禽類疾病快速高靈敏檢測方法

Ⅰ 食源性致病菌的快速檢測方法有哪些

檢測致病菌大概有如下幾種方法。
1 傳統生物學方法，按照標准檢測，最麻煩，最傳統，但是最經典，可作為其他方法之驗證。
2 顯色培養基方法，用國外進口顯色培養基檢測，比較方便，目前最流行，使用簡單，也不貴。
3 膠體金試紙條檢測，購買國外進口試紙條，現場檢測，這種方法10分鍾可以檢測到結果。但是檢測靈敏度偏低。
4 ELISA，酶聯免疫實驗。目前只有國外進口，歐美四家大公司壟斷了全球95%以上的市場，一個96孔試劑盒，售價高達5000-6000元，非常無奈，但是是國外最流行的快速篩選技術，檢測靈敏度、檢測周期都比較理想，不過國內現在有公司專業在做這方面的試劑盒了，估計價格很快會降下來，可能是將來主流的檢測技術了，部分已經寫進國標了。
5 IC-PCR，免疫捕捉PCR，用抗體特異性識別捕捉，之後再PCR擴增。最大的優勢是，病原經過抗體識別、PCR檢測雙重檢測，可一次鑒定到種，檢測靈敏度可以達到十的兩次方，不用核酸提取，所有反應在一個PCR管里進行，減少了病原的損失，缺點是檢測時間大致在4個小時，是一張理想的驗證手段。
6 Direct-PCR，增菌後直接PCR，比較簡單的驗證手段，增菌後直接擴增，受PCR檢測體系的現實，靈敏度偏低，但是取決於樣品中的菌含量。
7 Nested-PCR，兩對引物巢式PCR。兩對引物兩次擴增，最大的優勢是檢測准確性、靈敏度可絕對保障，劣勢是檢測時間較長。
8膜過濾PCR，利用病原富集裝置，富集之後檢測，最笨的一種方法，但是是最實用的，病原經過微孔濾膜過濾後，可高效富集病原 ，之後去檢測，大大提高檢測靈敏度。
9 BIO-PCR，培養增菌後PCR擴增，這個技術只能做研究用了，就是分離培養後，用PCR檢測，乏善可陳。
10 IMS-PCR，免疫磁珠PCR，用免疫磁珠捕捉，之後進行PCR，用磁珠富集樣品中的病原，之後直接PCR擴增，非常實用的方法，主要是可以富集病原。
11 BAX快速檢測系統，按照系統說明書操作。貴族實驗室用的東西，靈敏度和其成本、假陽性一樣出色。
12 RiboPrinter快速檢測系統，按照系統說明書操作。同上，大同小異。

Ⅱ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

Ⅲ 如何鑒別禽類的大腸桿菌病與沙門氏菌病

大腸桿菌是人和動物腸道等處的常在菌，禽大腸桿菌在雞場普遍存在，特別是通風不良，大量積糞雞舍，在墊料、空氣塵埃、污染用具和道路、糞場及孵化廳等處環境中染菌最高。

本病主要發生在密集化養禽場，各種禽類不分品種性別、日齡均對本菌易感。特別幼齡禽類發病最多，如污穢、擁擠、潮濕通風不良的環境，過冷過熱或溫差很大的氣候，有毒有害氣體（氨氣或硫化氫等）長期存在，飼養管理失調，營養不良（特別是維生素的缺乏）以及病原微生物（如支原體及病毒）感染所造成的應激等均可促進本病的發生。

臨床症狀與病理變化

本病常引起幼雛或成雞急性死亡。特徵性病變是肝臟呈綠色和胸肌充血，肝臟邊緣純圓，外有纖維素性白色包膜。也可能發生下列病變

1.心包炎:心外膜水腫，心包囊內充滿淡黃色纖維素性滲出物，心包粘連。

2.大腸桿菌性肉芽腫:病禽消瘦貧血、減食、拉稀，在肝、腸（十二指腸及盲腸）、腸系膜或心上有菜花狀增生物，針頭大至核桃大小，很容易與禽結核或腫瘤相混。

3.墜卵性腹膜炎及輸卵管炎:輸卵管擴張，內有乾酪樣團塊及惡臭的滲出物。腸卡他性炎等病變。

4.
關節炎及滑膜炎:表現關節腫大，內含有纖維素或渾濁的關節液。

5.腦炎:表現昏睡、斜頸，歪頭轉圈，共濟失調，抽搐，伸脖，張口呼吸，採食減少，拉稀，生長受阻，產卵顯著下降。主要病變腦膜充血、出血、腦脊髓液增加。

6.腫頭綜合征:表現眼周圍、頭部、頜下、肉垂及頸部上2/3水腫，病雞噴嚏，並發出咯咯聲，剖檢可見頭部、眼部、下頜及頸部皮下黃色膠樣滲出。

實驗室檢驗：採用病原學檢驗方法，排除其他病原感染（病毒、細菌、支原體等），經鑒定為致病性血清型大腸桿菌，方可認為是原發性大腸桿菌病。

禽沙門氏菌病，由一種或多種血清型沙門氏菌所引起的一大群急性或慢性禽類疾病的統稱。危害性大。主要包括3種：

1.雞白痢

由雞白痢沙門氏菌引起,最常見於雞和火雞。主要侵害雛雞，呈急性敗血症，大批死亡。倖存者多轉成慢性或帶菌者。對病程稍長者剖檢可見心、肺出現壞死或結節，肝出血與壞死，膽囊腫大。母雞感染後產蛋量、受精率與化率下降。剖檢可見卵子變形、變色和變硬。公雞則呈睾丸炎。

2.雞傷寒

為雞沙門氏菌所致的雞與火雞的敗血症，其他禽類罕見。可經蛋傳播。除雛雞外亦常使青年或成年雞群發生敗血症而招致10～50％的死亡率。急性者無明顯病變。亞急性或慢性者常見血液稀薄，肝腫呈青銅色，其表面與心肌有灰白色粟粒狀壞死灶。偶有心包炎和卵黃性腹膜炎。卵子出血、變形、變色。雛雞表現似雞白痢。

3.禽副傷寒

由鼠傷寒等多種能運動的沙門氏菌引起的禽類疾病。可由污染的飼料感染，呈地方流行性。幼禽多呈急性和亞急性，成年或未成年禽則多為慢性或隱性感染。幼雛常因急性敗血症而迅速死亡。成年患禽長期帶菌與排菌。慢性的體瘦，腸道呈壞死性潰瘍。雛雞常出現顫抖、喘息和眼瞼。病程稍長者可見卵黃凝固，肝、脾充血且有條紋狀或針尖狀出血與壞死灶。

