中性樹膠快速乾片方法

❶ 細菌塗片怎麼製作

實驗准備材料：酒精燈、接種環、染液、載玻片、菌種、生理鹽水等

步驟：

1.取一塊干凈無菌的載玻片，在載玻片中央滴一滴生理鹽水。

(1)中性樹膠快速乾片方法擴展閱讀：

實驗注意事項：

1.接種環必須要圓滑平整，使用前後必須在酒精燈上燒灼滅菌。

2.注意做好實驗過程記錄，實驗名稱及日期。

3.塗片不要太厚，要均勻。

4.塗片固定時一定要把握時間和溫度，避免溫度過高引起菌體破壞。

❷ 200分求科研實驗切片的操作

石蠟切片法 ：
石蠟切片法是以石蠟作包埋劑,用旋轉切片機將材料切成薄片,經一系列處理製成永久製片的方法.在研究植物的細胞,組織,胚胎以及形態等方面石蠟切片法是最理想的製片方法.
石蠟切片法的一般流程為:取材→固定→抽氣→洗滌→脫水→透明→浸蠟→包埋→修塊→切片→粘片→染色→封片.
取材
用鋒利的刀片切取新鮮的植物材料,選定適宜的材料,立即固定.
取材的注意事項如下:
(1)取材料要新鮮.動作要迅速,以免擠壓損壞組織;取病理材料時,應設置對照材料.
(2)所取材料大小要適當:根和莖一般直徑≤5mm,切取成5-10mm小段;葉片一般取過中脈處,切成2-5mm寬,5-8mm長.在切材料時,必須注意刀片與中軸成直角,兩切面平行,否則製成的切片細胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.
(3)取材時間可根據切片要求有所區別.如:在進行植物發育的研究過程時,需要找到細胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00時取材,此時植物細胞分裂活動較明顯.
(4)取材不易過老,否則製片有難度(過老的材料須在滑走切片機上進行);對縱切的材料適當多取材,如根尖,莖尖等,因為切到材料正中的概率較低.
(二)固定
將已切好的材料盡快地浸入相當於材料10-15倍體積的固定液中.藉助固定液的作用,使細胞的新陳代謝瞬時停止,並保持細胞或組織的形態構造及其內含物的狀態不發生變化.從而達到使組織變硬從而便於切片,增強內含物的折光度,令細胞易於著色的目的,同時具有防腐作用.以新鮮配製固定液效果較好.固定的時間依材料的種類,性質,大小等而定.材料固定完畢,保存於加蓋的容器內,貼上標簽.
良好的固定劑,應是穿透力強,使細胞立刻致死,原生質全部凝固;不發生任何變形,增強折光率,並且不妨礙染色.
常用固定液:
簡單固定液 以一種化學葯品配製的固定液.
⑴ 乙醇 為凝固型固定劑.常用無水乙醇或95%乙醇.
⑵ 甲醛 為非凝固性固定劑.具強烈刺激性氣味.純凈的甲醛為無色透明液體.固定用的濃度為4%-10%.
⑶ 醋酸 為凝固型固定劑.為無色透明的液體,刺激性極強,低溫下凝結成冰,故又名冰醋酸.
2. 混合固定液:
由幾種試劑,適量配製而成.混合遵循原則:① 優缺點互補;② 膨脹與收縮相互平衡;③ 強氧化劑與還原劑應分別配置.
常用混合固定液有下列幾種:
⑴ FAA 固定液(福爾馬林-冰醋酸-乙醇) 廣泛適用於根,莖,葉,花葯,子房的組織切片,所以又稱為萬能固定液.一般固定時間不低於24 h.該固定液優點是在較低溫度下(10℃左右)適用於材料的長期保存,可兼作保存液.並且固定的材料,不妨礙染色,但用於細胞學上的固定效果較差.

