❶ siRNA轉染實驗
通常是建議用來稀釋siRNA和稀釋轉染試劑的培養基是無血清培養基。但我們課題組用的BIODAI轉染前後不需要換成無血清培養基。遇到特別的，可以在轉染開始之前更換新鮮的含血清培養基，以防轉染後孵育階段細胞密度太大、營養不足導致的細胞死亡。
❷ 細胞轉染的方法
DEAE-葡聚糖法。
磷酸鈣共沉澱轉染。
電穿孔法。
脂質體法。
病毒介導的感染，病毒感染增強劑。
非脂質體轉染 。
❸ siRNA實驗方法和設計常見問題解答
Q:如何選擇轉染方法和轉染試劑？
A:我們的siRNA適用於各種轉染方法。轉染方法和轉染試劑的選擇，需要根據細胞來選擇，對於容易轉染的細胞，常用的轉染方法是脂質體轉染。
Q:對於難轉染的細胞，應該如何提高其轉染效率？轉染效率又該如何確定？
A:1)對於貼壁細胞，推薦採用轉染試劑轉染即可；2)對於難轉染的細胞的轉染，如何提高轉染效率的問題也是目前研究的技術難題。一般建議使用電轉的方法，但是由於電轉的方法對細胞損傷比較大，該方法也未必是最佳的。
轉染效率的確定，常用的是使用熒游標記的siRNA，通過熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，流式細胞儀檢測的方法。具體可以參考我們的產品說明書。
Q:細胞的轉染效率是否與siRNA序列相關？
A:轉染效率的高低取決於與細胞自身及轉染方法，而於siRNA的序列並沒有直接關系。因此，siRNA在不同的細胞轉染效率可能不一樣。
Q:轉染siRNA時候的細胞密度多少為宜？
A:依不同的轉染方法或轉染試劑而定。如使用lipofectamine 2000作為轉染試劑，單獨轉染siRNA，30%～50%密度較佳；而siRNA與質粒共轉染，密度可以到80%-90%。
Q:siRNA轉染時的培養基要求，可否含血清？
A:不同的轉染試劑可能有不同的要求，對於lipofectamine 2000，在配製siRNA和lipofectamine 2000混合物時不能含有血清，但細胞培養基可以含有血清，但不能含有抗生素。
Q:siRNA的儲存液體濃度和工作濃度有何區別？
A:siRNA的貯存濃度就是保存的最佳濃度，銳博推薦的貯存液濃度為20 μM；而siRNA的工作濃度就是使siRNA能夠達到最佳沉默效果的轉染濃度，一般10～100 nM范圍內，銳博生物推薦的轉染濃度是50nM。
Q:轉染時該如何分組？分組的目的是什麼？
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Q:為什麼說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要？
A:陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說，當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時，您能確保在您的實驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。
Q:陽性對照及其陰性對照在RNAi實驗中的作用？如何選擇？
A:陽性對照指的是已經驗證的針對看家基因或報告基因有效的siRNA，用於監測實驗體系和實驗方法的可行性。我們可以提供的陽性對照siRNA有針對GAPDH，ACTB，GFP/EGFP有效的siRNA作為陽性對照，客戶可以根據具體的實驗需要選擇。陰性對照往往是非特異的siRNA，主要用於說明siRNA作用的特異性。陰性對照的選擇可以是通用的序列（universal）或是隨機打亂的序列（scramble），客戶可以根據實驗要求選擇。
Q:用熒光對照siRNA如何檢測轉染效率？是不是每次實驗都必須做？
A:我們提供的轉染對照siRNA帶有Cy3或Cy5熒游標記，可以通過熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，流式細胞儀等熒光檢測儀器檢測。 除此之外，還應該通過陽性對照實驗進一步確定。轉染效率的高低主要與細胞自身相關，同等實驗條件下，每次轉染細胞轉染效率應該是相近的，因此可以不必每次都做。但如果每次實驗都做一個熒光對照組，將會更加便於排除一些實驗問題。
Q:siRNA熒光染料的最大吸收率和發射率各在哪個波段？
A:FAM在495nm處有最大吸收率，在520nm處有最大發射率。
Cy3在550nm處有最大吸收率，在565nm處有最大發射率。
Cy5在643nm處有最大吸收率，在667nm處有最大發射率。
Q:轉染後出現細胞死亡是什麼原因？如何優化轉染條件？
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Q:到了轉染時間發現細胞密度太低，該如時轉染還是讓細胞多長一天再轉染？
A:細胞生長需要一定的密度，而轉染試劑對細胞有一定的毒性，如果轉染時細胞密度過低，細胞可能會因此生長異常甚至死亡。轉染前要求良好的細胞狀態和細胞活性，一般也不建議用生長幾天的細胞做轉染。
Q:siRNA的作用效果應該如何檢測？
A:通常可以從三個方面來相互驗證siRNA的作用效果
3）根據目的基因的功能，從細胞表型的水平檢測。
Q:siRNA在細胞內可以作用多長時間？什麼時候才是最好的檢測時間？
