分析方法的參引，而不用提供該分析方法的描述（21 CFR 211.194）。
對於從其它公開發表的文獻上獲得的分析方法，應當要對其進行敘述，因為評審官可能並不能很方便的獲得這些文獻。
分析方法描述中需要包括的典型內容如下所示：
A．基本方法
HPLC進行分離的，檢測器為UV檢測器。
B．取樣
需要敘述的有：所選樣品的數目（比如，瓶，片等），它們是如何使用的（也就是，單獨的或是混合樣品），每個樣品分析的重復次數。
C．儀器和儀器參數
需要敘述的有：儀器列表（比如，儀器類型，檢測器，柱子類型，尺寸等）和儀器參數（比如，流速，溫度，運行時間和設定波長等）。如果必要的話，還要提供實驗結構示意圖（比如，闡述噴灑式分析方法的位置）。
D．試劑
需要敘述的有：試劑列表及其相應的規格（比如：USP/NF，美國化學社（ACS）分析試劑）。如果使用的是自製試劑或更改過的商業試劑，則應當要有其制備方法。對於不穩定的或有潛在危險的試劑，應標明其儲存條件，安全使用說明和使用周期。
E．系統適應性實驗
系統適應性實驗參數和合格標準是建立基礎是：儀器，電子元件，分析操作和待測樣品是個不可分割的整體。系統適應性實驗確保系統在樣品分析的時候能很好地運行。在分析方法中應當要包括適當的系統適應性合格標准。
所有的色譜分析方法都應當要有系統適應性實驗及相應的合格標准。CDER評審官指南<<色譜分析方法的驗證>>（1994年11月）對用於評估系統適應性的典型參數進行了定義和討論。
建議系統適應性實驗應成為所有分析方法的一部分，而不僅僅是色譜分析方法。無論是哪類分析方法，都要採用實驗來證實該系統能不受環境條件的影響而正確地運行。比如說，滴定法一般來說需要進行空白實驗。
F．標准品的制備
要有所有標准品溶液（比如，儲備液，工作對照品溶液，內部對照品溶液）的配製方法。
G.操作過程
應當要按操作步驟對操作過程進行逐步敘述。敘述應當要適當包括如下信息：平衡時間，樣品進樣順序和系統適應性或啟動參數。需標明不常見的危險。
Ⅳ 氣相色譜的方法驗證怎麼做
轉載《分析測試網路網》
色譜方法通常用於原料、葯物、葯物制劑和生物體液中化合物的定性和定量。涉及的成分包括手性的或非手性的葯物、過程雜質、殘留溶媒、附加劑如防腐劑、分解產物、從容器和密閉包裝或製造過程中帶入的可提取和可過濾的雜質、植物葯中的農葯和代謝物等。
試驗方法的目的是得到可信賴的和准確的數據，無論是用於驗收、出廠、穩定性或葯物動力學研究。得到的數據用於葯品開發或批准後的定性和定量，試驗包括原料的驗收、葯物和葯物制劑的出廠、過程檢驗(In- process testing)的質量保證和失效期的建立。
方法的驗證是由葯品的開發者或使用者來檢驗其方法是否達到預期的可靠性、准確度和精密度的過程。得到的數據成為方法的驗證資料的一部分交給CDER.。
方法的驗證對於完成機構滿足檔案要求不是一次性的，開發者和使用者都應驗證其方法的耐用度或耐久性(ruggedness or robustness.)，其他的分析者、用其它相當的儀器，在其它的日期或地點，在葯品生產期限(有效期)全過程，方法都應能夠重現。如果產生數據的方法是可靠的，那麼所得到的驗收、出廠、穩定性或葯物動力學的數據就是可信賴的。驗證的過程和方法的設計應在開發過程中重要的數據產生之前，如果方法改變了，還應該再驗證。
. 色譜類型
色譜是一種技術，通過該技術，樣品中的組分載入液相或氣相中，通過在固定相上由吸附—解吸附來完成。
A. 高效液相色譜 (HPLC)
HPLC分離是基於在樣品在流動相液體和固定相之間的不同分配。一般地說HPLC大體分為以下幾種(未考慮其重要性順序)
1. 手性液相色譜
2. 離子交換色譜
3. 離子對/親和色譜
