pcr片段連接方法

⑴ PCR產物可以直接用於連接嗎

標準的DNA片段與載體連接就是通過PCR的電泳回收膠進行，你說連接失敗，給你三個可能的原因和對應的解決辦法，供你參考，第一，PCR電泳膠回收率最好的才達到80%，所以你可能回收的時候由於量太少，連接失敗，對應的解決辦法就是你多做幾管PCR，比如10管，然後把10個電泳結果統一回收後放入一個1.5mlEP管內，提高量來解決；第二，你的載體是否切開，很多時候如果你的載體如果由於酶失效，識別位點不對等原因，根本沒被酶切開，你怎麼插入呢，對應的解決辦法就是，證實一下你的酶切是否成功，沒成功就考慮換酶，驗證方法是，酶切後用進行電泳，陽性參照就是酶切前的質粒額，切開的載體會跑的最快；第三，鏈接酶之類的如果出現問題，或者某些環節出現錯誤，你的目的片段與載體沒有鏈接上，那麼你還是無法實現表達，給你對應的檢測辦法是，用你的引物擴增連接完的目的片段，同時鏈接目的片段之前的質粒做陰性對照，如果發現鏈接目的片段的質粒無法通過PCR得到你的目的片段，那麼就是說鏈接酶可能出現錯誤。

⑵ 通過PCR方法如何連接兩個基因

看你的要求。
1樓那位同學的回答沒有問題，通過在引物上設計酶切位點，做酶切、連接即可以連接兩端基因。
但如果你的這兩段基因不好設計酶切位點，或者你不希望在這兩段基因之間存在有其餘的多餘鹼基，而且你又特別強調用PCR的方法去做連接，那麼我推薦overlap-PCR。把A基因3'端的序列加到擴增B基因的上游引物5'端，把B基因5'端的序列加到擴增A基因的下游引物的3'端。分別擴增A、B兩基因，這樣A的3』端和B的5『端就形成了互補。切膠回收這兩個PCR產物，稀釋並混合，以此為模板，以A基因的上游引物和B基因的下游引物為引物對，擴增。這樣就可以得到AB拼接到一起的產物。
具體的引物設計要求你可以多去看看overlap-PCR的文獻，這種方法很方便的。

⑶ 如何通過pcr將兩段已知序列鏈接到一塊，成為一條片段

融合PCR可以將兩端序列拼在一起，融合PCR技術（fusion PCR）採用具有互補末端的引物，形成具有重疊鏈的PCR產物，通過PCR產物重疊鏈的延伸，從而將不同來源的任意DNA片段連接起來，此技術在不需要內切酶消化和連接酶處理的條件下實現DNA片段的體外連接，為同源重組片段的構建提供了快速簡捷的途徑。第二個問題就設計引物，將你需要的片段分別PCR下來，在通過融合PCR連成一條就可以了

⑷ 普通PCR、原位PCR、反向PCR和反轉錄PCR的 基本原理和操作步驟（一）

1概述

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)，簡稱 PCR ，是一種 分子生物學 技術，用於放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA復制。 DNA聚合酶 （DNA polymerase I）最早於1955年發現，而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是於70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發現，但由於此酶不耐高溫，高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是於1976年從溫泉中的細菌（Thermus aquaticus）分離出來的。它的特性就在於能耐高溫，是一個很理想的酶，但它被廣泛運用則於80年代之後。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是於1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現今所發展出來的PCR則於1983由 Dr. Kary B. Mullis發展出的，Dr. Mullis當年服務於PE公司，因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 並於1985年與Saiki 等人正式發表了第一篇相關的論文。此後，PCR的運用一日千里，相關的論文發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨後PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年 諾貝爾 化學獎。

2 PCR原理

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按鹼基互補配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留復制鏈」，而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2～4分鍾，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

3 PCR反應體系與反應條件

3.1標準的PCR反應體系

10×擴增緩沖液 10μl
4種dNTP混合物 200μl
引物 10～100μl
模板DNA 0.1～2μg
Taq DNA聚合酶 2.5 μl
Mg2+ 1.5mmol/L
加雙或三蒸水 100 μl

3.2 PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA片段，細胞內DNA復制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+)。［PCR步驟］

標準的PCR過程分為三步：

1.DNA變性（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下， 氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2. 退火 （25℃-65℃）：系統溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸（70℃-75℃）：在 Taq酶 （在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行，以減少一次升降溫過程，提高了反應速度。

4 PCR反應特點

4.1特異性強

PCR反應的特異性決定因素為：

①引物與模板DNA特異正確的結合；

②鹼基配對原則；

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性；

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性，使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區，其特異性程度就更高。

