培養病毒的方法和技巧

Ⅰ 怎樣培養流感病毒

1 用於培養流感病毒的細胞1󰀁1 細胞株的選擇 在最初培養流感病毒的時候用雞胚,但雞胚分離流感病毒容易引起病毒便變異和過敏性反應,還存在大規模生產時外源病毒的污染問題。而運用Vero和MDCK細胞培養流感病毒不但解決了上述問題,還使得病毒的免疫原更穩定。戚鳳春[1]等人研究發現,相同的實驗條件下,在MDCK細胞上培養的病毒HA滴度明顯高於Vero細胞,因此我們培養流感病毒細胞株的選擇MDCK細胞,其代數最好小於35代,細胞過老會使病毒不容易負載。 1󰀁2 細胞最佳負載病毒的胞齡 MDCK細胞繁殖非常旺盛,必需只能提前一天將細胞培養瓶里的細胞接種在六孔板中,如果負載病毒用胞齡為兩天的MDCK細胞,那麼病毒培養的陽性率幾乎為0,而胞齡為12-24h的MDCK細胞對病毒的負載陽性率禪悶區別不大[2]。1󰀁3 細胞負載病毒的最佳密度 首先,MDCK細胞的密度不能太稀,這種細胞密度太稀則不能生長,也不能讓細胞密得堆積起來,那樣也會很大程度降 低病毒接種的陽性率。最好使細胞剛剛鋪滿孔,這時負載病毒後收獲病毒的HA滴度最高。當工作人員提前一天將細胞接種在6孔板中時,應考慮細胞的生長速度,使其第二天負載病毒時的細胞密度適當。其次,MDCK細胞接種六孔板時要密度均勻,容易出現的情況是細胞都聚集在孔的邊緣,而中間密度過稀,這樣也會影響病毒負載的陽性率。避免這種情況出現就要工作人員手法熟練,如果出現了這種情況,將培養板輕輕晃動(避免液體濺出),能有效改善細胞的分布。2 培養流感病毒的試劑 用於培養流感病毒試劑的不同也會很大程度影響病毒培養 陽性率。首先,不使用過期的試劑;其次,最好使用知名廠家的試劑,比如GIBCO等;再次,使用前將試劑從冰箱拿出一段時間,最好等試劑的溫度已經平衡到室溫再用。如果是給細胞換代,過冷的試劑會影響細胞的生長狀態;如果是負載病毒前洗細胞用,過冷的試劑會使細胞突然皺縮而病毒培養的陽性率。3 樣品 3󰀁1 樣品的存放 樣品存放的時間直接影響病毒負載的陽性率,標本越新鮮,病毒培養的陽性率越高。如果樣品不能及時負載細胞,應將樣品放在-70!冰箱中,避免反復凍融,凍融次數越多,病毒培養的陽性率越低。注意不能將樣品放在-20!的冰箱中,流感病毒在-20!非常不穩定,如果當天的樣本要第二天才能接種,應將樣品放在4!冰箱中。3󰀁2 樣品的無菌處理 因為樣品的采樣條件不可能無菌,雖然采樣液中有抗生素,也不能保證細菌全被殺死,所以陽性樣本最好過濾到無菌的1󰀁5ml離心管中備用。有些工作人員採用往細胞培養板中加抗生素避免污染,這樣雖然省事,但會對細胞有傷害,從而降低了病毒培養的陽性率。4 病毒負載的操作步驟4󰀁1 細胞洗滌 將六孔板中的細賀純彎胞培養液倒去,用HBSS洗滌每一孔三遍以上,其作用是洗去殘留的FBS,FBS通過抑制胰酶而抑制流感病毒的復制。將洗液倒去後,應立即加入洗液或病毒液,過長時間將細胞暴露在空氣中將很大程度降低病毒培養的陽性率,最好將細胞暴露在空氣中的時間縮短在5秒以內。4󰀁2 病毒液的接種量 病毒液的接種很有講究。負載在細胞上的病毒液應大於300u,l否則不夠蓋過整孔細胞。待37!孵育1~2h後,不管開始負載了多少體積的病毒液,都應在每孔留300ul病毒液再加入病毒培養基,若病毒液全都棄去或留得太少,會使病毒培養陽性率大打折扣;若病毒液留得太多,比如超過400u,l也會使陽性率降低很多,因為存留過多的缺損病毒會嚴重影響正常病毒的復制。4󰀁3 病毒液的孵育時間 理論上,病毒液在37!孵育1~2h都可以,但我們發現1h還是太短,最好在1h15min加入病毒培養基,不要時間過長,那樣也會使病毒培養的陽性率降低,可能是因為采樣液的pH值和病毒培養基不同,孵育時間稍長導致細胞受到損傷。而盲傳的時候,孵育的時間可以到2h以上,因為這時候所用的病毒液也是病毒培養基,而不是采樣液。4󰀁4 病毒培養基的配製 病毒培養基是用DMEM加入HEPES和胰酶配製而成的,HEPES的作用是加強體系的緩沖能力,胰酶的作用是將病毒粒非裂解型的HA0變成裂解型的HA1+HA2,從而提高流感病毒在細胞中的復制能力,因為流感病毒只有血凝素(H)是裂解型的才具有感染性。但是褲緩HEPES和胰酶在DMEM在4!共存時間過長會引起pH值上升,所以病毒培養基我們一般都是現配現用。 4󰀁5 病毒HA滴度的測定 CPE出現時間隨病毒的型別和毒株的差異以及感染量的大 小而異。我們將標本接種後3d觀察是否出現CPE,出現CPE的測定HA滴度,滴度大於8則收獲病毒,用HI實驗測定病毒亞型,病毒滴度小於8進行盲傳,再在第3d測定HA滴度。若負載病毒7d還不出現CPE,維持液中又查不出HA活性,可認為陰性標本,棄之。3d時間出現病毒滴度的 最高峰, 4d和2d都低於3d時病毒的滴度。收獲毒株前,將 細胞於-80!/37!凍融一次,有利於增加病毒的HA滴度。