4. 正相色譜
5. 反相色譜
6. 分子排阻色譜
1. 手性液相色譜
分離光學異構體可在手性固定相上，用衍生化試劑或在非手性固定相上用流動相添加劑形成非對對映體來實現。用作雜質試驗方法時，如果光學異構體雜質在光學異構體葯物之前洗脫，要增加靈敏度。
2. 離子交換色譜
分離基於荷電功能團，樣品負離子(X - )為陰離子，樣品正離子((X + )為陽離子，一般用pH程序洗脫。
3. 離子對/親和色譜
分離基於與目標樣品的專一的化學相互作用。更普遍的反相型用緩沖液和加入的對離子(與被分離的樣品荷相反電荷)分離。分離受pH、離子強度、溫度、濃度和共存的有機溶劑類型的影響。親和色譜，一般用於大分子，使用配合體(共價結合在固體基質上的生物活性分子)，與其同類的抗原(分析介質)反應，生成可逆轉的復合物，通過改變緩沖條件洗脫。
4. 正相色譜
正相色譜為用有機溶劑為流動相和極性的固定相。此時較小極性的組分比較大極性組分更快地洗脫。
5. 反相色譜
報給CDER的最通常的實驗方法是反相HPLC方法， 最通常用紫外檢測器。
反相色譜，一種鍵合相的色譜技術，用水作基本溶劑，選擇性也受溶劑強度、柱溫和pH的影響，一般來說較大極性比較小極性組分洗脫更快。
紫外檢測器可以用於所有色譜，這類檢測器要注意的是燈老化後的靈敏度降低，其靈敏度因(儀器)的設計和/或者製造廠家的不同有小的變異。需要指出，用紫外檢檢測器和反相HPLC組合得到的色譜圖不一定能真實的反映事實，原因是：
•極性比目標化合物大得多的化合物可能被掩蓋(在溶劑前沿或死體積時同時洗脫)。
•極性比目標化合物小得多的化合物洗脫出來晚，甚至保留在柱上。
•紫外吸收系數較低和最大吸收不同的化合物在檢測相對較低濃度的目標分析物時不能被檢出，因為通常只有一個檢測波長。
6. 排阻色譜
也叫凝膠滲漉(permeation)或濾過，分離基於化合物分子大小或水動力學(hydrodynamic)容積。比多孔柱填料孔徑大得多的分子最先洗脫，小分子進入孔隙洗脫晚，其餘的洗脫速率取決於其分子的相對大小。
B. 氣相色譜(GC)
氣相色譜基於揮發性樣品由作為流動相的載氣運載，通過色譜柱內的固定相時發生吸附和解吸附過程進行分離。
通常氣相色譜分析的樣品是低分子量化合物，這些化合物是易揮發的和高溫時穩定的。在這一方面，葯物和葯物制劑中的殘留溶劑適於氣相色譜分析。生成化學衍生物可達到易揮發和熱穩定的目的。
常用的檢測器是用於含碳化合物的火焰離子化檢測器(FID)，用於鹵代化合物的電子捕獲式檢測器(ECD)，用於含硫和含磷化合物的火焰光度檢測器 (FPD)，以及用於含氮或磷化合物的氮磷檢測器(NPD)。氣相色譜也能實現手性分離。填充柱迅速被毛細管取代來改進分離度和分析時間，在氣相色譜上分析物位置與HPLC一樣，用保留時間(Rt)表示。
C. 薄層色譜(TLC)
薄層色譜是一種最簡便普通的色譜技術，分離基於在一端浸於溶劑混合物(流動相)中的薄層板(固定相)上點的樣品移動進行分離，整個系統在密封的缸中進行。
對於本身沒有顏色的化合物，檢出技術包括熒光、紫外和噴霧顯色劑(通用的和專一的)。 分析物在薄層板上的位置用Rf值來表示，Rf值為化合物的移動距離與溶劑前沿的比值。
三種方法，氣相、液相和薄層中，薄層色譜是最普通的試驗方法，因為薄層板上所有的組分都可用適宜的檢測技術檢出。然而通常不如HPLC那麼准確和靈敏。雖然選用適宜的檢測技術，TLC法能見到分析的「全圖」(whole picture) ，但比HPLC分析變異較大。
. 參考標准品(對照品)
參考標准品為經充分鑒定的高純度化合物，色譜方法更大程度上依賴參考標准品來提供准確的數據。因而參考標准品的質量和純度是很重要的，有二類參考標准品，化學的和放射性的。後者應考慮放射標記純度和化學純度。