實驗室檢驗：根據流行特點、臨床特徵和病理變化只能懷疑為本病或作出初步診斷，確診需採用病原學檢查和血清學試驗。

Ⅳ 如何實現快速檢測及有效控制沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性腸桿菌, 也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌。據有關資料統計由沙門氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所佔比例已超過三分之二，2007年發生的「 花生醬事件」以及 2008 年發生的「 西紅柿 事件」等[1]沙門氏菌中毒事件的發生也使得食品中沙門氏菌的檢測受到人們的普遍關注。本文主要是對食品中沙門氏菌的傳統檢測方法以及後續建立的以分子生物學、免疫學、生物感測器和電化學為基礎的快速檢測方法進行了系統的綜述，旨在為該致病菌的檢測方法的研究應用提供一定的參考。
1、 傳統的檢測方法（國標法）
目前, 我國對食品中沙門氏菌的檢測大多採用GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》對食品樣品進行檢測，這種傳統的培養方法可分為前增菌、增菌、分離培養、生化試驗和血清學鑒定等步驟進行。雖然傳統培養法可靠性高，但是其操作繁瑣且耗時費力，並不能滿足食品快速檢測的要求。
2、分子生物學檢測方法
2.1聚合酶鏈反應技術
PCR技術是一項敏感性高、特異性強且快速准確的微生物檢測技術，也被許多學者用於對食品中沙門氏菌進行檢測和研究。汪琦等[2]就採用傳統培養方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上宋東曉[3]建立了檢測食品中沙門氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用於食品中沙門氏菌的檢測，鍾偉軍[4]通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索,建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為食品中沙門氏菌快速檢測試劑盒的研製打下了良好的基礎。
2.2核酸探針技術
核酸探針技術是根據核苷酸鹼基互補的原理,在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強，已用於食品中沙門氏菌的檢測。Almeida等[5]通過建立一種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測，准確度高達 100%。
2.3基因晶元技術
基因晶元技術是利用已知核酸序列的探針與靶核苷酸序列雜交，然後通過信號檢測對其進行定性與定量分析，在沙門氏菌等各種致病菌的分析檢測中有很好的應用前景。饒寶等[6]通過建立檢測致病菌的基因晶元檢測方法，設計了通用引物和特異性探針: 沙門氏菌探針、大腸桿菌探針和金黃色葡萄球菌探針,實現了同時檢測並區分沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的目的。祝儒剛等[7]運用多重 PCR 結合基因晶元技術建立了檢測肉及肉製品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等5種食源性致病菌的快速檢驗方法。
2.4噬菌體裂解技術
噬菌體有特異性裂解細菌的作用。張碧波等學者利用此技術進行沙門氏菌
快速檢測，結果和其他學者相同，據此得出特異性噬菌體可以檢測出沙門氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌體裂解對150份食品樣品進行快速檢測，結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對實現沙門氏菌實時、快速而准確的檢測有重要意義。
2.5環介導等溫擴增技術（LAMP）
環介導等溫擴增技術是2000年Notomi等開發的一種新的恆溫核酸擴增方法,此方法的特點是特異性強、靈敏度高且簡單、快速,適合對大規模樣品的快速檢測[9]。李佳桐[10]通過實驗建立了沙門氏菌的LAMP檢測方法,並將此方法與常規PCR進行比較,結果顯示：LAMP方法對沙門氏菌的檢測恆溫65℃下只需要40min,只擴增沙門氏菌,不會擴增其他革蘭氏陰性菌,最低可檢出濃度10cfu/mL,比常規PCR的最低檢出濃度高1個數量級,通過添加熒光染料SYBR Green Ⅰ,能夠快速簡便的觀察檢測出綠色的陽性結果十分明顯的區別於橙色的陰性結果。
3、免疫學方法
3.1酶聯免疫吸附技術
酶聯免疫吸附法簡稱 ELISA， ,此技術敏感性高 ,不需特殊設備 ,結果觀察簡便，早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用於食品中沙門氏菌的檢測。伍燕華等[11]設計捕獲抗體和檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。張帥等[12]建立雙抗夾心ELISA體系，檢測模擬污染肉樣中沙門氏菌,其檢測限為800CFU/g，等均並與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應,特異性良好。
3.2免疫熒游標記技術
免疫熒游標記技術是根據抗原抗體的特異性反應，將熒光素標記在已知抗原(或抗體)上,與特異抗體(或抗原)結合後產生熒光，可用來定位抗原或抗體、並通過定量分析，確定測定含量。葉明強[13]基於納米免疫磁珠富集,免疫量子點標記,建立了一種食品中沙門氏菌的含量進行快速檢測的方法，研究出了一種新型的免疫熒光食源性致病菌檢測技術。
3.3斑點免疫金滲濾法
免疫膠體金技術是以膠體金作為標記物結合免疫原理的一種應用於抗原抗體的新型技術，該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究，曹春梅等[14]是利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌O9抗原進行了研究，結果表明此法簡單、快速，適合推廣運用；孔繁德等[15]是通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。
3.4免疫磁性分離技術
免疫磁珠分離技術是將特定病原體的單抗或多抗與磁珠微球偶聯，並通過抗原抗體反應形成磁珠，在外加磁場作用下磁珠會發生定向移動，從而達到分離目標病原體的作用。食品樣品中致病菌含量很少，常規的方法是很難從中分離出來的，藉助免疫磁性分離技術可以達到快速分離的目的。王海明等[16]應用磁免疫技術建立快速檢測食源性沙門氏菌的方法，結果表明此方法能對食品基質中的目標菌進行快速有效的富集,其檢測限<10cfu/25g,檢測周期約為40小時。胡霏[17]也通過實驗針對鼠傷寒沙門氏菌建立免疫磁分離技術結合熒光層析技術的快速檢測方法。
4、生物感測器技術
生物感測器是利用一些生物活性物質如酶 、多酶體系 、抗體等做為敏感器件，然後配以適當的信號傳導器所構成的分析檢測的工具。我國學者已採用此法對沙門氏菌的抗原、抗體的免疫吸附進行檢測，並已用於快速檢測食品中致病的沙門氏菌，而僅需 1h 完成，達到了快速的檢測目的。寧毅[18]在對碳納米管性質研究的基礎上,結合分子探針構建了碳納米管生物感測器，並將其用於沙門氏菌的檢測，結果顯示所構建的感測器靈敏度高、特異性強、穩定性好。
5、電阻抗技術
電阻抗法是近年發展起來的一項生物學技術，因為具有檢測速度快、靈敏度高、准確性好等優點，目前此法已用於食品中沙門氏菌檢測檢驗並已通過美國公職分析化學協會(AOAC)認可。陳廣全等[19]建立了電阻抗法快速檢測食品中沙門氏菌的方法，並將其與常規培養法進行比較，對食品中的沙門氏菌屬進行檢測,結果表明電阻抗法比傳統培養法更加快速、可靠。
6、總結
綜上所述，沙門氏菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進，並向儀器化、標准化、自動化方向發展，並且食品安全、致病菌等問題對人類健康以及生活環境都造成了嚴重威脅，加強沙門氏菌檢測勢在必行。目前沙門氏菌快速檢測技術大多具有檢測迅速、靈敏度高、特異性強等特點，此外這些方法還具有各自的優點和局限性，在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙門氏菌快速檢測技術。

