如何選擇蛋白質的分離純化方法

A. 蛋白質純化技術的方法

一、電泳：
在克隆基因表達產物的檢測分析過程中，電泳是常用的方法，但在純化蛋白時，通常都不採用電泳的方法。由於某些特殊的目的，需要用聚丙烯醯胺凝膠電泳純化蛋白質，常用下述方法進行：①從電泳後的凝膠上切下所需的相應條帶，將凝膠壓碎，用緩沖液浸泡，使其中的蛋白質擴散出來，從而獲得純化的蛋白質。此法簡單但回收率低。②將電泳後的凝膠用電洗脫的方法使蛋白質從凝膠轉移到溶液中，從而達到純化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的電泳裝置。
二、色譜法：
色譜法（chromatography）是蛋白純化中最常用的一種方法，這種方法既可以制備大量的純化蛋白質，又可以保持蛋白質的生物學活性。色譜的種類很多，可分為常規色譜和高效液相色譜（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝膠過濾色譜、離子交換色譜、親和色譜等均為常規色譜法。HPLC包括反相高效液相色譜（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、離子交換高效液相色譜（ion exchange HPLC）等。根據目標蛋白性質的不同可選用相應的色譜分離技術純化蛋白質。
1.凝膠過濾色譜法
凝膠過濾色譜法（gel-filtration chromatography, GFC）又稱排阻色譜。凝膠是一類具有三維空間結構的多孔網狀顆粒物質，如瓊脂糖凝膠（sepharose）、葡聚糖凝膠（sephadex），將凝膠顆粒裝入色譜柱中即可用於物質的分離。當被分離物質通過凝膠柱時，大於凝膠孔徑的分子不能進入凝膠內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動和分配，流經的路途短，可很快被洗脫出來，而小於凝膠孔徑的分子則進入凝膠顆粒內部，在凝膠內部穿行，流經的路程長，移動的速度慢，最後被洗脫出來；分別收集不同時相的洗脫液，即可得到純化的物質。
GFC可在存在有多種離子、去污劑、尿素、鹽酸胍、高或低離子強度、常溫或低溫等多種條件下進行，根據所分離物質的性質不同可選擇相應的色譜條件，從而獲得有生物學活性的純化的生物大分子。
2.離子交換色譜法
離子交換色譜法（ion exchange chromatography,IEC）是根據物質的酸鹼度、極性和分子大小的不同進行分離的技術，通常包括吸附、吸收、擴散、穿透、靜電引力等復雜的物理化學過程。自然界的包括蛋白質在內的生物大分子都帶有電荷，當所需分離的物質通過離子交換色譜柱時，由於所帶電荷、分子量等不同，有些被固定相靠靜電引力所吸附，未被吸附的物質可被緩沖液首先洗脫出來；被吸附的物質由於所帶電荷多少不同，對固定相的親和力大小也不同，可被梯度離子緩沖液先後洗脫下來，使同一溶液中的不同物質被分離。色譜柱中填充的陰離子交換劑可用於帶正電荷物質的分離，而陽離子交換劑可用於帶負電荷物質的分離。
3.親和色譜法
許多生物大分子物質具有與其結構相對應的專一分子發生可逆性結合的特徵，如酶與底物及輔助因子、酶與抑制劑、抗原與抗體、激素與受體、核酸片段與其互補的核酸序列、生物素與親合素等，分子間的這種結合能力叫作親和力。
親和色譜（affinity chromatography）是利用生物大分子間所具有的特異性親和能力進行分離的方法。該方法常把可親和的一對分子中的一方固定在不溶於水的化合物上作為色譜的支持體即載體，使之固相化，作為固定相；另一方隨流動相流經固定相，雙方即可發生特異性結合；用流動相經過一段時間的洗滌，可將雜質去除，而後再利用親和吸附的可逆特性，改用特殊的流動相使所需分離的物質被解離下來，從而得到純化的物質。親和色譜法中的載體種類很多，最常用的是瓊脂糖凝膠（sepharose），其分子上有較多的羥基，活化後可與親和分子相耦聯，另外其理化性質穩定，不會影響色譜的分離過程。
親和色譜法可在溫和條件下操作，純化過程簡單、快速、解析度高，對分離含量極少且性質不穩定的生物活性物質極為有效。但由於不是任何生物大分子之間均有特異的親和力，而針對於某一種親和分子就需要制備專一的親和色譜柱，因此親和色譜的應用具有一定的局限性，主要由於蛋白質尤其是酶、抗原、抗體的分離與純化。