按照提交方法驗證的樣品和分析數據，指南中的二類化學參考標准品如下：
• USP / NF參考標准品，不需要鑒定。
• 非總目錄標准品，應用合理方法制備，並經充分鑒定，以保證其鑒別、含量、質量和純度達到最高。
應該指出
• 大多數USP / NF參考標准品未標示化合物純度。
• 對非USP參考標准品，提出純度的校正數應包括在試驗方法的計算中。
• 提供的參考標准品中沒有以下雜質，諸如合成過程的結構相似的雜質和其它的過程雜質，如重金屬、殘留溶劑、水分(結合的和非結合的)、植物來源制劑中的農葯和分解產物等。
• 如果在方法中規定，用前參考標准品要乾燥除去殘留溶劑、非結合水分和有時是結合水(取決於乾燥條件)，對易潮解的化合物總是包括乾燥步驟的。但另一方面乾燥可能導致結晶水的損失或引起熱敏感化合物的降解。
色譜方法用外標法和內標法進行定量。
A. 外標法
當參考標准品與樣品在不同的色譜圖上進行分析時，用外標法。定量基於樣品的峰面積/高(HPLC或GC)或強度(TLC)與分析對象、參考標准品的比值。
更適合用外標法的樣品如下：
1.樣品具有單一的目標濃度和狹窄的濃度范圍 ，例如驗收和出廠檢驗。
2.簡便的樣品制備操作。
3. 增加走基線的時間，為檢測可能的額外峰，如雜質試驗。
B. 內標法
加入一種已知純度並且在分析中不產生干擾的化合物至樣品混合液中，定量基於被分析的化合物與內標的響應比值與參考標准品得到的比值進行比較。這一方法很少用於TLC。
更適合用內標法的樣品如下：
1.復雜的樣品制備過程，如多次提取。
2.低濃度的樣品(靈敏度是確定的)，如葯代動力學的研究。
3.在樣品分析中預計是很寬的濃度范圍，如葯物動力學研究。
雖然CDER不規定方法應該用內標或外標法用於定量，但一般的看法是用於驗收、穩定性和TLC用外標法，對生物體液和GC用內標法。
工作濃度為方法中規定的被分析對象的目標濃度。保持樣品濃度與標準的濃度相近可以改善方法的准確性。
建議
1.如果參考標准品的純度校正因子已知，那麼在計算中應該包括。
2.在方法中要規定標准品和樣品的工作濃度。
. 葯物和葯物制劑HPLC驗證的參數
雖然許多種HPLC都可採用，但最普遍上報的方法都是用紫外檢測器的反相HPLC法，以此作為驗證參數的例子。這一方法驗證的規定可以擴展到其它檢測器和其它色譜。對於驗收、出廠或穩定性試驗，准確性應最佳化，因為要表明實測值和真值的差異是最為關注的。
A. 准確性
准確性是衡量測量實驗值和真值的接近程度。推薦葯物和葯物制劑的准確性研究在標示量的80%、100%和120%的水平上來進行的，這與「The Guideline for Submitting Samples and Analytical Data for method Validation」的規定是一致的。
對於葯物制劑，准確性試驗通常是將已知量的葯物 [按重量或體積(溶於稀釋劑)] 以分析對象檢測濃度的線性范圍量加到空白處方內來完成的。對於液體制劑，這是真實的回收率；而對於諸如片劑、栓劑、透皮吸收制劑等，這不能檢測稀釋劑中的賦形劑與活性成分間可能產生的作用。實際上要做一個已知活性葯物量的單個劑量單位(single unit)來進行回收試驗是困難的。准確性試驗評價在賦形劑存在時，在分析葯物制劑的色譜條件下，試驗方法的專屬性。但這只是樣品制備過程和色譜過程中的回收率，而不是製造過程的影響。
在每個推薦檢測濃度重復進樣，其重復進樣的RSD提供了分析方法的變動性，或是試驗方法的精密程度。重復性的均值以標示量的%來表示
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