Ⅳ 瘦肉精檢測方法有哪幾種

目前的瘦肉精檢測方法，大致有一下四種方法，市場上的一些檢測物品也是根據這些方法衍生而來的。

氣象色譜-質譜法，簡稱GC-MS，GC-MS法優點是把色譜高效快速的分離效果和質譜高靈敏度的定性分析有機合起來，能在多種殘留物同時存在的情況下對某種特定的殘留物進行定性、定量分析，而且具更高的檢測極限。

高效液相色譜法，此法適合測定熱不穩定和強極性的β-激動劑及其代謝產物，而且，HPLC可以與柱前提取、純化及柱後熒光衍生化反應和質譜（MS）等系統聯用，容易實現分析過程的自動化。其優點是專屬性好、選擇性強、檢測精確度較高，而且假陽性率低；缺點是樣品處理時間長，檢測過程煩瑣、難於操作，需貴重儀器，在實際應用中受到一定的限制。

酶聯免疫吸附法，利用免疫學抗原抗體特異性結合和酶的高效催化作用，通過化學方法將植物辣根過氧化物酶（HRP）與克倫特羅（CL）結合，形成酶偶聯克倫特羅。將固相載體上已包被的抗體（羊抗兔IgG抗體）與特異性的抗克倫特羅抗體結合，然後加入待測克倫特羅和酶偶聯克倫特羅，它們競爭性與克倫特羅抗體結合，洗滌後加底物，根據有色物的變化計量待測克倫特羅量。

膠體金免疫層析法，利用競爭法膠體金免疫層析技術，檢測液中的Clen與金標墊上的金標抗體結合形成復合物，若Clen在檢測液中濃度低於靈敏度值，未結合的金標抗體流到T區時，被固定在膜上的Clen-BSA偶聯物結合，逐漸凝集成一條可見的T線；若Clen濃度高於靈敏度值，金標抗體全部形成復合物，不會再與T線處Clen-BSA偶聯物結合形成可見T線。

Ⅵ 某種食物中含黃麴黴素，用最簡單的方法怎麼檢測

薄層分析法(TLC)、液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫法(ELISA)、毛細管電泳法(CE)、熒光光度法(IA C/S FB)。

1、薄層分析法(TLC)

TLC法是檢測黃麴黴素最為經典的方法，也是以前最為常用的方法，至今仍為一些檢測機構所用，也是一種國標方法。其原理是針對不同的試樣，用適宜的萃取溶劑將黃麴黴素從試樣中萃取出來，經柱層析凈化後，再在薄板上展開後分離。

5、熒光光度法(IA C/S FB)

IA C/SFB法也是一種常用的國標方法。該方法的原理是利用各種黃麴黴素的熒光特性差異用熒光光度計測定試樣中黃麴黴素的含量。

該方法對檢測人員身體健康無危害，檢測速度迅速，靈敏度高，適用於大量試樣檢測，且定量准確，但檢測費用較高，需要配置專用設備，且不能對單一的毒素進行檢測。

(6)禽類疾病快速高靈敏檢測方法擴展閱讀：

黃麴黴毒素的毒性有三種臨床特徵：急性中毒、慢性中毒和致癌性，有致癌、致畸、致突變的作用。

其致癌特點是：致癌范圍廣，能誘發魚類、禽類，各種實驗動物、家畜及靈長類等多種動物的癌症，除主要誘發肝癌外，還可誘發胃癌、腎癌、直腸癌、乳腺癌，卵巢及小腸等部位的腫瘤，亦可導致出現畸胎。因此許多國家都制定了有關食品中黃麴黴毒素限量標准。

Ⅶ 怎麼對禽類做h7n9檢測

到正規的畜牧獸醫站去做檢測

Ⅷ 血清學診斷 分子生物學診斷 什麼叫

常規血清學診斷技術
1.1血清凝集抑制試驗(HI)
因為許多動物病毒能夠凝集某種類動物的紅細胞,由於血凝反應可被特異性抗體所抑制,抗體與病毒結合後,血凝素即不能吸附於紅細胞表面的受體上。HI不象其它血清學試驗,不需要種屬特異的結合〔1,2〕,因此特異性不好。一般檢測快速,用於大量篩選野生或飼養的動物樣品中的抗體。
1.2 補體結合試驗(CF)
由於一個抗體分子與抗原結合後,可以導致數百個補體分子的激活,呈現一定的放大作用,所以補體結合試驗是一個比較敏感的方法。雖然在某些病毒型的鑒定上,補體結合試驗的檢測能力有時不及中和試驗和血凝抑制試驗,但補體結合試驗穩定,特異性高,重復性好,一直仍用於動物血清學中特異性抗體的定量檢測〔3〕。
1.3 免疫熒光抗體技術
通過顯微鏡標本的免疫熒光染色而顯示其結果,由於病毒抗原的標記比較困難,常用標記抗體檢查未知抗原,此技術具有抗原抗體反應的特異性和染色技術的快速性,並可以在細胞水平上進行抗原定位,故在病毒學研究和診斷中都是一種應用很廣的方法〔4~7〕。另外,用此方法也可檢測海洋微生物,尤其是細菌〔8〕,避免了細菌培養,從而提供了特異、快速的檢測方法。
1.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
ELISA是應用最廣的一項免疫學診斷技術,以物理方法將抗體(或抗原)吸附在固相載體上,隨後的一系列免疫學和生物化學反應都在此固相載體上進行的免疫酶測定試驗,無論是病毒病、禽傳染性支氣管炎抗體檢測〔9〕、禽多瘤病毒特異性抗體檢測〔10〕,還是細菌,例如牛布魯氏桿菌病〔11,12〕,或是寄生蟲引起的疾病、犬弓形體病〔13〕、羊肝片吸蟲〔14〕,都應用到了酶聯免疫吸附試驗技術。因此,ELISA在各種動物疾病診斷上發揮了重要的作用。ELISA作為根除控制計劃的初篩方法是非常理想的,費用相對較少,比常用的血清學方法有明顯的優點,不需要抗體的第二特徵,例如血凝性、結合補體的能力〔11〕,用時少,敏感性、重復性、特異性好,可篩選檢測大量的樣品〔15〕。利用純化的抗原,單克隆抗體可提高反應檢測的特異性〔9,10,11〕。
1.5 斑點酶聯免疫吸附試驗
將酶標反應板換成硝酸纖維膜,即為斑點酶聯免疫吸附試驗,將少量的試劑點在硝酸纖維膜或其它能結合蛋白的膜上,同抗原特異的抗體以及酶結合抗體反應,加入能形成不溶性有色沉澱的底物,使固相膜染色,形成有顏色的斑點,直接判讀結果。利什曼原蟲病〔16〕,牛呼吸道合包體病毒〔17〕,無鉤絛蟲〔18〕,免疫寄生蟲〔19〕,克服了顯微鏡檢查的麻煩。因硝酸纖維素膜吸附性能強,一般在包被後須再進行封閉。如將硝酸纖維素膜裁剪成膜條,並在同一張膜條上點有多種抗原,將整個膜條與同一份血清反應,則可同時獲得對多種疾病的診斷結果,3種主要禽類疾病的同時檢測〔20〕,多種蛋白的分析〔21〕,此方法快速,容易操作,已廣泛應用於動物疾病的診斷。
免疫血清學技術的發展趨向一直是高度特異性、高度敏感性,精密的分辨能力,高水平的定位,試驗電腦化,反應微量化,方法標准化和試劑商品化,以及方法簡便、快速。隨著生物化學和分子生物學等學科迅速發展,相繼出現了許多新的診斷技術,可以從分子水平對疾病的致病機理,診斷、治療和預防進行研究。
2與分子生物學技術相結合的診斷技術
2.1PCR-ELISA
將PCR技術與ELISA相結合的一種抗原檢測技術,又稱免疫PCR。該技術是由Sano T等在1992年建立的,其本質是一種以PCR技術代替酶反應來放大顯示抗原抗體結合率的改進ELISA,利用ELISA技術檢測PCR擴增的產物〔3〕。利用了PCR的指數擴增效率帶來極高的敏感度,同時又具有高的特異性的抗原檢測系統。用親和素包被微孔板,封閉後,加入標記於捕獲探針3』端的生物素,而捕獲探針5』端和待檢靶序列5』端的一段互補,通過生物素和親和素的交聯作用,將捕獲探針固定在微孔板上,製成固相捕獲系統。其次PCR緩沖液中加入一定比例的地高辛標記的DUTP,經PCR擴增後,擴增產物與微孔板上的捕獲探針進行液相雜交,帶有地高辛的靶序列即被捕獲,再在微孔板中加入用辣根過氧化物酶(HRP)標記的抗地高辛抗體,再加入底物如TMB顯色,進行ELISA檢測。
此法具有高靈敏度,檢測結果可靠,可以進行半定量檢測的優點,可用於病毒的檢測、疾病診斷和目的基因檢測。此方法較常規PCR靈敏度提高了10倍〔22,23〕,此方法鑒定PCR產物更快速,判定結果客觀,易於操作,尤其在篩選大量品時,是非常理想、有用的工具。PCR-ELISA方法避免了在常規PCR中,由於非特異的產物和不名原因引起的條帶反應,而作出的主觀解釋〔23〕。可篩選大量食源性病原體,幫助加工廠監測食品的污染水平,進行危險品分析〔24〕。尤其在寄生蟲檢測方面,以前多用血塗片,而現在應用PCR-ELISA檢測牛巴

