瘦肉精快速檢測的方法

1. 瘦肉精檢測問題

目前，檢測瘦肉精的方法主要有四種，即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質譜法（GC－MS）、毛細管區帶電泳法（CE）和免疫分析技術（IA）。而我國結合自己的實際情況，2001年農業部首先組織制定了飼料中鹽酸克倫特羅的測定標淮。該標准選擇確定了兩種：即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜一質譜法（GC－MS）。其中將HPLC法作為檢測瘦肉精的半確證性方法，其最低檢測限為 0．05μg/kg，優點是檢測精確度高，而且假陽性率低；缺點是檢測過程煩瑣、檢測時間長，需貴重儀器、難於操作、價格昂貴。而GC一MS法優點是能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析。GC－MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低，已將GC－MS法定為檢測瘦肉精的確證性方法。GC－MS法的缺點同HPLC相似。 (1)試劑和材料 以下所有試劑，除特別註明外，均為分析純試劑；水為符合GB／T6682規定的二級水。 ①鹽酸克倫特羅對照品：含鹽酸克倫特羅不得少於98．5％ ②鹽酸 ③無水甲醇 ④氫氧化鈉 ⑤磷酸二氫鉀 ⑥磷酸 ⑦鹽酸溶液 取鹽酸4．2ml，加水至1000ml，即得。 ⑧o．5mol／L磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀68g，加水800ml溶解並用磷酸調pH值至3．O，用水稀釋至1000ml，即得。 ⑨0．05mol幾磷酸二氫鉀溶液 取磷酸二氫鉀6．88，加水800ml溶解並用磷酸調pH值至3．0，用水稀釋至1000mi，即得。 a．氫氧化鈉溶液 取氫氧化鈉48，加水使溶解成100mi，即得。 b．鹽酸克倫特羅對照品儲備液(1mg／mi) 准確稱取28．3mg鹽酸克倫特羅對照晶至25ml量瓶中，用甲醇溶解並稀釋至25ml，一20~C以下保存，有效期1年。 ⑩鹽酸克倫特羅對照品工作液(10ttg／mi) 取lmg／mi儲備液o．5ml到50mi量瓶中，加水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。 ⑾鹽酸克倫特羅對照溶液(100ng／m1) 取1(ug／m1工作液o．5ml到：50mi量瓶中水至50mi，2～8~C保存，有效期1個月。 ⑿鹽酸克倫特羅檢測試劑盒(2～8~C冰箱中保存) ⒀固相萃取柱C，s：100mglml含碳量≥17％ (2)儀器和設備 ①酶聯免疫反應讀數儀 ②分析天平 精度0．00001g ③天平 精度0．01g ④冷凍離心機 ⑤50mi具塞離心管 ⑥勻漿機 ⑦微型振盪器 ⑧迴旋振盪器 ⑨微量移液器 單道20uL，50ul，100uL；多道50～250uL， ⑩乾熱濃縮器 ①空氣壓縮機 (3)測定步驟 ①試料的制備(尿) 取供試尿lml，於3000r／min離心l0min，上清液作為供試試料，直接供酶聯免疫測定法測定。 取空白尿lml，於3000r／min離心l0min，上清液作為空白試料，直接供酶聯免疫測定法測定。 取空白尿2ml，於3000r／min離心l0min，上清液1.0ml添加l00ug／L的克倫特羅對照溶液20／H。作為2ug/l空白添加試料，直接供酶聯免疫測定法測定。 ②試料的制備(肝) 取約l00g新鮮或冷凍後融化的空白或供試豬肝,用勻漿機以10000r／rain勻漿1-2min，使均勻呈糊狀，一20~C以下冰箱中貯存備用。 取均漿後的供試肝樣，作為供試試料。 取均漿後的空白肝樣，作為空白試料。 取均漿後的空白肝樣(1土0．05)e添加l00ng／m1的克倫特羅對照溶液20tzL作為2ng／g空白添加試料。 a：提取(肝) 取(1士o．05)z試料，置50ml離心管中；加鹽酸溶液5.0mi，旋渦混勻，中速振盪1．5h；在10-15~C下以4000r／mill以上速度離心15min；上清液移人另一50ml離心管中，加入氫氧化鈉溶液300gL，混勻，振盪15min；加0.5mol／l磷酸二氫鉀溶液4。0ml，混勻，2-8~C放置過夜；取上述溶液於10～15~C以4000r／111113以上的速度離心15min，上清液備用。 b．凈化(肝) C，，固相萃取柱依次用無水甲醇3mi、0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2mi預洗，不使柱床乾涸；將備用上清液全部過柱；用0.05mol／L磷酸二氫鉀溶液2ml淋洗，擠干，棄去所有淋洗液；用無水甲醇2mi洗脫，流速控制在0.5ml／mm以下，擠干，收集洗脫液；於50～60~C下用氮氣或空氣緩緩吹乾洗脫液；殘余物用水1.0ml溶解，以4000r／mill以上的速度離心15rain，清液作為試樣溶液供酶聯免疫測定法測定。 ③測定 a．室溫應控制在19～30~C。 b．取在19-30~C放置1-2h的試劑盒，按每個標准溶液和試樣溶液至少兩孔計算所需酶聯板條的數量，插入框架。每個微孔加入用緩沖溶液100倍稀釋的抗體100~tL，封口膜封板，室溫孵育30min。 c倒出孔內液體，將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，使孔內沒有殘余液體。用多道移液器加水250pL到酶聯板的微?L內，稍後倒出孔內液體，再將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，如此重復操作洗板3次。 d．分別吸取標准溶液、空白試料、空白添加試料和供試試料各20uL，分別放入不同微孔底中央，並在每孔內加入用緩沖溶液100倍稀釋的酶結合物100~I。，在微型振盪器上混勻，用封口膜封好，室溫孵育30min。 e．倒出孔內液體，將酶聯板倒置在吸水紙上拍打，使孔內沒有殘余液體，重復洗板3次。 f．用多道移液器加入用底物緩沖溶液10倍稀釋的底物100uL，室溫避光孵育15min。 g．用多道移液器每孔加終止液100uL。 h．在1h內將酶聯板放於酶標儀內，於450nm波長處測定吸光度值。 (4)計算 用數據分析軟體對結果進行分析，繪出標准曲線，並得出試料中克倫特羅的含量。 (5)靈敏度和回收率 本方法的平均檢測下限為0.1mg／Kg。 本方法在1ug／kg添加濃度水平上豬尿回收率范圍為60％一120％，豬肝回收率范圍為40％～120％。參考資料/ http://www.zgny17.com