⑵ 納瓦興(Navaschjn's)固定液 1912年首創.適用於細胞學與組織學研究的切片觀察.但滲透慢,不能長期保存;主要用於顯示分裂相.
(三)抽氣
植物材料內部多由於含有空氣,導致固定液不能完全深入.材料投入固定液後需要立即抽氣.以便讓固定液有效透入材料組織中,並排除材料內氣泡的干擾.
一般抽氣時間為20-30 min.抽過氣的材料在停止抽氣,應沉入底部.
(四)洗滌
固定液中的成分有可能會妨礙染色或發生沉澱或結晶,影響觀察;有的還會繼續作用,使材料變質等.因此,在使用材料時,需根據固定液的種類,用水,緩沖液或70%乙醇洗去滲入細胞內部的固定液.如:用FAA固定的材料在脫水時用70%乙醇反復洗滌數次.如用水洗滌,可將材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用紗布將管口扎緊,置於水槽內,進行流水沖洗.流水沖洗時間一般為12-24 h.
(五)脫水
材料經洗滌後含有部分水分,會使材料分解.而且透明劑與水是不相混合的,不利於材料的透明和包埋等後期處理.因此需用脫水劑逐漸除去材料中的水分,以便讓石蠟滲透進細胞.所以,脫水是製片的關鍵環節.脫水劑要求能與水混合,而且能與其他有機溶劑互相替代.
脫水必須在有蓋的玻璃器皿中進行,防止吸收空氣中的水分;在更換高一級的脫水劑時,最好不要移動材料,以免損壞材料.
(六)透明
透明劑要具有既能與脫水劑相混合又能和石蠟相混合的性質,可以將材料中的脫水劑置換出來,使石蠟能順利進入材料中.
二甲苯是目前應用最廣的透明劑,作用迅速,但易使材料變脆..
(七)浸蠟
是指逐步清除材料中的透明劑,以使石蠟充分滲透於材料內部的過程.這樣,材料的各部分都能保持原來的結構與位置,切片不致發生破裂或其他變形.
浸蠟是一個漸進的過程,常用的正丁醇.
每次浸蠟的時間,視材料大小而調節.
(八)包埋
材料經過足夠時間的浸蠟後,需包入蠟塊,以備切片.
操作方法:根據切片材料大小,確定所需紙盒的尺寸,用表面光滑的磅紙預先疊好紙盒.
(九)切片
即將包埋好的材料塊用切片機切成所需厚度的切片帶.
(十)貼片
是用黏貼劑把切片平鋪貼在載玻片上,以便於染色和觀察.
常用的粘片劑有下列二種:
(1) 明膠黏片劑
(2) 蛋清黏片劑
(十一) 染色
即根據植物細胞中不同的化學性質,用染料分別進行染色,以利於觀察切片中細胞與組織的形態與構造及其內含物等.染色基本程序為脫蠟,染色,分色封片.
染色方法可分為下列幾類:
① 單染 只用一種染料染色.
② 雙重染色 兩種染料染色,如番紅--固綠;蘇木精---曙紅.
③ 多重染色 多種染料染色,如番紅—固綠—桔紅G;酸性品紅—苯胺藍—桔紅G等.
(十二) 封藏
封藏於中性樹膠中,使材料能在顯微鏡下清晰地顯示出來,並能長期保存.
方法:將含材料的載玻片放在吸水紙上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴樹膠(必須在二甲苯乾燥前進行),用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側,稍微傾斜使其左側與封藏劑接觸,然後再緩慢地放下,避免產生氣泡.
冷凍切片法：
冷凍切片的製作方法

（1）低溫恆冷箱冷凍切片製作法

1．本室現有Shandon As 620 E型恆溫箱冷凍切片機的主要性能。該機的箱面上有電子控制板，裝有即時冷凍鍵和除霜鍵，啟動即時冷凍鍵，機器馬上進行工作狀態，並可持續10mins。啟動即時除霜鍵，可將工作間頂部後面的製冷柵上的霜除掉，並可持續15mins。有照明鍵一個，啟動該鍵可照明工作間，有利工作及觀察組織的冰凍狀況。配有消毒鍵一個，當進行一周的工作或者一天的工作後，啟動該鍵，可對工作間進行消毒。當每天工作完畢時，可啟動密鎖鍵，鎖住工作間。除此之外，箱面的左邊有四個按鍵，兩個為快速自動進退鍵，兩個為微小進退鍵，還有一個手動旋鈕，調節修組織塊時的進退。

冷凍箱內左邊的冷凍台，溫度可達-60℃左右，冷凍箱的中間為一台切片機，工作間的溫度在0-30℃間可任意調節，並在箱面上的熒屏顯示出來。

2．操作方法及步驟：

①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24×24×2mm。

②取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放於冷凍台上，冰凍。小組織的應先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小台後，再放上細小組織，滴上包埋劑。

③將冷凍好的組織塊，夾緊於切片機持承器上，啟動粗進退鍵，轉動旋鈕，將組織修平。

④調好欲切的厚度，根據不同的組織而定，原則上是細胞密集的薄切，纖維多細胞稀的可稍為厚切，一般在5～10um間。

⑤調好防卷板。製作冰凍切片，關鍵在於防卷板的調節上，這就要求操作者要細心，准確地將其調較好，調校至適當的位置。切片時，切出的切片能在第一時間順利地通過刀防卷板間的通道，平整地躺在持刀器的鐵板上。這時便可掀起防卷板，取一載玻片，將其附貼上即可。