Ⅸ 血清中禽流感抗體含量的檢測方法

禽流感是由A型流感病毒引起的一種高度接觸性傳染性疾病。給世界養禽業造成了巨大的經濟損失。禽流感病毒可分為不同的亞型，世界各地的禽流感主要由高致病性的H5和H7兩種亞型引起，而人對其中的H1和H3亞型易感。快速診斷禽流感病毒具有重大意義。目前禽流感的實驗室檢測是比較快速、准確的方法。隨著血清學實驗技術和生物工程技術的飛速發展，禽流感診斷技術的研究也不斷取得新進展。瓊脂擴散試驗、血凝和血凝抑制試驗等常規方法的使用雖有一定的優勢，但免疫熒光法和ELASA也日益顯示出其快捷准確的特點：分子生物學的發展為核酸序列分析法的建立創造了條件,也使PCR，RT－PCR及核酸探針等檢測技術成為可能。這篇文章就是對有關該病的診斷方法加以總結，並提出了認為比較可行的改進方法，旨在方便對禽流感做出及時而有效的診斷並採取相應措施。

1. 病毒的分離鑒定

無菌採集病料經處理後接種9－11日齡雞胚，收取尿囊液測定血凝活性。若為陰性則應繼續盲傳2－3代。對具有血凝活性的尿囊液需先用新城疫(ND)抗血清做血凝抑制(HI)試驗!以排除ND感染。然後用免疫擴散等方法來檢測特異核心抗原，核糖蛋白(NP)或基質蛋白(MP)，再用血凝抑制試驗和神經氨酸酶抑制試驗鑒定A型流感病毒亞型。分離鑒定的同時進行致病力試驗，確定毒力強弱。但是流感病毒「O」相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鍾才能觀察結果，同時在「U」型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空[1]。

病毒的分離鑒定對禽流感的診斷比較確實,但操作程序繁瑣、費用多、耗時費力。

2. 血清學診斷技術

2.1 瓊脂擴散(AGP)試驗

進行病毒抗原型特異性鑒定即用已知陽性血清和末知抗原進行AGP試驗。

受檢樣品是具有血凝素活性的雞胚尿囊液。AGP是用來檢測A型流感病毒群特異性血清抗體，即抗核糖蛋白(RNP)和基質蛋白(MP)抗體，因而適用於鑒定流感病毒 。1979年Beard首次將AGP用於禽流感抗體檢測[2]。

此法雖簡單易行，但是敏感性較差，易出現假陽性。AGP最常用的是免疫雙擴散，趙增連、陳海燕等分別開展了禽流感病毒快速定型雙擴散法的研究，不僅提高了其敏感度，且快速省時，在此方法基礎上建立的AGP診斷技術及其診斷試劑盒，在全國范圍內得到推廣應用，並取得良好的效果。

2.2 血凝(HA)和血凝抑制試驗(HI)

一般情況下，新分離毒株要先鑒定出特異性NP或.MP抗原型(用AGP)確定禽流感病毒，再做HA亞型的鑒定[3]。

現已有人採用改進HA試驗方法，稱為HA加敏法。該法測抗體效價比常規性高2－4倍，若抗原用乙醚裂解其敏感性比常規法高4－6倍，但觀察時以30min內為好，否則易出現假陽性。另外，還應注意在HI試驗時，應先除去特異性凝集反應。許多禽類血清都含有非特異性因子，能和紅細胞表面受體競爭性地作用於病毒表面的血凝素而發生非特異性凝集反應。通常用受體破壞酶(RED)即霍亂菌培養液處理法或高碘酸鈉法制備血清[4]。

HA、HI 特異性好，是亞型鑒定的常用方法，但其操作過程繁瑣費時，並且由於用已知HA亞型的抗血清不能檢出新的HA亞型的禽流感病毒，所以用該方法鑒定不如瓊脂擴散實驗簡便和快捷。

2.3 神經氨酸酶抑制試驗(NIT)

根據A 型流感病毒的表面抗原特性,特別是血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)特性，不僅可通過HI試驗對病毒進行堅定，而且可通過NI試驗進行鑒定。1983 R.A.Van.Densen介紹了NI試驗的一種改進法－平板微量NI試驗，此法雖不能提供常量法的定量，但卻是A型流感病毒的病毒分類和抗體檢測的快捷方法， 試驗證明微量NI試驗能對分離物做出准確鑒定而常量NI試驗檢測亞型混合物似更敏感[5]。