A:siRNA介導的RNAi屬於瞬時現象，不能穩定傳代，一般其作用時間不可能維持很長時間，通常建議在轉染後3 4天內完成檢測。最佳檢測時間，因細胞、目的基因而異，多在轉染後24 48小時之間檢測。
Q:為什麼要強調mRNA水平檢測？可以直接檢測蛋白和功能嗎？
A:siRNA直接作用於mRNA，因此mRNA水平檢測是最直接在指標。
很多客戶認為，mRNA的降解直接的結果應該是對應蛋白質含量的下降，因此蛋白水平的檢測結果也應該可以作為有效性的檢測指標。事實上，很多情況下往往出現，mRNA下降水平與蛋白下降水平不對應的現象。其可能原因有：
Q:干擾效率多高才是好的靶點？
A:沒有明確的界定，干擾效率高低因不同的細胞類型和不同的基因而異。不同細胞類型的轉染效率也不盡相同，不同基因的表達水平也相差較大，主要看干擾效果而定。
Q:沉默效果不理想，應該如何處理？
A:最常見的影響沉默效果的兩個原因是：轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或採用了新的細胞系，並發現沉默效果不佳，我們建議您對轉染效率進行檢測，並選擇優化轉染條件。如果您已經對實驗轉染條件進行優化但是問題依然存在，我們建議您換用另一種轉染試劑或是採用其他技術，這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求，可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。
Q:siRNA反而使得目的基因表達上調了，這是什麼原因？該怎麼解決？
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Q:我從陰性對照實驗中得到和特異性RNAi相同的結果，這說明了什麼？
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Q:各組陰性對照的檢測結果是否應該一樣？如果偏差很大該怎麼辦？
A:正常情況下，各組陰性對照的檢測結果應該是相近的。如果偏差過大，只需考慮實驗結果的准確性。另外，對於一些特定的基因，比如與細胞難受壓力相關的基因，又如參與細胞免疫的基因，可能會對外界壓力比較敏感，使得各組對照的基因表達發生變化不一致。
Q:用100nM 的siRNA轉染時只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎？
A:當干擾效率不佳時，可以在一定范圍內適當優化轉染濃度，通常優化的范圍是10~150nM，但不宜過大，高濃度的siRNA將可能增加非特異性作用的可能性並對細胞產生毒性。
Q:同樣的siRNA，為什麼在細胞A很有效，在細胞B則沒有效果？
A:不同細胞的轉染效率不一樣、基因表達水平也不一樣，這些都與siRNA的作用效率有關
siRNA實驗方法和設計常見問題解答- 答疑集錦- 非編碼RNA研究策略-銳博技術專題專題—丁香園會議頻道 (dxy.cn)
❹ 脂質體轉染原理
1定義編輯
最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發現了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體。
2特徵編輯
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹入內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，並進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達。
已有眾多的文獻報道，脂質體本身會參與細胞生理活動,引起基因表達的上調或下調。如參與PKC（蛋白激酶C）通路調節(Biochemistry.1992 Sep 22;31(37): 9025-30)；如抑制ATP酶的活性(Biochim Biophys Acta.2008 Apr;1777(4):362-8)；如與線粒體膜發生作用(J Biol Chem. 1989 Jan 25;264(3):1508-15)；轉染siRNA造成脫靶效應等等。細胞毒性的大小往往意味著對細胞生理活動影響的大小，脂質體這些作用是造成細胞毒性的根本原因。這會對相關研究數據產生嚴重的干擾，甚至影響研究的結論。這已引起了許多研究者的注意。
雖然人們早已發現脂質體對細胞的毒性，對研究的影響，但由於一直沒有更好的方法尤其是更高效的轉染方法代替脂質體，所以脂質體轉染試劑一度應用非常廣泛。同時，人們也一直在尋找更有效、毒性小同時對研究影響也小的轉染試劑。由於脂質類轉染試劑對細胞的毒性是由其脂質特性決定的，眾多的研究者和生物公司將新一代轉染試劑的開發聚焦在非脂質體的聚合物上，一種納米材料的聚合物已經研發出來，其原理是：分子內含有許多氨基，在生理PH下會發生質子化，這些質子化的氨基可以中和DNA質粒表面的負電荷，使DNA分子由伸展結構壓縮為體積相對較小的DNA粒子，並包裹在其中，使DNA免受核酸酶的降解。轉染復合物主要是通過細胞內吞作用將DNA轉移進入細胞，形成內含體(endosome)，DNA從內含體釋放，進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達。通過納米技術生產出的轉染試劑在納米尺度表現出結合保護DNA能力強、毒性低的獨特性能。