4.2靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的，能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位)；在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

4.3簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應液加好後，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應，一般在2～4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

4.4對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞，DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

5 PCR常見問題

5.1假陰性，不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板 ：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活 ：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物 ：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度 ：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變 ：通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多 大體積進行PCR擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

物理原因 ：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異 ：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

5.2假陽性

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補後，可擴增出PCR產物，而導致假陽性的產生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

5.3出現非特異性擴增帶

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次 數。適當提高退火溫度或採用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

5.4出現片狀拖帶或塗抹帶

PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環次數過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃 度。④增加模板量，減少循環次數。

⑸ 菌落PCR的具體方法

1、菌落PCR混合液（通俗稱為pcr mix）的制備
Taq buffer（10×） 180ul
dNTP（2.5 mM） 20～25 ul
Primer Forward（引物濃度在10Pmol） 5 ul
Primer Reverse（引物濃度在10Pmol） 5 ul
ddH2O 720 ul
Taq（2U/ul） 12～15 ul
2、常溫下隨機挑選平板內的單一菌落，用滅菌的牙簽或槍頭挑取單一菌落（強調單一，不能是雙克隆），在LB瓊脂糖平板上輕點，做一拷貝；然後將沾有菌體的牙簽或槍頭置於相應的PCR8聯管中或者96孔pcr反應板中（96孔反應板和挑選的菌落做好記號，如平板上點的是1#，2#，3#……則96空反應板也相應標1#，2#，3#……以便篩選到克隆後的擴大培養），再將挑取的96個單一菌落轉移到48孔板培養基中培養，挑好單克隆菌落轉移之後，由於96孔反應板內沾有挑選的菌落，可以用相應的通用引物和之前配製好的PCR混合液混合好之後加入到96孔反應板內。
3、將混有菌體的PCR混合物置於PCR儀中，按常規條件擴增。
4、在擴增出來的反應液中加入溴酚藍或是其他染料，電泳檢測是否得到目的片斷。如有則為陽性克隆。
5、將已經篩選到的陽性克隆對應96孔反應板上的菌株挑選出來，37度繼續培養達到一定時間可以抽提質粒，測序驗證是否是需要的目的基因
注意事項：設計引物很關鍵。一般如果是定向克隆，用載體上的通用引物即可；如pET系列可用T7通用引物。如果是非定向克隆（如單酶切或平末端連接），一條引物用載體，一條引物用目的基因上的，這樣就可以比較方便的鑒定了，而且錯誤概率很低。PCR條件的選擇接近最佳，同時挑取的菌體不宜太多，否則會有非特異性擴增。
使用的引物濃度不能太高，濃度過高會導致非特異性擴增，反應的循環數也不能太多，一般不超過25個。同時因為擴增的片段的GC含量問題，有的GC含量很低，有的又很高，導致菌落PCR不容易擴增出目的條帶，在此建議在設置PCR程序時以高GC的溫度為上限，每一循環降0.2度左右。
48孔板 96孔反應板

⑹ 基因克隆的方法主要有哪幾種，簡述各種方法的原理和用途

基因克隆的方法主要有哪幾種
選擇目的基因,並設計相應引物；
用引物PCR擴增目的基因片段；
選擇合適（抗性標記、酶切位點等）的克隆載體（為了保真擴增）,並將PCR片段連接入克隆載體中；（一般用Taq酶的PCR產物在末尾會自帶一個A,可在Solution 1作用下與兩端各帶一個T的線性T載體直接相連）
將連接產物轉化入感受態大腸桿菌,使之在含有抗生素的培養基上生長擴增；
從大腸桿菌中提取質粒（即前面的連接產物）,酶切鑒定和測序鑒定均無誤後將目的基因片段切下並與新的表達載體連接,然後再次轉化入大腸桿菌中擴增,再提質粒,即得到想要的目的基因片段克隆.