目前國家獸醫實驗所已將微量NI試驗列為流感病毒分離物定型及篩選畜禽血清9型NA抗體的常規方法，診斷中也已廣泛採用此法特別是美國在80年代火雞發生流感病毒期間，每次流行所得的血清樣本用微量NI試驗所作出的A型流感病毒亞型鑒定結果已為病毒分離、疫苗接種和流行病學資料所證實。這種方法已被證明是快速的且成本較低和有可重復性。這種技術的可靠性將導致NI試驗的廣泛應用。

2.4 中和試驗(NT)

病毒中和實驗技術是反映機體抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和實驗技術有以下優點：（1）由於中和抗體作用於流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和實驗主要用於檢測血清中的特異性抗血凝素蛋白抗體。（2）流感病毒中和實驗既能檢測病毒株的功能性變化，又能反映機體的抗病毒水平。（3）該方法主要使用感染性病毒，不需要進行病毒或病毒蛋白的純化，因此，可以被迅速用於檢測新病毒或人群免疫狀態[6]。

以中和試驗(NT)來鑒定或滴定流感病毒時常用雞胚或組織培養細胞，操作方法與其他病毒(如NDV)的中和試驗相同。病毒中和實驗技術是一個相當復雜的過程，參與中和反應的因素有病毒、抗血清和宿主細胞。這些因素的變化都會影響中和實驗的結果。因此，對中和實驗的整個過程進行嚴格的質量控制。每次測定必須設立陽性和陰性血清對照，陽性和陰性細胞對照，以及對病毒使用劑量進行滴定。

NT試驗是最敏感而特異的血清學方法，只有抗體與病毒顆粒上的表面抗原相對應，特別是與吸咐到宿主細胞上的病毒表面抗原相對應，才能在實驗中取得滿意的顯示效果。 因此，某一個血清型的中和試驗抗體只與同組內地其他病原表現出有限的交叉反應。病毒中和試驗操作繁瑣耗時費料，臨床上幾乎不用。但作為經典方法在病毒鑒定中起著重要作用，許多新的檢測方都要與之為標准進行比較[7]。

2.5免疫熒光技術(IFT)

免疫熒光技術就是熒光抗體技術(FAT)。 IFT早在1961年就開始用於人類流感的快速診斷。1984年濱西法尼亞州爆發禽流感時，Skeeles將IFT首次用於AIV的檢測。IFT最早用於病毒的鑒定和定位病毒感染細胞中特異性抗原。主要是核內熒光:用MP抗原的熒光抗體主要出現胞質熒光，核內也有部分熒光[8]。

用於禽流感病毒的診斷常用直接熒光抗體法即在組織觸片上直接染色，以熒光顯微鏡檢查熒光 。一種AIV的熒光抗體可用來檢測不同亞型的其他病毒。

IFT用於診斷具有快速、簡便、敏感性好的特點，而且費用較低，其敏感度同病毒的分離鑒定相當，有時高於用雞胚進行的病毒分離。但是需要注意的是如何避免和降低標本中出現的假陽性(非特異性熒光)問題。

對一株雜交瘤細胞分泌的流感病毒的單克隆抗體進行檢測時，發現間接固相免疫熒光技術的敏感性比HI 高40－150倍。間接免疫熒光技術也可以用來檢測核蛋白(NP)基質蛋的(MP)抗原與抗體的反應，其敏感性很高。但對抗原制備要求較高，需用非離子型去污劑對純化的病毒粒子進行裂解[9]。

2.6 酶聯免疫吸附法(ELISA)

ELISA的基本原理是：酶結合物與相應抗體或抗原特異性結合，再遇酶底物時，在酶的強烈催化下使原來無色的底物產生化學反應，即形成有色的產物，便可用肉眼或分光光度計定量檢測其含量。該方法具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優點。在流感病毒微量中和實驗中，酶結合物（HRP標記的羊抗鼠IgG抗體）與存在於MDCK細胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體復合物結合，HRP酶催化OPD，使無色底物形成橙黃色化合物，再由ELISA檢測儀測定吸光度值，從而獲得中和抗體滴度[11]。

1974年Jenning等首先用ELISA對注射流感病毒所產生的抗體消長規律進行了檢測。Lanbre認為ELISA的敏感性遠高於HI補給結合反應 。Meulemans(1987)對ELISA、AGP、HI檢測AIV抗體進行了比較研究。發現AGP和ELISA一樣均能檢測型特異性抗原(抗體)，但敏感性遠低於ELISA，HI適用於亞型的檢測，其敏感性不如ELISA。1993 年Shodihall用混合纖維素脂膜或硝酸纖維素膜代替微量反應板，建立了快速診斷的DAS－ELISA大大縮短了診斷時間，並可保留ELISA的特異性、敏感性，其結果又不需要特殊儀器分析、可用肉眼判定。

隨著分子生物技術的發展，中國農業科學院哈爾濱獸研所的李海燕等用表達禽流感病毒核蛋白的桿狀病毒感染S9昆蟲細胞，以其表達產物制備抗原，建立了以桿狀病毒系統表達的AIV核蛋白為抗原的禽流感間接(重組核蛋白)ELISA診斷技術(rNP－ELISA)確定了其最適工作條件，並對3138份雞血清進行了檢測。實驗證明rNP－ELISA與全病毒間接ELISA(AIV－ELISA)，AGP及HI的符合率分別為99.9%、97.8%、98.8%，並能100%檢出AGP陽性及疑似HI陽性的血清樣品。 這證明了rNP－ELISA是檢測A型禽流感病毒血清特異性抗體的一種特異、敏感、微量、快捷、經濟的血清學診斷技術[11]。

ELISA方法的敏感性和特異性與抗原的純度直接相關 。1984年Abraham等報道了抗原快速提純法，所需時間比常規法縮短10倍，並且研究結果表明應用提純抗原幾乎全部排除了假陽性反應。

目前美國Kiregard Reery和Labortories有試劑盒出售。ELISA成為AI流行病學普查及早期快速診的最有效和最實用的方法。

3 分子生物學技術

近年來，隨著現代生物技術的發展，分子生物技術已被大量應用於禽流感的快速診斷。

3.1聚合酶鏈反應(PCR)及反轉錄---聚合酶鏈反應(RT—PCR)

PCR是近來發展成熟起來的一種體外基因擴增技術，能在數小時內使DNA呈指數增加。已成功地用於多種病毒的基因檢測和分子流行病學調查等其檢測原理為：尋找傳染性因子的特異DNA序列。對待測樣品進行PCR擴增， 如果檢測出了相應的擴增帶，則判為陽性反應；反之，無擴增帶則為陰性反應。

鑒於引起致病的禽流感病毒多是H5和H9血清亞型，在PCR技術的基礎上，崔尚金等(1998)建立了一種直接檢測禽糞樣和雞胚尿囊液中AIV—H9亞型RNA的RT－PCR反應，並將此法與AGP和電鏡技術作了比較，結果表明引物的特異性決定了產物的特異性，並且該方法靈敏度高，檢測過程僅需8h左右，並且大大縮短了感染後的檢出時間。