Ⅱ 病毒學研究的基本方法有哪些

（一）生物學特性測定：在寄住上的反應——症狀、傳播等；
（二）病毒分離與培養：提純與純化，二元培養法；
（三）光鏡與電鏡觀察：病毒粒子和病毒與相應抗血清的特異性免疫吸附情況；
（四）免疫學技術：以血清學和組織免疫化學方法檢測材料帶毒情況，多克隆抗體，單克隆抗體；
（五）分子生物學技術：核酸分子雜交，PCR等。

Ⅲ 怎麼培養病毒和疫苗

疫苗現在有滅活疫苗，減毒活疫苗，基因工程疫苗等等，和病毒培養有直接關系的，就是滅活疫苗，減毒疫苗。病毒培養一般都有最適培養條件，不同病毒適合在不同的細胞上生長。例如狂犬病疫苗，可以將弱化的狂犬病毒在BHK21、VERO細胞上培養，首先把細胞培養好，然後接入病毒，當病毒達到最高滴度時，將病毒滅活後純化就是滅活疫苗。直接凍干後 就是減毒活疫苗。

Ⅳ 培養流感病毒的方法有哪幾種

雞胚傳代培養、MDCK細胞培養、本動物回歸培養。

Ⅳ 目前最常用的培養病毒的方法是哪種

1.動物接種
這是最原始的病毒培養方法。常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接種的途徑有鼻內、皮下、皮內、腦內、腹腔內、靜脈等。根據病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位。
2.雞胚接種雞胚對多種病毒敏感。根據病毒種類不同，可將標本接種於雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜上。
3.組織培養
將離體活組織塊或分散的活細胞加以培養，統稱為組織培養。組織培養法有三種基本類型：器官培養、移植培養和細胞培養。細胞培養最常用於培養病毒，根據細胞的來源，染色體特性及傳代次數又可分為下列類型：原代和次代細胞培養，二倍體細胞株和傳代細胞系。

Ⅵ 病毒的培養方法有哪幾種

(1)動物接種：頃褲按病毒種類不同，選擇易感動物並接種於恰當的部位雀備簡。
(2)雞胚培滾帶養：一般採用孵化9～14天雞胚，按病毒種類不同接種於雞胚的不同部位。
(3)組織細胞培養：將病毒接種於離體的組織塊或單個的細胞內培養

Ⅶ 目前病毒分離培養最常用的方法是

一般來說病毒培養的方法有三種 一是動物接種 常用的動物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔和猴等，接種的途徑有鼻內、皮下、皮內、腦內、腹腔內、靜脈等。根據病毒種類不同，選擇敏感動物及適宜接種部位。二是雞胚接種 雞胚對多種病毒敏感。根據病毒種類不同，可將標本接種於雞胚的羊膜腔、尿囊腔、卵黃囊或絨毛尿囊膜。第三是組織培養 將離體活組織塊或分散的活細胞加以培養，統稱為組織培養。組織培養法有三種基本類型：器官培養、移植培養和細胞培養。細胞培養最常用於培養病毒，根據細胞的來源，染色體特性及傳代次數又可分為下列類型：原代和次代細胞培養，二倍體細胞株和傳代細胞系。 最常用的應該是細胞培養。