B. 蛋白質分離純化主要方法

分離純化某一特定蛋白質的一般程序可以分為前處理、粗分級、細分級三步。
1.前處理：分離純化某種蛋白質，首先要把蛋白質從原來的組織或細胞中以溶解的狀態釋放出來並保持原來的天然狀態（如果做不到呢？比如蛋白以包涵體形式存在），不丟失生物活性。為此，動物材料應先提出結締組織和脂肪組織，種子材料應先去殼甚至去種皮以免手單寧等物質的污染，油料種子最好先用低沸點（為什麼呢）的有機溶劑如乙醚等脫脂。然後根據不同的情況，選擇適當的方法，將組織和細胞破碎。動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿機破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由於具有纖維素、半纖維素和果膠等物質組成的細胞壁，一般需要用石英砂或玻璃粉和適當的提取液一起研磨的方法或用纖維素酶處理也能達到目的。細菌細胞的破碎比較麻煩，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一個借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎細菌細胞壁的常用方法有超聲波破碎，與砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理等。組織和細胞破碎後，選擇適當的緩沖液把所要的蛋白提取出來。細胞碎片等不溶物用離心或過濾的方法除去。
如果所要的蛋白主要集中在某一細胞組分，如細胞核、染色體、核糖體或可溶性細胞質等，則可利用差速離心的方法將它們分開，收集該細胞組分作為下步純化的材料。如果碰上所要蛋白是與細胞膜或膜質細胞器結合的，則必須利用超聲波或去污劑使膜結構解聚，然後用適當介質提取。
2. 粗分級分離：當蛋白質提取液（有時還雜有核酸、多糖之類）獲得後，選用一套適當的方法，將所要的蛋白與其他雜蛋白分離開來。一般這一步的分離用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法。這些方法的特點是簡便、處理量大，既能除去大量雜質，又能濃縮蛋白溶液。有些蛋白提取液體積較大，又不適於用沉澱或鹽析法濃縮，則可採用超過濾、凝膠過濾、冷凍真空乾燥或其他方法進行濃縮。
3.細分級分離：樣品經粗分級分離以後，一般體積較小，雜蛋白大部分已被除去。進一步純化，一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等。必要時還可選擇電泳法，包括區帶電泳、等電點聚焦等作為最後的純化步驟。用於細分級分離的方法一般規模較小，但解析度很高。
結晶是蛋白質分離純化的最後步驟。盡管結晶過程並不能保證蛋白一定是均一的，但是只有某種蛋白在溶液中數量上佔有優勢時才能形成結晶。結晶過程本身也伴隨著一定程度的純化，而重結晶又可除去少量夾雜的蛋白。由於結晶過程中從未發現過變性蛋白，因此蛋白的結晶不僅是純度的一個標志，也是斷定製品處於天然狀態的有力指標。
蛋白質分離純化的方法：
一、根據分子大小不同的純化方法
1、透析和超過濾
2、密度梯度離心
3、凝膠過濾
二、利用溶解度差別的純化方法
1、等電點沉澱和pH控制
2、蛋白質的鹽析和鹽溶
3、有機溶劑分級分離法
4、溫度對蛋白質濃度的影響
三、根據電荷不同的純化方法
1、電泳
2、聚丙烯醯胺凝膠電泳
3、毛細管電泳
4、等電聚焦
5、層析聚焦
6、離子交換層析
四、利用選擇性吸附的純化方法
1、羥磷石灰層析
2、疏水作用層析
五、利用配體的特異生物學親和力的純化方法
親和層析（affinity chromatography）：
a.凝集素親和層析
b.免疫親和層析
c.金屬螯合層析
d.染料配體層析
e.共價層析
六、高效液相層析合快速蛋白質液相層析

C. 常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種

分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.
常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉澱：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽,以破壞蛋白質的膠體性質,使蛋白質從溶液中沉澱析出,稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時,溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑,如乙醇、甲醇、丙酮等,均可引起蛋白質沉澱.2、電泳法：蛋白質分子在高於或低於其pI的溶液中帶凈的負或正電荷,因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決於蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質,可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異,在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析,凝膠層析,吸附層析及親和層析等,其中凝膠層析可用於測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法,蛋白質溶液加於柱之頂部,任其往下滲漏,小分子蛋白質進入孔內,因而在柱中滯留時間較長,大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出,因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同,經超速離心後,分布於不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量,蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.

D. 根據蛋白與雜蛋白的大小可以選擇怎樣的方法來分離

蛋白質的分離純化方法
2.1根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。

E. 蛋白質分離純化的5種方法主要有什麼

蛋白質分離純化常用方法有：
1、沉澱,
2、電泳：蛋白質在高於或低於其等電點的溶液中是帶電的,在電場中能向電場的正極或負極移動.根據支撐物不同,有薄膜電泳、凝膠電泳等.
3、透析：利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法.
4、層析：
a.離子交換層析,利用蛋白質的兩性游離性質,在某一特定PH時,各蛋白質的電荷量及性質不同,故可以通過離子交換層析得以分離.如陰離子交換層析,含負電量小的蛋白質首先被洗脫下來.
b.分子篩,又稱凝膠過濾.小分子蛋白質進入孔內,滯留時間長,大分子蛋白質不能時入孔內而徑直流出.
5、超速離心：既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量.不同蛋白質其密度與形態各不相同而分開.

F. 分離和提純蛋白質的方法

1. 前處理
把蛋白質從原來的組織或溶解狀態釋放出來,保持原來的天然狀態,並不丟
失生物活性.常用的方法：勻漿器破碎、超生波破碎、纖維素酶處理以及溶菌酶等.
超聲波破碎法：當聲波達到一定頻率時,使液體產生空穴效應使細胞破碎的技術.超聲波引起的快速振動使液體局部產生低氣壓,這個低氣壓使液體轉化為氣體
,即形成很多小氣泡.由於局部壓力的轉換,壓力重新升高,氣泡崩潰.崩潰的氣泡產生一個振動波並傳送到液體中,形成剪切力使細胞破碎.
2． 粗分級
分離可用鹽析、等電點沉澱和有機溶劑分級分離等方法.這些方法的特點是簡便、處理量大,
3． 細分級
樣品的進一步純化.樣品經粗分離以後,一般體積較小,雜蛋白大部分已被除去.進一步純化,一般使用層析法包括凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等.必要時還可選擇電泳、等電聚焦等作為最後的純化步驟.
結晶是最後的一步