⑺ 基因克隆的基本步驟有哪些

基因克隆的基本步驟流程如下：

一、目的DNA片段的獲得：

DNA克隆的第一步是獲得包含目的基因在內的一群DNA分子，這些DNA分子或來自於目的生物基因組DNA或來自目的細胞mRNA逆轉錄合成的雙鏈 cDNA分子。

由於基因組DNA較大，不利於克隆，因此有必要將其處理成適合克隆的DNA小片段，常用的方法有機械切割和核酸限制性內切酶消化。若是基因序列已知而且比較小就可用人工化學直接合成。如果基因的兩端部分序列已知，根據已知序列設計引物，從基因組DNA 或cDNA中通過PCR技術可以獲得目的基因。

二、載體的選擇：

基因克隆常用的載體有：質粒載體、噬菌體載體、柯斯質粒載體、單鏈DNA噬菌體載體、噬粒載體及酵母人工染色體等。從總體上講，根據載體的使用目的，載體可以分為克隆載體、表達載體、測序載體、穿梭載體等。

三、體外重組：

體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。大多數核酸限制性內切酶能夠切割DNA分子形成有黏性末端，用同一種酶或同尾酶切割適當載體的多克隆位點便可獲得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通過T4 DNA連接酶的作用便可形成重組體，此為黏末端連接。

當目的DNA片斷為平端，可以直接與帶有平端載體相連，此為平末端連接，但連接效率比黏端相連差些。有時為了不同的克隆目的，如將平端DNA分子插入到帶有黏末端的表達載體實現表達時，則要將平端DNA分子通過一些修飾；

如同聚物加尾，加銜接物或人工接頭，PCR法引入酶切位點等，可以獲得相應的黏末端，然後進行連接，此為修飾黏末端連接。

四、導入受體細胞：

載體DNA分子上具有能被原核宿主細胞識別的復制起始位點，因此可以在原核細胞如大腸桿菌中復制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。

五、重組子的篩選：

從不同的重組DNA分子獲得的轉化子中鑒定出含有目的基因的轉化子即陽性克隆的過程就是篩選。發展起來的成熟篩選方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位於篩選標記基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位點後，會造成標記基因失活，表現出轉化子相應的抗生素抗性消失或轉化子顏色改變，通過這些可以初步鑒定出轉化子是重組子或非重組子。常用的是β-半乳糖苷酶顯色法即藍白篩選法（白色菌落是重組質粒）。

（2）PCR篩選和限制酶酶切法：提取轉化子中的重組DNA分子作模板，根據目的基因已知的兩端序列設計特異引物，通過PCR技術篩選陽性克隆。PCR法篩選出的陽性克隆，用限制性內切酶酶切法進一步鑒定插入片段的大小。

（3）核酸分子雜交法：制備目的基因特異的核酸探針，通過核酸分子雜交法從眾多的轉化子中篩選目的克隆。目的基因特異的核酸探針可以是已獲得的部分目的基因片段,或目的基因表達蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物種的同源基因。

（4）免疫學篩選法：獲得目的基因表達的蛋白抗體，就可以採用免疫學篩選法獲得目的基因克隆。這些抗體即可是從生物本身純化出目的基因表達蛋白抗體，也可從目的基因部分ORF片段克隆在表達載體中獲得表達蛋白的抗體。

(7)pcr片段連接方法擴展閱讀：

基因克隆的注意事項：

1、平端連接：DNA連接酶可催化相同和不同限制性核酸內切酶切割的平端之間的連接。原則上講，限制酶切割DNA後產生的平端也屬配伍末端，可彼此相互連接；若產生的粘性末端經特殊酶處理，使單鏈突出處被補齊或削平，變為平端，也可實行平端連接。

2、加尾連接：同聚物加尾連接是利用同聚物序列，如多聚A與多聚T之間的退火作用完成連接。在末端轉移酶作用下，在DNA片段端製造出粘性末端，而後進行粘性末端連接。這是一種人工提高連接效率的方法，也屬於粘性末端連接的一種特殊形式。

3、人工接頭連接：對平端DNA片段或載體DNA，可在連接前將磷酸化的接頭(linker)或適當分子連到平端，使產生新的限制性內切酶位點。再用識別新位點的限制性內切酶切除接頭的遠端，產生粘性末端。

⑻ 現在有哪幾種PCR的方法啊

Qβ復制酶反應

Kacian等於1972年首次報報Qβ復制酶催化RNA模板的自我復制功能，它能在常溫30min，將其天然MDV擴增至109.1986年Chu等報道用生物標記的靶序列特異性探針，可與親和素聯接的MDV雜交，經洗脫未被結合的MDV後，再加入Qβ復制酶，擴增復制MDV拷貝，然後用溴乙錠染色檢測或用同源性的第二探針雜交.

Qβ復制酶是一種RNA指導的RNA聚合酶，它有3個特點:①不需寡核苷酸引物的引導就可啟動RNA的合成.②能特異地識別RNA基因中由於分子內鹼基配對而形成的特有的RNA折疊結構.③在Qβ復制酶的天然模板MDV的非折疊結構區插入一短的核酸序列不影響該酶的復制.因而，如在此區插入核酸探針，則其序列照樣可能被Qβ復制酶擴增.