2. 瘦肉精檢測方法有哪幾種

（1）膠體金快速檢測法將待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上後，待檢物與金標試劑的結合物又與試紙條發生特異性結合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結果，從而實現特異性免疫診斷。測試卡分析快速，僅需3～5分鍾，無需專業人員操作，無需藉助儀器，可以憑肉眼觀察到結果，定性檢測，測試卡可常溫保存。
（2）酶聯免疫吸附法（ELISA）酶聯免疫吸附法是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其原理是利用抗原抗體特異性結合和酶的高效催化作用，通過化學方法將辣根過氧化物酶（HRP）與克侖特羅（CL）結合，形成酶偶聯克侖特羅。將固相載體上已包被的抗體與特異性的抗克侖特羅抗體結合，然後加入待測克侖特羅和酶偶聯克侖特羅，它們競爭性與克侖特羅抗體結合，洗滌後加底物，根據有色物的變化計量待測克侖特羅含量。若待測克侖特羅多，則被結合的酶偶聯克侖特羅少，有色物量就少。用目測法或比色法測定樣品中的克侖特羅含量，比色法的最佳波長為450納米。

3. 瘦肉精檢測的檢測

GB/T 5009.192-2003 動物性食品中克倫特羅殘留量的測定
氣相色譜-質譜法（GC-MS）
GC-MS法優點是把色譜高效快速的分離效果和質譜高靈敏度的定性分析有機合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。Fente C. A等用GC-MS法檢測牛毛中CLB的殘留，最低檢測限為5ng/g；Pteer Batioens應用氣相色譜－串聯質譜法(GC-MS-MS)對牛、羊、豬組織中的CLB含量進行檢測，最低檢測限為2ng/g；劉琪等用GC-MS法（EI離子源）檢測豬尿中的CLB，檢測限為0.5ng/mL；VanRhijin等用三甲基硅基或2-二甲基硅基嗎啉衍生物檢測尿提取物中的CLB，衍生物用電脈沖方式或化學離子化方式掃描，會產生更高的靈敏度。另外，GC-MS法與HPLC法相比，檢測靈敏度更高，假陽性率更低。因此，我國將GC-MS法定為檢測CLB的確證性方法（NY/T468~2001）。
高效液相色譜法（HPLC）
HPLC適合測定熱不穩定和強極性的β-激動劑及其代謝產物，而且，HPLC可以與柱前提取、純化及柱後熒光衍生化反應和質譜(MS)等系統聯用，容易實現分析過程的自動化。黃士新等(1995)應用紫外檢測器，在λ=243nm，色譜柱：shimpackCLC-ODS150×6.0mn，流速：1mL/min，柱溫：室溫30℃的條件下檢測豬肝臟和豬肉中的CLB殘留，最低檢測限可達2ng/g[4]。國外有人應用HPLC (二極體陣列檢測器)測定動物性食品中CLB殘留，測得最低檢測限為1.26ng/g，回收率達98.9%[5]。目前，我國已將HPLC法作為檢測CLB殘留的半確證性方法，最低檢測限范圍為1～15ng/g，其優點是專屬性好、選擇性強、檢測精確度較高，而且假陽性率低；缺點是樣品處理時間長，檢測過程煩瑣、難於操作，需貴重儀器，在實際應用中受到一定的限制。
