如何利用熒光素酶報告基因方法

⑴ 熒光素酶報告基因的應用原理

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。
其原理簡述如下：
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

⑵ 利用熒光素酶報告系統驗證某目標基因後，能夠證明是直接調控作用嗎

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。
其原理簡述如下：
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。
（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。
（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

⑶ 哪位同學可以介紹下Luciferase原理

自然界中廣泛分布著生物發光有機體,其中包括細菌、真菌、魚、昆蟲等.在這些生物發光有機體中催化生物發光反應的各種酶都稱之為熒光素酶（Luciferases）,底物則命名為熒光素（Luciferin）.自1986— 1987 年首次被當作報告基因使用以來,熒光素酶基因已成為目前運用最廣泛的報告基因之一.盡管來自不同物種的熒光素酶及底物存在有很大的差異,但有一個共同點,即在生物發光反應體系中均需發生氧化反應.它通過兩個步驟使底物熒光素發生氧化作用,而產生發光反應,此反應是ATP 依賴性的.雜環熒光素首先腺苷化,然後通過氧化脫羧作用,產生AMP、CO2,並通過激活的熒光素中間產物發射光.
將反應所需的試劑與含有熒光素酶的細胞裂解液混合即會產生一種迅速衰減（在一秒鍾內）的黃綠色閃光（發射峰560 nm）,這種光信號可用配備了便於迅速混合反應物的自動注射裝置的熒光檢測儀（Luminometer）進行檢測,也可用標準的液閃儀對光信號進行記錄.當底物過量時,發光量的總值與樣品的熒光酶活性成正比,因此,可對熒光素酶報告基因的轉錄進行間接估計.熒光素酶易被蛋白酶降解,在轉染的哺乳動物細胞中的半衰期約為3 小時.熒光素酶報告系統為啟動子活性的檢測提供了一個敏感、快速、非放射性的檢測方法.
熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Luciferase Reporter Gene Assay Kit),是以熒光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase).熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的過程中,會發出生物熒光(bioluminescence).然後可以通過熒光測定儀也稱化學發光儀(luminometer)或液閃測定儀測定luciferin氧化過程中釋放的生物熒光.
通過熒光素和熒光素酶這一生物發光體系,可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達.通常把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在luciferase的上游或其他適當的地方,構建成報告基因質粒.然後轉染細胞,適當刺激或處理後裂解細胞,測定熒光素酶活性.通過熒光素酶活性的高低判斷刺激前後或不同刺激對感興趣的調控元件的影響.

⑷ 熒光素酶報告基因的應用原理

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。熒光素酶報告基因實驗（luciferase
assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。
其原理簡述如下：
（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。
（2）
將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。
（3）
加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

⑸ 雙熒光素酶實驗原理是什麼

雙熒光素酶實驗原理：

利用熒光素酶與底物結合發生化學發光反應的特點，把感興趣的基因轉錄的調控元件克隆在螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）的上游，構建成熒光素酶報告質粒。

然後轉染細胞，適當刺激或處理後裂解細胞，測定熒光素酶活性。通過熒光素酶活性的高低判斷性刺前後或不同刺激對感興趣的調控元件的影響。

同時，為了減少內在的變化因素對實驗准確性的影響，將帶有海腎熒光素酶基因（Rinilla luciferase)的質粒作為對照質粒與報告基因質粒共轉染細胞，提供轉錄活力的內對照，使測試結果不受實驗條件變化的干擾。

熒光素酶報告基因是指以熒光素（luciferin)為底物來檢測螢火蟲熒光素酶（fireflyluciferase)活性的一種報告系統。熒光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物熒光（bioluminescence)。

⑹ 熒光素酶報告基因的應用原理

應用原理

轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式作用元件，轉錄因子的DNA結合域和順式作用元件實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。

熒光素酶報告基因實驗（luciferase assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段。

其原理簡述如下：

（1）構建一個將靶啟動子的特定片段插入到熒光素酶表達序列前方的報告基因質粒，如pGL3-basic等。

（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染293細胞或其它相關的細胞系。如果此轉錄因子能夠激活靶啟動子，則熒光素酶基因就會表達，熒光素酶的表達量與轉錄因子的作用強度成正比。

（3） 加入特定的熒光素酶底物，熒光素酶與底物反應，產生熒光，通過檢測熒光的強度可以測定熒光素酶的活性，從而判斷轉錄因子是否能與此靶啟動子片段有作用。

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應用

植物基因工程

在植物基因工程研究領域，已使用的報告基因有以下幾種：胭脂鹼合成酶基因（nos）、章魚鹼合成酶基因（ocs）、新黴素磷酸轉移酶基因（nptⅡ）、氯黴素乙醯轉移酶基因（cat）、慶大黴素轉移酶基因、葡萄糖苷酶基因、熒光酶基因等。

nos、ocs這兩個基因是致瘤土壤農桿菌（Agrobacterium tumfaciens）的Ti質粒特有的，對Ti質粒進行改造，用相應的致瘤農桿菌轉化植物體時，如果外源基因轉入植物體中，則這兩種報告基因在植物根莖葉中均能表達，不受發育調控，檢測時直接用轉化體提取液進行紙電泳，染色後在紫外光下觀察熒光即可。

nptⅡ、cat及慶大黴素轉移酶基因，均為抗生素篩選基因，相關的酶可以對底物進行修飾（磷酸化、乙醯化等），從而使這些抗生素失去對植物生長的抑製作用，使得含有這些抗性基因的轉化體能在含這些抗生素的篩選培養基上正常生長，也可以用轉化體提取液體，外用同位素標記，放射自顯影篩選轉化體。

常用的一種報告基因是β-D-葡萄糖苷酶基因，該酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物體中幾乎無背景，組織化學檢測很穩定，可用分光光譜、熒光等進行檢測。

熒光酶基因（luc）是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2+、O2和熒光素存在下發出熒光，這樣就可用轉基因植物整株或部分直接用X-光片或專門儀器進行檢測。

動物基因工程

在動物基因表達調控的研究中，報告基因也被廣泛應用。常用的有氯黴素乙醯轉移酶基因（cat）、β-半乳糖苷酶基因（LacZ）、二氫葉酸還原酶基因、熒光酶基因等。

cat基因作為報告基因，檢測時可通過放射自顯影觀察。熒光酶基因作為報告基因，具有檢測速度快、靈敏度比cat基因高30～1000倍、費用低、不需使用放射性同位素等優點，得到了廣泛的採用。

檢測因子作用

可通過報告基因的表達，研究蛋白質與蛋白質之間的相互作用。雙雜交體系是由報告基因轉錄調控區、報告基因及一對可以相互作用的雜合反式作用因子組成。

來從上述雜交體系中發展出的單一雜交體系技術，也是根據報告基因表達量的檢測篩選出與已知順式作用元件相結合的未知因子的DNA，該項技術正廣泛應用於克隆細胞中含量微弱且用生化手段難以純化的反式作用因子。

由此可知，報告基因在基因表達調控和基因工程研究中處於非常重要的地位，它是作為外源目的基因能否轉化植物體的探路先鋒而首先被研究的，在研究植物的基因表達調控方面起著重要的作用，現已推廣到真核生物的基因調控領域中。隨著基因工程技術日新月異的發展，報告基因這一探路者的作用會更明顯。

參考資料來源：網路-熒光素酶報告基因

參考資料來源：網路-報告基因