應用毛細管PCR(15min30個循環)代替常規PCR(2.5個小時30個循環)以進一步縮短檢測時間的研究也已展開並進入更深入的領域，以期用於不同樣品(組織、組織液、分泌液、糞便等)的檢測，區分高致病力毒株和低致病力毒株與非致病力毒株，從而深入探討該方法在AIV的臨床早期診斷，流行病學調查及發病機制中的應用價值，為我國制定AIV的綜合防制措施做出貢獻[12]。

3.2 核酸探針技術/核酸分子雜交技術

這項技術是目前生物化學和分子生物學研究應用最廣泛的技術之一，是定性和定量檢測特異DNA或RNA的有力工具。

核酸探針技術的原理，在進行雜交時，用一種預先分離純化的已知DNA或RNA序列片段去檢測末知的核酸樣品，對作檢測用的已知DNA或RNA序列片段加以標記的片段就稱為核酸探針。作為核酸探針的DNA或RNA是各種病原微生物基因的一部分。 在變性分開的待檢DNA或RNA單鏈中加入與其有互補作用的核酸探針。探針在一定條件下就能與原來變性分開的DNA或RNA單鏈上的互補區段形成氫鍵，從而結合成雜交雙鏈，通過洗滌，除去未雜交上的標記物，然後進行放射自顯影，即可確定原待檢樣品有無與探針互補的DNA或RNA序列。

Bashiruddin等(1991)報道了擴增HA基因來分析致病毒株與非致病毒株的差異，證實了致病毒株與非致病毒株氨基酸的差異，顯示了本方法的應用前景[13]。

3.3熒光PCR法

利用生物學手段，用熒光PCR方法快速檢測禽流感病毒的方法已在北京通過專家鑒定，這一研究成果不僅在國內屬於首次，而且在國際上也屬於先進水平。它與國際標准方法雞胚病毒分離相比，不僅無需做雞胚病毒分離培養，而且時間也由原來最短的21d縮短為4h。

4 電鏡技術

由於流感病毒為正粘病毒，屬於形態特徵性強的病毒,因而可用電鏡技術來診斷。為提高禽流感的檢出率，除樣品制備技術外，取病料的部位和時間也是獲得准確檢驗結果的關鍵。病料的採集部位及取材時間應根據禽流感病毒在動物體內分布特徵及其感染特性而定[15]。

5 流感實驗室檢測中應注意的若干問題（高致病性流感病毒）

（1）禁止在同一實驗室，更不應在同一接種櫃中，同時處理接種未知臨床標本、已知陽性標本

（2）禁止在同一實驗室，同一時間處理，接種采自不同動物的標本；動物標本（如禽、豬等）必須與人的標本分別保存。

（3）接種後剩餘原始標本，尤其分離出病毒的標本需暫時凍存，有條件的應置-70℃或以下保存，以便需要時可進行復查，待分離物經國家流感中心鑒定完後方可處理掉。分離陰性的標本應隨時棄之。

（4）嚴禁實驗室交叉污染：在病毒分離時嚴禁設陽性對照及操作在人群中已消失的流感病毒。

（5）向國家流感中心送毒株時，量至少需5 ml，同時需自己保存一些，以便寄送過程發生意外時可繼續補送。

（6）流感病毒在-20℃～-40℃ 時不穩定，故不宜在此溫度下長期保存。

（7）雞胚中分離出的流感病毒，應盡量別在MDCK細胞上傳代。因當今國內所用的MDCK細胞屬腫瘤細胞系，一旦病毒通過它傳代就無法用於疫苗制備。

（8）寄送毒株時一定需附上送檢表。寄送毒株需及時，尤其鑒定不出的，異常的毒株應盡快向國家流感中心寄送。寄送時用快速直送國家流感中心[16]。

總結

使用常規方法檢測禽流感及其抗體仍是目前世界上普遍接受的方法。這些方法包括病毒的分離、瓊脂擴散實驗鑒定病毒和測定特異性的血清抗體，血細胞凝集及其抑制試驗鑒定病毒或血清抗體亞型。 採用雞胚中和試驗來鑒定病毒或血清抗體亞型也是一種可以接受的方法，但相對血凝抑制試驗較為麻煩。隨著科學技術的發展，檢測該病毒和血清的方法出現了免疫光法和ELISA法，這些方都有快捷的特點，特別是日益完善並趨向成熟的ELISA檢測方法,因其簡捷、敏感、特異性強等優點而越來越得到廣泛的重視和應用。隨著分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法,特別是它能從分子生物學的發展，核酸序列分析法越來越可能成為一種更准確可行的方法，特別是它能從分子水平揭示HPAIV甚至潛在HPAIV毒株。這種方法雖然在一般實驗室還不能應用,但RT－PCR技術為從基因水平檢測禽流感病毒RNA提供了靈敏、特異和快捷准確的方法。正在進行的應用毛細管PCR代替常規PCR，以進一步縮短檢測時間的研究和根據禽流感NP的高度保守性而建立的rNP－ELISA檢測法，不僅具有與AGP、HI同樣的特異性，而且具有更高的靈敏性，可在微克水平上進行檢測!都是很有前途的方法。將rNP－ELISA檢測技術及其成套的成品試劑組裝成診斷試劑盒，也取得了很好的實驗效果。

在以上各種檢測方法及科學技術發展的基礎上，將PCR技術與ELISA技術結合起來，建立一種新的實驗室檢測AIV的方法，將有較大的研究價值其實。其實驗原理（以此類方法中最簡單的雙引物雙標記法為例）如下：

PCR的一對引物中!其中一種引物用生物素標記，另一種引物用地高辛標記，酶標微孔板上用生物素的親和素包被(生物素的親和素與生物素特異的結合)。PCR擴增後純化片段加入微孔板中。此時，微孔板上包被的生物素親和素將與引物上的生物素結合而捕捉了PCR片段，再在微孔板中加入辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體，該抗體將與另一引物上的地高辛結合，從而形成生物素親和素－生物素－PCR片段地－高辛－抗地高辛－酶的復合物。加入酶的相應底物進行顯色，便可判斷PCR擴增的有無。由於該方法是PCR技術和ELISA技術的結合，所以它是一種兩級放大系統,即PCR放大和ELISA放大。故而它的靈敏度更高，同時這種方法避免了PCR產物分析時的電極及染色過程，所以更為快捷、簡便、靈敏。