酶聯免疫吸附法（ELISA ）
利用免疫學抗原抗體特異性結合和酶的高效催化作用，通過化學方法將植物辣根過氧化物酶（HRP）與克倫特羅（CL）結合，形成酶偶聯克倫特羅。將固相載體上已包被的抗體（羊抗兔IgG抗體）與特異性的抗克倫特羅抗體結合，然後加入待測克倫特羅和酶偶聯克倫特羅，它們競爭性與克倫特羅抗體結合，洗滌後加底物，根據有色物的變化計量待測克倫特羅量。若待測克倫特羅多，則被結合的酶偶聯克倫特羅少，有色物量就少。用目測法或比色法測定樣品中的克倫特羅含量，比色的最佳波長為450 nm，參比波長應大於600 nm。
膠體金免疫層析法（Colloidal gold immunochromatography）
利用競爭法膠體金免疫層析技術，檢測液中的Clen與金標墊上的金標抗體結合形成復合物，若Clen在檢測液中濃度低於靈敏度值，未結合的金標抗體流到T區時，被固定在膜上的Clen-BSA偶聯物結合，逐漸凝集成一條可見的T線；若Clen濃度高於靈敏度值，金標抗體全部形成復合物，不會再與T線處Clen-BSA偶聯物結合形成可見T線。未固定的復合物流過T區被C區的二抗捕獲並形成可見的C線。C線出現則表明免疫層析發生，即試紙有效. 1. 在進行測試前先完整閱讀使用說明書，使用前將試劑板和待檢樣本溶液恢復至室溫。
2. 撕開鋁塑袋，取出試紙。
3. 依據型號進行操作（尿液不得直接浸濕觀察區）。
3.1 將試紙白色一端浸入尿液中（液面不得超過橫線），保持5秒鍾；
3.2 用滴管吸取待檢樣品尿液，逐滴緩慢加入3滴樣品於加樣孔中。
4. 將試紙平放1分鍾，等待紅色條帶出現。
5. 3～8分鍾內讀取結果，10分鍾後判讀無效。
6. 10分鍾內可以檢測出結果 陽性（+）：僅質控區（C）出現一條紫紅色條帶。在測試區（T）內無紫紅色條帶出現。
陰性（-）：兩條紫紅色條帶出現。一條位於測試區（T）內，另一條位於質控區（C）內。
無效：質控區（C）未出現紫紅色條帶，提示測試失敗或試 紙已失效。
注意：測試區（T）內的紫紅色條帶可顯現出顏色深淺的現象。但是，在規定的觀察時間內，不論該色帶顏色深淺，即使只有非常弱的色帶也應判定為陰性結果。 1.檢測卡請在保質期內一次性使用。
2.檢測時避免陽光直射和電風扇直吹。
3.盡量不要觸摸檢測卡中央的白色膜面。
4.尿樣滴管不可混用，以免交叉污染。
5.如果尿樣出現沉澱或渾濁物，請離心後再檢測。
液相色譜—質譜/質譜法（HPLC-MS/MS）
參見SN/T 1924—2007 進出口動物源食品中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測方法。
本標准適用於動物源性食品肌肉和內臟中克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、特布他林殘留量的檢測。
試樣中的葯物殘留採用pH5.2的乙酸銨緩沖液提取，同時加入β-鹽酸葡萄糖醛甙酶-芳基硫酯酶進行酶解後，提取液經C18和SCX雙SPE柱凈化，液相色譜—質譜進行測定，內標法定量。