Ⅷ 細菌和病毒的培養方法

1繁殖方式:前者復制,後者二分裂；生活方式:前者寄生,離開宿主細胞無法生活,且對宿主有害,後者可寄生,腐生或自生,寄生時可能對寄主有益也可能有害；結構:前者無細胞結構,後者有；遺傳物質:前者是DNA或RNA,後者只有DNA；變異速度:前者特別是RNA病毒變異速度極快,後者較為緩慢,突變率低.2培養基製作過程較繁瑣,自己找相關資料.3病毒利用特異性的宿主,培養基中營養條件取決於宿主,細菌利用特異性的培養基,營養條件取決於自身.4.同2.5.寄主是否有相應的抗原；環境條件是否適宜；是否有一定的群體使大量細胞死亡,從而使器官失去相應功能.6外毒素:由細菌所分泌、能在局部及全身產生毒性效應的蛋白質成分.
內毒素:只在細菌被破壞時才被釋放的細菌毒素.
類毒素:由於變性或化學修飾而失去毒性的毒素,但仍保留其抗原性.
7.特異性的培養基分別篩選,不同菌種有不同的鑒定方法

Ⅸ 病毒的培養方法有哪些為什麼不能用一般培養基來培養病毒

適齡雞胎接種，傳代培養，組織細胞培養，易感動物接種。不可以。病毒是寄生在活體上的生物，而培養基是沒有生命的有機物或無機物，病毒在上面不能生存。
病毒的結構是有一個DNA，和蛋白質外殼，和其它功能性的附屬結構。
病毒不能自己生產蛋白質，它只有在寄生在活體上之後，把自己的DNA，注入到寄主細胞內，和寄主DNA結合，然後表達，利用寄主的蛋白質、DNA的和成功能，和成自己的蛋白質外殼，DNA，然後這些DNA和外殼在及主細胞破裂之後溢出，重新組合成好多病毒，感染其它細胞或寄主。 可以看出，這個細胞必須有生命（新陳代謝，能合成蛋白質DNA等），培養基是不行的。

Ⅹ 病毒的人工培養方法

病毒研究的發展常常與病毒培養和檢測方法的進步有密切的關系，特別在脊椎動物病毒方面，小鼠和雞胚接種、組織培養、超速離心、凝膠電泳、電子顯微鏡和免疫測定等技術，對病毒學的發展具有深刻的影響。

噬菌體的培養和檢測方法最為簡單。將噬菌體接種到易感細菌的肉湯培養物中，經18～24小時後，混濁的培養物重新透明，此時細菌被裂解，大量噬菌體被釋放到肉湯中，再經除菌過濾，即為粗製噬菌體。為了測定其中噬菌體的數量，將粗製噬菌體稀釋到每一接種量含100個左右，與過量的細菌混合，然後鋪種於瓊脂平皿上，在溫箱中培養過夜，細菌繁殖成乳白色襯底，被噬菌體裂解的區域則在此襯底上表現為圓形的透明斑，稱為噬斑。噬斑數代表該接種量中有活力的噬菌體數量。如果挑出單個噬斑來培養，就能獲得由單個噬菌體所繁殖的後代，達到分離純化的目的。

動物病毒（見脊椎動物病毒）的培養可在自然宿主、實驗動物、雞胚或細胞培養中進行，以死亡、發病或病變等作為病毒繁殖的直接指標，或以血細胞凝集、抗原測定等作為間接指標。收獲發病動物的組織磨成懸液或有病變的細胞培養液，即為粗製病毒。測定活病毒數量可採用空斑法，其原理與噬斑法相同，但以易感的動物單層細胞代替細菌，在接種適當稀釋的病毒後，用含有培養液和中性紅的瓊脂覆蓋，使病毒感染局限在小面積內形成病變區，襯底的健康細胞被中性紅染成紅色，病變區不染色而顯示為空斑。

至今植物病毒的培養和檢測大都是在整株植物上進行的。從搗碎的病葉汁中制備病毒，常用枯斑法檢測。用手指蘸上混有金剛砂的稀釋病毒在植物葉片上軒輕摩擦，經一定時間後出現單個分開的圓形壞死或退綠斑點，稱為枯斑。

除了利用病毒的致病性定量檢測病毒外，還可應用物理方法，如在電子顯微鏡下計數病毒顆粒，或用紫外分光光度計測定提純病毒的蛋白和核酸量，這些方法所測得的數據包括了有感染性和無感染性的病毒粒。

應用電子顯微鏡不但能看清病毒粒的大小、形態，還可以分辨其表面的蛋白亞單位和內部的核殼等超微結構。