Ⅹ 納米金 是什麼意思

納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，具有高電子密度、介電特性和催化作用，能與多種生物大分子結合，且不影響其生物活性。由氯金酸通過還原法可以方便地制備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。
以納米金為免疫標記物的檢測技術的發展
作為現代四大標記技術之一的納米金標記技術(nanogold labelling techique)，實質上是蛋白質等高分子被吸附到納米金顆粒表面的包被過程。吸附機理可能是納米金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合，而且吸附後不會使生物分子變性，由於金顆粒具有高電子密度的特性，在金標蛋白結合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當這些標記物在相應的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點，因而用於定性或半定量的快速免疫檢測方法中。由於球形的納米金粒子對蛋白質有很強的吸附功能，可以與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白等非共價結合，因而在基礎研究和實驗中成為非常有用的工具。
1．1 作為顯微鏡示蹤物
1978年，Geobegan等將納米金標記抗體用於普通光鏡下檢測B淋巴細腦表面膜免疫球蛋白，建立了光鏡水平的免疫金染色(immunogold staining，IGS)。1981年 Danscher用銀顯影方法增強金顆粒的可見度，並提高了靈敏度。Holgate等人於1983年建立了用銀顯影液光鏡下金顆粒的可見性的免疫金銀染色法(immunogold-siliver staining，IGSS)，利用銀的增強作用，加大單獨金粒子在光鏡下可視粒子的半徑，增加了小顆粒金粒子的標記密度，提高了靈敏度。1986年Fritz等人又在IGSS法基礎上成功地進行了彩色IGSS法，使得結果更加鮮艷奪目。盡管如此，由於亞硝酸銀化合物是光敏性的，需要在暗室里進行標記，實驗操作非常的不便，改用非光敏的醋酸銀化合物，價格又過於昂貴，所以納米金在光鏡中的應用日漸減少。而利用納米金的高電子密度，能在電鏡下清晰的分辨顆粒，作為在透射電鏡(TEM)、掃描電鏡(sEM)和熒光顯微鏡的示蹤物在電鏡免疫化學和組織化學中得到了廣泛應用。
1．2 應用於均相溶膠顆粒免疫測定技術
均相溶膠顆粒免疫測定法(sol particle immunoassay， SPIA)是利用免疫學反應時金顆粒凝聚導致顏色減退的原理，將納米金與抗體結合，建立微量凝集試驗檢測相應的抗原，如間接血凝一樣，用肉眼可直接觀察到凝集顆粒。已成功地應用於PCG的檢測，直接應用分光光度計進行定量分析。
l.3 應用於流式細胞儀
應用熒光素標記的抗體，通過流式細胞儀(Flow CytoMeter，FCM)計數分析細胞表面抗原，是免疫學研究中的重要技術之一。但由於不同熒光素的光譜相互重疊，區分不同的標記很困難。Boehmer等研究發現，納米金可以明顯改變紅色激光的散射角，利用納米金標記的羊抗鼠Ig抗體應用於流式細胞術，分析不同類型細胞的表面抗原，結果納米金標記的細胞在波長632nm時，90度散射角可放大10倍以上，同時不影響細胞活性。而且與熒光素共同標記，彼此互不幹擾。因此，納米金可作為多參數細胞分析和分選的有效標記物，分析各類細胞表面標志和細胞內含物。
1．4 應用於斑點免疫金銀染色技術
斑點免疫金銀染色法(Dot-IGS，IGSS)是將斑點ELISA與免疫納米金結合起來的一種方法。將蛋白質抗原直接點樣在硝酸纖維膜上，與特異性抗體反應後，再滴迦納米金標記的第二抗體，結果在抗原抗體反應處發生金顆粒聚集，形成肉眼可見的紅色斑點，此稱為斑點免疫金染色法(Dot-IGS)。此反應可通過銀顯影液增強，即斑點金銀染色法(Dot-IGS/IGSS)。
1．5 應用於免疫印跡技術
免疫印跡技術(immunoblotting，IBT)也稱為免疫轉印技術，其原理是根據各種抗原分子量大小不同，在電泳中行走的速度不同，因而在硝酸纖維素膜上占據的位置也不同；把含有特異性抗體的血清和這一薄膜反應，那麼特異性的抗原抗體反應就顯色。而納米金免疫印跡技術相比酶標記免疫印跡技術具有簡單、快速、具有相當高的靈敏度。而且應用納米金將硝酸纖維素膜上未反應抗體進行染色，評估轉膜效率，校正抗原一抗體反應的光密度曲線，即可進行定量免疫印跡測定。
1．6 應用於斑點金免疫滲濾測定技術
斑點金免疫滲濾測定法(dot immuno-gold filtration assay，DIGFA)是斑點免疫測定法(dot immunoboding assay，DIBA)中的一種，是1982年由Hawkes等人在免疫印跡技術基礎上改良發展起來的一項免疫學新技術。其原理完全同斑點免疫金染色法，只是在硝酸纖維膜下墊有吸水性強的墊料，即為滲濾裝置。在加抗原(抗體)後，迅速加抗體(抗原)，再加金標記第二抗體，由於有滲濾裝置，反應很快，在數分鍾內即可顯出顏色反應。與斑點免疫滲濾測定法(d o t immunotietration assay，DIFA)相比，所不同的是免加底物液，直接由紅色膠體金探針顯色，結果鮮艷，背景更清楚，可以在室溫下保存。該方法已成功地應用於人的免疫缺陷病病毒(HI)的檢查和人血清中甲胎蛋白的檢測。目前使用的有HCG試劑盒，AFP試劑盒，消化道腫瘤篩檢試劑盒。
1．7 應用於免疫層析技術
免疫層析法(gold immunochromatography assay， GICA)是將各種反應試劑以條帶狀固定在同一試紙條上，待檢標本加在試紙條的一端，將一種試劑溶解後，通過毛細作用在層析條上滲濾、移行並與膜上另一種試劑接觸，樣品中的待測物同層析材料上針對待測物的受體(如抗原或抗體)發生特異性免疫反應。層析過程中免疫復合物被截留、聚集在層析材料的一定區域(檢測帶)，通過可目測的納米金標記物得到直觀的顯色結果。而游離標記物則越過檢測帶，達到與結合標記物自動分離之目的。GICA特點是單一試劑，一步操作，全部試劑可在室溫長期保存。這種新的方法將納米金免疫檢測試驗推進到～個嶄新的階段。
1．8 生物感測器
生物感測器(biosensor)是指能感應(或響應)生物、化學量，並按一定規律將其轉換成可用信號(包括電信號、光信號等)輸出的器件或裝置。在生物感測器方面，納米金主要設計為免疫感測器，是利用生物體內抗原與抗體專一性結合而導致電化學變化設計而成。另外由於納米金的氧化還原電位是+1．68V，具有極強的奪電子能力，能大大提高作為測定血糖的生物感測器葡萄糖氧化酶膜的活性，金顆粒越細，活性越大。