4. 如何檢測「瘦肉精」的殘留

目前，檢測「瘦肉精」殘留的方法主要有四種，即高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜-質譜法（GC-MS）、毛細管區帶電泳法（CE）和免疫分析技術（IA）。目前，我國將HPLC法作為「瘦肉精」檢測殘留的半確證性方法，其最低檢測限范圍為1～15納克/克。IA技術主要有放射免疫分析技術（RIA）和酶免疫分析技術（EIA）。RIA最低檢測限可達到0.5納克/克，國外已生產出RIA測定克倫特羅的試劑盒。檢測克倫特羅較高效的EIA是ELISA技術，檢測限可達0.05納克/克，最高可達0.003納克/克。我國研製的「瘦肉精」多克隆抗體檢測試劑盒，對樣品檢測的特異性強，檢測時間短，可同時檢測多個樣品。

5. 通過檢測豬的尿液能檢測出瘦肉精嗎

據廣州市動檢所介紹，目前業內採用的瘦肉精檢測法有三種。

一種是試劑條，只要浸入尿樣就可檢測，因其成本低、操作簡單，目前成為最廣泛使用的初檢法。試劑條單價7.95元，加上一次性接樣器皿等，檢測一頭豬大約花費9元，能測出濃度3微克/公斤以上的樣本，准確率達95%。

第二種檢測法為，如果試劑條發現問題，再用「酶聯免疫吸附試驗」進一步確認。酶檢法檢測一頭豬要花費22元，檢測精度可達1微克/公斤。此外，酶檢還可以直接檢測生豬的肌肉、內臟。涉及糾紛時，如果貨物量不大，用酶檢可得到雙方認可。

最後一種方法是使用「氣相質譜儀」，這款儀器檢測一頭豬的成本為800元，每個樣本要耗費四五個小時，一般只在涉及金額較大的糾紛時採用。

試劑條和酶檢是市場普遍使用的方法，此前有生豬檔主稱，瘦肉精「只要停葯一個月就測不出來」。但廣州市動物衛生檢疫監督所所長彭聰認為，如果此前生豬所含瘦肉精量大，排一個月也未必能躲過檢測;如果本來含量就小，檢測時濃度低於3微克/公斤，就可能檢不出來。「不過這個濃度雖然對人體不好，但不會有什麼症狀。」彭聰說。

6. 動物肉中瘦肉精用什麼方法檢測

可採用試劑盒檢測的方法。 檢測方法簡單易操作，無需專業技術知識即可操作。 採用優化選擇液體提取劑及固體提取劑，可將樣品中克倫特羅有效的提取出來並凈化其中的雜質-用膠體金檢測卡進行檢測時，條帶清晰，准確度高。特別適用於肌肉組織及飼料等樣品的檢測。 擴展 http://www.liujiaotishop.com/detail-195.html