1988年Lizardi等，將靶基因序列插進MDV質粒里，用T7RNA聚合酶催化轉錄出MDV探針，這種RNA探針可與靶序列雜交，然後洗去非雜交的探針，加入Qβ復制酶來擴增探針，被擴增的探針又可作為模板進行擴增，並呈指數遞增.其產物按上述兩種方法進行檢測.現在該技術又發展了夾心雜交法，分子開關和靶依賴的復制等技術.
其擴增狀況，此法可用來檢測基因的突變，染色體重排或轉位，基因缺失及微生物的型別鑒定等.
反向PCR
反向PCR是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的未知序列的片段，而常規PCR擴增的是已知序列的兩引物之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切，然後用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接，再用一對反向的引物進行PCR，其擴增產物將含有兩引物外未知序列，從而對未知序進行分析研究.
不對稱PCR
不對稱PCR是用不等量的一對引物，PCR擴增後產生大量的單鏈DNA這對引物分別稱為非限制引物與限制性引物，其比例一般為50～100∶1.在PCR反應的最初10～15個循環中，其擴增產物主要是雙鏈DNA，但當限制性引物低濃度引物消耗完後，非限制性引物高濃度引物引導的PCR就會產生大量的單鏈DNA.不對稱PCR的關鍵是控制限制性引物的絕對量，需多次摸索優化兩條引物的比例.還有一種方法是先用等濃度的引物PCR擴增，制備雙鍵DNA，然後以此dsDNA為模板，再以其中的一條引物進行第二次PCR，制備ssDNA.不對稱PCR制備的ssDNA，主要用於核酸序列測定.
重組PCR
使兩個不相鄰的DNA片段重組在一起的PCR稱為重組PCR，1986年報道了由PCR擴增的兩個DNA片段通過重組合後再經延伸而制備出新的DNA分子.其基本原理為將突變鹼基，插入或缺失片段，或一種物質的幾個基因片段均設計在引物中，先分段對模板擴增，除去多餘的引物後，將產物混合，再用一對引物對其進行PCR擴增.其產物將是一重組合的DNA.重組PCR主要用於位點專一鹼基置換，DNA片段的插入或缺失DNA片段的連接(如基因工程抗體
多重PCR
一般PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用於單一致病因子等的鑒定.多重PCR，又稱多重引物PCR或復合PCR，它是在同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其反應原理，反應試劑和操作過程與一般PCR相同.
免疫PCR
免疫試驗的主要步驟有三個:①抗原抗體反應，②與嵌合連接分子結合，③PCR擴增嵌合連接分子中的DNA一般為質粒DNA該技術的關鍵環節是嵌合連接分子的制備.在免疫-PCR中，嵌合連接分子起著橋梁作用，它有兩個結合位點，一個與抗原抗體復合物中的抗體結合，一個與質粒DNA結合，其基本原理與ELISA和免疫酶染色相似，不同之處在於其中的標記物不是酶而是質粒DNA，在操作反應中形成抗原抗體-連接分子復合物，通過PCR擴增DNA來判斷是否存在特異性抗原.
免疫PCR優點為:①特異性較強，因為它建立在抗原抗體特異性反應的基礎上.②敏感度高，PCR具有驚人的擴增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用於單個抗原的檢測.③操作簡便，PCR擴增質粒DNA比擴增靶基因容易得多，一般實驗室均能進行.
☆ PCR用於進化分析
進化遺傳學具有兩個並列的研究方向：系統發育的重建和種群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling提出蛋白質序列和基因序列的比較可以象分子種一樣用於標志現存物種分化的時間以來，各種生化方法被用於系統發育的研究。在最初二十年內，同功酶的電泳分析、免疫學比較和蛋白質序列分析被廣泛地應用。而最近，DNA雜交和核糖體RNA序列分析為分類學做出了重要貢獻。這些技術大多有局限性，因為它們是估計而不是直接測量序列的差別。
☆ 反向聚合酶鏈反應
通常測定一個與已知序列相鄰的DNA序列是必要的，例如位於編碼DNA的上游和下游兩 側的區域，轉位因子的插入位點以及克隆於Lambda、科期粒或酵母人工染色體載體上 的DNA片段末段的未知序列的探針等。這種末端特異探針在Southern Blot或染色體要得到邊側序列的探針一般需要進行一系列費時、費力的工作，首先用內切酶裂解和 用已知邊側序列的探針Southern雜交以確定大小適合於克隆的末端片段;這些片段還 要經過凝膠分離、克隆，得到的物質再與已知邊側區域雜交以確定合適的克隆子。要 測定未吞邊側區序列時，通常需要從克隆中進行各種片段的亞克隆。
為避免這些步驟，我們採用擴展的PCR方法，使相鄰邊側區域得以擴增。典型的PCR擴增使用與互補鏈雜交的寡聚核苷酸引物。引物是定向的，使延伸向內跨過兩個引物之間的區域。一個引物的DNA合成產物作為另一個引物的模板，進行DNA變性、引物退 火，DNA聚合酶管伸反應的多次重復性循環，可使引物規定區域的拷貝數成指數增 加。但用傳統PCR方法得不到緊鄰引物外側的DNA序列，因為寡聚核苷酸所引導的既有 目的DNA又有引物外側區的DNA合成在拷貝過程中只呈線性增長，這種線性增長是因 為，對於每種引物來講，其不能引導DNA反向合成幾乎是同時，有三個實驗室分別設計出一種方法，使PCR可以擴增邊側區域。該方法反向PCR的基本點是用適當內切酶裂解核心區外分子，使這些酶切片段自身連接形成環狀分子，從而將邊側區域轉化為內部區域。
反向PCR程序
用傳統的緩沖液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定，目前，PCR擴增的實際上限為3kb。在許多情況下，首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適於環化及反向PCR的片段的末端片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引物所定模板依賴於引物的上游或上游區，而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增，並帶有由內切酶和環化類 型決定的接點例如，互補突頭連接與鈍頭連接。對於擴增左翼或右翼序列，初試時 最好靠近識別上個鹼基位位的酶，並已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針，建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。
用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中，為產生對反向PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶，但這樣所產生的片段末端則不適於連接，環 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理鈍化。連接前，需用酚或熱變性使內切 酶失活。在我們實驗中，不必裂解環狀分子核心區也可得到有效的PCR擴增。這顯然不同於Silver和Keerikatter[7]的實驗結果，他們報道在核心裂解使模板線性化後，PCR擴增率增加100倍，但Triglia等則發現裂解環狀分子與加熱引起隨機缺口效果相同。
反向PCR的應用
反向PCR的應用已經證明該方法可以避免不方便的克隆和亞克隆步驟，因此可解決大 量問題。我們最初用反向PCR擴增E.coli天然分離物中轉位插入序 列ISL的邊側序列;Triglia等將反向PCR用於編碼瘧原蟲主裂殖子表面抗原前體的基因，在實驗中，他們用RsaⅠ酶裂解基因組DNA，連接，得到的環再用HinfⅠ在內部位點酶切，然後進行擴增，得到預期的297bp大小的片段，並用DNA直接測序進行鑒定。他們認為反向PCR由於具有從全長cDNA得到序列信息的優 點，將對步查現轉錄基因的5端或3端的邊側區域有用。
反向PCR的另一個應用是Silver和Keerikatte進行的。他們將其應用於擴增拉於整合在小鼠細胞中的外生原病毒DNA邊側的細胞DNA。除強調反向PCR在染色體「步查」 或「跳查」中的用途，他們還指出，該技術用於擴增特徵性弱的序列，這 些序列在E.Coli或其他宿主載體系統中很騅或不能克隆。