⑥應視不同的組織選擇不同的冷凍度。冷凍箱中冷凍度的高低，主要根據不同的組織而定，不能一概而論。如：切未經固定的腦組織，肝組織和淋巴結時，冷凍箱中的溫度不能調太低，在-10- -15℃左右，切甲狀腺、脾、腎、肌肉等組織時，可調在-15～20℃左右，切帶脂肪的組織時，應調至-25℃左右，切含大量的脂肪時，應調至-30℃。

3．冰凍切片時的注意事項：

①防卷板及切片刀和持刀架上的板塊應保持干凈，需經常用毛筆挑除切片殘余和用柔軟的紙張擦。有時需要每切完一張切片後就用紙擦一次。因為這個地方是切片通過和附貼的地方，如果有殘余的包埋劑粘於刀或板上，將會破壞甚至撕裂切片，便切片不能完整切出。

②多例多塊組織同時需做冰凍切片時，可各自放於不同的支承器上，於冷凍台上凍起來，然後依據不同的編號，依序切片，這樣做既不費時也不會亂。

③放置組織冰凍前，應視組織的形狀及走勢來放置，所謂「砍柴看柴勢」，切片也是如此，如果胡亂放置，就不能收到很好的效果。

④組織塊不須經各種固定液固定，尤其是含水的固定液，在未達到固定前，更不能使用。臨床快速冰凍切片，不須要預先固定，一是為了爭取時間，二是固定了的組織，反而增加了切片的難度。如果使用未完全固定的組織做冰凍切片，就會出現冰晶。這是因為含水的固定液在組織未經固定前，其中的水份也可滲入到組織中去，當冰凍發生時，這些水份就存留於組織中，形成了冰晶。

⑤當切片時，如果發現冰凍過度時，可將冰凍的組織連同支承器取出來，在室溫停留片刻，再行切片，或者用口中哈氣，或者用大拇指按壓組織塊，以此來軟化組織，再行切片。另者，調高冰凍點。

⑥用於附貼切片的載玻片，不能存放於冷凍處，於室溫存放即可。因為當附貼切片時，從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差，當溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時，由於兩種物質間溫度的差別，當它們碰撞在一起時，分子彼此間發生轉移而產生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片，由於溫度相同，沒有發生上述的現象。

4．冰凍切片的快速染色法

冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定1分鍾後即可染色。以往，為了防止切片脫落，當切片附貼於載玻片後，即用電吹風吹乾後再固定。根據實驗對比認為這種做法欠妥未經固定的切片，強熱作用後，蛋白發生變性，核內含有的物質由於熱的作用融合在一起，染色後鏡下分辨不出核內的各種物質。冰凍切片附貼於載玻片後，立即放入恆冷箱中的固定液固定，這樣可以使切片中細胞內各種物質都在沒有任何變化的情況下被固定起來，經一年多來1000例冰凍切片的製作實踐認為這樣製作固定切片好，核染色質清晰，核仁明顯，其他物質都完好保存。

方法：

① 切片固定30秒－1分鍾。

② 水洗。

③ 染蘇木素3－5分鍾。

④分化。

⑤ 於鹼水中返藍20秒。

⑥ 伊紅染色10－20秒。

⑦脫水，透明，中性樹膠封固。

冰凍組織1－2分鍾，切片1分鍾，固定1分鍾，染色共五分鍾。總共在10分鍾內完成快速製片過程，結果與石蠟切片不相上下。

冰凍切片的方法還有很多種，如甲醇循環的半導體冰凍切片法，二氧化碳冰凍切片法，半導體冰凍切片法和氯乙烷冰凍切片法等，這些方法在目前來說已很少使用，因此在這里不作闡述。