⑼ PCR產物片段鏈接到T載體上後,PCR片段是否會出現兩種連接方向

PCR產物片段鏈接到T載體上後，PCR片段是會出現兩種連接方向。

如果用1%的瓊脂糖電泳30min，主帶（超螺旋的閉環質粒dna）會在3kb-2kbmarker之間，如果是單酶切產物，則應該在3.5kb的marker附近。要連接到載體上，形成帶有PCR目標片段的質粒，將這個質粒導入受體菌，才能檢測這個片段的活性、作用等等。

摘要

從固體平板挑取轉化帶有目的基因的單菌落，用特異引物通過聚合酶鏈式反應可直接擴增和標記目的基因，不需經過菌的液體培養、質粒提取和酶解反應等復雜過程，能快速獲得目的基因擴增產物和進行目的基因探針的標記。

探針是核酸分子雜交及分子標記研究進行的必要前提，在Southern blot、Northern blot、ALFP、 RFLP、RAPD、SSR等技術中得到了廣泛應用，在分子生物學的研究中充分發揮著作用，尤其對核酸分子操作具有十分重要的意義。

⑽ 你好;我有兩個片段，想先連接後在做pcr,可是一直擴不出來，你可以告訴我一下步驟嗎謝謝!

你這兩個片段是通過T4鏈接酶接的嗎 連接完之後，是否跑電泳了呢
確定接上了嗎

如果接上了，不應該PCR不出來啊