❸ 請教巴氏染色的原理，越詳細越好

巴氏染色法是脫落細胞染色中最好的染色方法。蘇木素染液，細胞核內的染色質主要是去氧核糖核酸（DNA）,DNA的雙螺旋結構中，兩條鏈上的磷酸基向外，帶負電荷，呈酸性，很容易與帶正電荷的蘇木素精鹼性染料以離子或氫鍵結合而被染色。蘇木精在鹼性溶液中呈藍色，所以細胞核被染成藍色。 分化：蘇木素染色之後，用水洗去未結合在細胞上的染液，但是在細胞核中結合過多的染料和細胞漿中吸附的染料必須用分化液1%鹽酸酒精脫去，才能保證細胞核和細胞漿染色的分明，把這個過程稱為染色的分化作用。因酸能破壞蘇木素的醌型結構，使色素與組織解離，分化不可過度。藍化：分化之後蘇木素在酸性條件下處於紅色離子狀態，在鹼性條件下處於藍色離子狀態，而呈藍色，所以分化之後用水洗去酸而中止分化，再用弱鹼性水使蘇木精染上的細胞核變呈藍色，稱藍化作用，一般多用自來水浸洗即可變藍，也可用溫水（50度溫水最佳）變藍。EA50染液的酸鹼度對於巴氏染色的成功起著關鍵作用，EA50染液由伊紅、亮綠、等染料配成。伊紅、亮綠、橘黃等屬於酸性染料，在溶解媒中其發色團是負離子部分，發色團可與蛋白質中帶正電的氨基結合，從而是胞漿顯藍色、綠色、橘黃色或紅色，但蛋白質所帶正負電荷的多少是隨溶液的PH值而改變的，在偏鹼環境中，蛋白質的羧基游離增多（帶負電），在偏酸環境中蛋白質氨基游離增多（帶正電），磷鎢酸在染色過程中，不但作為媒染劑可增加染料的著色力，同時磷鎢酸與碳酸鋰還是一對弱酸弱鹼，實際上是一對緩沖劑，可中和分化及藍化時可能留下的少量酸或鹼，保證染色達到理想效果，其適用於上皮細胞及間皮組織的標本，是陰道脫落細胞檢查中最常用的染色方法，該染色法不但具有顯示細胞核結構清晰、分色明顯、透明度好、胞漿受色鮮艷等特點。

巴氏染色法將胞核染為深藍色；鱗狀上皮底層、中層及表層角化前細胞胞質染綠色，表層不全形化細胞胞質染粉紅色，完全形化細胞胞質呈桔黃色；細菌：灰色；滴蟲：淡藍灰色；黏液：淡藍色或粉紅色；中性粒細胞和淋巴細胞、吞噬細胞胞質均為藍色；紅細胞染粉紅色；高分化鱗癌細胞可染成粉紅色或桔黃色；腺癌胞質呈灰藍色。

巴氏染色的操作方法及注意事項
染色有4個步驟：1、固定；2、核染色；3、胞漿染色；4、透明。
主要達到以下要求：1、核的結構清晰；2、透明度高；3、分色恰當。
一、固定
固定的目的細胞製片的迅速固定是製片過程中關鍵的一步，否則會影響細胞學診斷的准確性。對於不同的標本需要不同的固定方法。最為常用的固定方法是95％酒精作為固定液的濕固定法。酒精作為一種脫水劑能夠防止細胞內的酶捋蛋白質分解而自容，並凝固細胞內的物質如蛋白質、脂肪和糖類等，使其保持與組織生活相仿的成分，從而使細胞各部分，尤其核染色質易於著色。對於巴氏染色來說，酒精固定最為重要的。如果酒精濃度不足引起的固定不佳，可造成細胞的人為變化，並可導致假陽性或假陰性的診斷。
1、固定方法濕固定法：作為用95％酒精固定液固定的細胞學標本一定使用濕固定法。製片制備完後，趁標本新鮮而又濕潤時，立即放入盛有95％酒精的固定缸內。製片在固定液內至少保持15-30min。固定時間通常不超過1周。這種製片染色後，顏色鮮艷，結構清晰。如果細胞製片需要送至另一實驗室或郵寄他處染色時，可以固定15min後，把製片取出後立即密封的容器中或者使用甘油防止製片乾燥。因為無論固定前或固定後的製片，如果發生乾燥後都會影響染色的效果。
2、固定注意事項固定液的過濾：為了防止細胞污染，凡是使用過的固定液，必須過濾後才能再使用。使用過長的固定液，必須用酒精相對密度計測定，酒精濃度低於90％時應該及時更換新液。濕固定的重要性：標本再新鮮時及時固定時保證染色效果的重要因素。如蘇木素對細胞核的染色，巴氏染色中胞漿的特殊著色作用，均可因標本乾燥後固定而大受影響。製片標本的郵寄：標本再固定15min後取出，立即加甘油數滴於製片上，裝入密封的小盒中。實驗室在收到標本後，先浸入95％酒精中，使甘油溶去，再進行染色。
二、核染色
1、 蘇木素液浸染時間一般在3-5min，但是必須隨氣溫和燃料情況而酌情改變。夏季或放置較久的蘇木素染液容易著色，時間要縮短；冬季或新配製的蘇木素染液和應用已久較稀釋的蘇木素液不易著色，時間要延長。在使用蘇木素染色時，一般有2種方法：
1）過染法：首先有意識地進行深染，然後通過鹽酸酸化過程使核染色趨於合適。這種方法能夠在酸化過程中把胞漿內黏附多餘的蘇木素染料去掉，使胞漿染色更為鮮艷、清晰、多用於黏液多的標本。
2）淡染法：在核染色過程中，嚴格掌握染色時間，使核染色適宜而不用鹽酸酸化，但是胞漿中少量的蘇木素會影響EA染色的質量。主要用於黏液少的標本，避免在酸化和自 來水沖洗的過程中使細胞成片地脫落。在使用蘇木素染色時，一定要每日進行過濾，否則蘇木素結晶會影響染色的質量。一般蘇木素染液可以使用較長時間，所以每日增加少量新鮮染液即可。
2、鹼化鹼化亦稱返藍過程，可以使用飽和碳酸鋰或3％氨水鹼化，目的使蘇木素及早顯色，時間約數秒。更重要的是流水沖洗，可使藍色顯的更鮮艷。鹼性溶液亦需要充分漂清才不會妨礙下一步的胞漿著色及標本製成後的顏色保存。分化和鹼化溶液至少每天更換新液。
三、胞漿染色
胞漿染色在巴氏方法中亦稱為OG—EA染色，它包括橘黃G（OG）和EA兩部分染色。由於橘黃G是一種小分子染料，能夠很快地作用於胞漿，一般染色時間不宜過長，通常1-2min。對於宮頸、陰道上皮中非正常角化細胞和角化型鱗癌細胞的胞漿中都可以出現鮮艷的橘黃色。
四、封固製片
封固製片對於避免空氣乾燥的影響，製片經長期存放不褪色是非常重要的。一般使用24mm×50mm或24mm×60mm的蓋玻片，用二甲苯調配的中性樹膠進行封固。
五、透明
染色的最後一步是透明，使細胞的色度與細胞的重疊不致影響鏡下檢查。這是在脫水與製片封固之間的一項重要步驟。最常用的透明溶劑使二甲苯，二甲苯的折射率在1.494，載玻片的折射率在1.515，兩者較為匹配。如果二甲苯溶液出現顏色或變得渾濁，一定要更換新液。 巴氏染色操作流程 95％乙醇固定（15min）→清水沖洗多次→蘇木素染液（3-5min）→清水沖洗三次→藍化→95％乙醇漂洗→橙黃染液（1-10s）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→100%乙醇漂洗→EA50（3-5m）→95％乙醇漂洗→95％乙醇漂洗→無水乙醇漂洗→無水乙醇（2min）→二甲苯（2min）→中性樹膠封片
染色注意事項
1、細胞核著色不佳
（1）細胞核著色過淺：
1）鹽酸分化時間過長或蘇木素染液時間過長。需要縮短分化時間或延長鹼化時間；每日加入少量新鮮蘇木素染液或重新配製蘇木素液。
2）在固定之前製片乾燥。所以對巴氏染色的製片需要嚴格遵守濕固定的原則。
3）自來水的PH值偏酸性。使用鹼性溶液。
（2）細胞核著色過深：
1）鹽酸溶液濃度不夠。適當加入幾滴鹽酸以增加濃度。
2）製片用高於95％以上濃度的酒精固定後可以出現染色過深。應用95％酒精固定。
2、細胞漿著色不佳
（1）如果全片內胞漿都淡染，則需要延長染色時間或更換新液。
（2）如果胞漿不分色，均為淺紅色。製片在固定前乾燥或製片被有大量球菌樣細菌影響胞漿染色。此情況可以適當增加染色時間能夠部分糾正不分色狀況。
（3）胞漿染成灰色或紫色，是由於蘇木素染色時間過長或鹽酸分化不佳。經過褪色後重新蘇木素可以糾正。
（4）由於標本的不同，同樣配方的EA染液可造成偏藍、偏綠和偏紅，對不同的標本應該使用不同的EA染液。一般認為，EA36和EA50用於婦科標本，而EA65或改良EA用於非婦科標本。
（5）胞漿不分色的另一重要原因是由於EA染液的PH值不恰當所致。如染色為紅色，可以加少許磷鎢酸溶液糾正；如染色均為藍色或綠色，可以加少許飽和碳酸鋰溶液糾正。對於改良EA染液，每100ml染液加入2ml冰醋酸後染色效果更佳；染液使用更持久