1．9 生物晶元
生物晶元是以膜、玻璃、硅等固相介質為載體，其最大的優點在於高通量、並行化、微型化。一次實驗可同時檢測多種或多份生物樣品。生物晶元包括基因晶元、蛋白質晶元、細胞晶元、組織晶元。目前，生物晶元用於食品安全檢測領域的應用主要包括農葯、獸葯殘留檢測，食品微生物檢測、動物疫病監測、轉基因動物植物檢測等。2002年Park等在《Science》雜志上介紹了一種以納米金為探針的基於電荷檢測的新型基因晶元，該晶元具有非常好的靈敏度及特異性，可以在十萬分之一比率中檢測出單鹼基突變的基因片段。
納米金技術在食品安全快速檢測中的應用
目前食品檢測分析一般採用化學分析法(CA)、薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)，但需要繁瑣、耗時的前處理，樣品損失也較大。相對於靈敏度較低的CA和TLC方法，GC、HPLC的靈敏度較高，但操作技術要求高、儀器昂貴，並不適合現場快速測定和普及，而以納米金為免疫標記物的檢測技術正彌補了這些技術的缺點，在現代食品分析檢測中的運用也越來越多。
2．1 獸葯殘留
所謂獸葯殘留是指動物產品的任何可食部分所含獸葯的母體化合物及，或其代謝物，以及與獸葯有關的雜質的殘留。獸葯殘留既包括原葯也包括葯物在動物體內的代謝產物。主要的殘留獸葯有抗生素類、磺胺葯類、呋喃葯類、抗球蟲葯、激素葯類和驅蟲葯類。獸葯通常是通過在預防和治療動物疾病用葯、在飼料添加劑中使用以及在食品保鮮中引入葯物而帶來對食品的污染。人長期攝入含獸葯的動物性食品後，不但會對人體產生毒性作用，出現過敏反應，而且動物體內的耐葯菌株可傳播給人體，當人體發生疾病時，就給臨床上感染性疾病的治療帶來一定的困難，延誤正常的治療。另外有些殘留物還具有致畸、致癌、致突變作用。
Verheijen利用膠體金標記純化的抗鏈黴素單克隆抗體，對鏈黴素的檢測限為160ng/ml，檢測方便快速，不需要其他試劑和儀器，時間僅需lOmintl41。而使用膠體金免疫層析試紙條，在檢測蝦肉等組織試樣中殘留氯黴素(chloramphenicol，CAP)殘留時，靈敏度可達到 lng/ml，只需5～10min，並且與類似物沒有交叉反應。Yong Jin等也使用金標法來檢測動物血漿和牛奶中的新黴素殘留，其檢測限為10ng/mltl6J。鹽酸克倫特羅即β2受體興奮劑，俗稱「瘦肉精」能增強脂解和減慢蛋白質分解代謝，若在畜牧生產中使用，可明顯提高飼料轉化率和瘦肉率；但使用劑量過大，則會對動物和人(間接)的肝臟、腎臟等器官產生嚴重的毒副作用。盡管歐盟於1996年禁止在畜牧生產中使用該葯(EC Direc． tive 96/22/EC)，我國農業部也於1997年明令禁止，但國內「瘦肉精」中毒事件時有發生。劉見使用金標試紙法快速檢測檢測鹽酸克倫特羅，最小檢測量達到40ng/ml。現在商品化的試紙條產品現在也比較成熟，比利時UCB Bio-procts公司開發的Tlhe Beta STAR檢測法就是將特定的β-內醯胺受體固定在試紙條上，用膠體金有色微粒作為標記物，5min內可以檢測到青黴素和頭孢黴素殘留。而國內的劉平在用生物電化學感測器檢測牛奶中殘留的青黴素時，認為使用納米金將有助於提高感測器的檢測限。
2.2 動物傳染病
動物傳染病不但會影響動物養殖經濟，也對人類健康構成威脅，聯合國糧農組織和世界衛生組織已把預防和控制嚴重的動物流行病作為其工作重點之一。蝦白斑病毒(white spot syndrome virus，WSSV)是阻礙蝦養殖業發展的主要因素，至今還沒有有效的葯物，所以及早檢測出病毒，顯得尤其重要。Wang Xiaojie等已成功研究了斑點免疫金滲濾法(DIGFA)t19~和金標試紙法來檢測蝦白斑病毒，其中金標試紙法的檢測限為1 μg/ml，而使用銀增強，可以達到0．0lμg/ml。賴清金等使用金標試紙條來檢測豬瘟病毒，10～15min就能檢出結果，並可根據檢測結果合理指導豬瘟免疫和建立適宜的免疫程序。禽流感病毒(AIV)是引起禽類急性死亡的烈性、病毒性傳染病，而且能感染人，我國許多地區也先後報道有高致病性禽流感的發生，給養禽業造成了重大的經濟損失，也嚴重威脅了人類的健康。劉永德等將兔抗禽流感H5、H9亞型病毒抗體純化後，分別與制備的膠體金研製成免疫金探針，用改良的滲濾法安全快速地檢測被檢材料中禽流感H5、H9亞型病毒，3min即可得到結果，檢測靈敏度分別為1．62ug/ml和1．25μg/ml。
2.3 農葯殘留
農葯殘留分析的困難包括：樣品基質背景復雜、前處理過程繁瑣，需要耗費較多的時間、被測成分濃度較低、分析儀器的定性能力受到限制、儀器檢測靈敏度不夠等一系列問題，但使用金標記的快速檢測可以很好的解決以上問題。國內的王朔分別使用納米金免疫層析和納米金滲濾法檢測西維因的殘留，整個檢測過程只需5min，檢測限也分別達到100ug/L和50μg/L。國內的生物技術公司也開發出了成熟的商品化產品，如克百威農殘速測試紙條等。
2．4 致病微生物檢測
目前基於金標記的快速檢測研究在致病微生物方面比較多，檢測的種類也比較多。最早Hasan以免疫磁性分離技術為基礎的免疫膠體金技術已成功應用於01群霍亂弧菌(Vibriocholerae)的檢測。國內洪幫興等人研究了以硝酸纖維膜為載體納米金顯色的寡核苷酸晶元技術，為在分子水平快速簡便的鑒別致病菌提供了可能，甚至可以檢出致病菌的耐葯性變異。該晶元技術對大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌、變形桿菌、單核細胞增生李斯特菌、蠟樣芽孢桿菌、肉毒梭菌和空腸彎麴菌等10種(屬)具有高靈敏度和特異性，檢出水平可達10CFU/mlt251。殷涌光等在使用集成化手持式Spreeta TM SPR感測器快速檢測大腸桿菌時，引入膠體金復合抗體作為二次抗體大幅度增加質量，進一步擴大了檢測信號，同時延長膠體金復合抗體與微生物的結合過程，使檢測信號進一步穩定與放大，從而顯著提高了檢測精度，使該感測器對大腸桿菌的檢測精度由10 6 CFU/ml提高到10 1CFU/ml。金免疫滲濾法重要的食源性致病菌之一大腸埃希氏菌0157：H7，目前的檢測通常先以山梨醇麥康凱瓊脂(sMAC)進行初篩，然後用生化和血清學試驗做鑒定，一般需要24～48h，而採用膠體金免疫滲濾法檢測卻非常的簡便，在很短時間即可得到結果。
在致病菌快速檢測中金標試紙條的研究越來越廣泛。謝昭聰等應用膠體金免疫層析法檢測水產品中霍亂弧菌的研究中，增菌液霍亂弧菌含量為1CFU/ml，通過增菌12h後，即可應用膠體金免疫層析法診斷試劑檢出，而一般水產品霍亂弧菌檢測所採用的傳統常規方法，檢測時限長，增菌培養需8～16h，分離培養需14～20h，初步報告需30h以上，實際操作中，需要3d以上才能出報告。腸桿菌科的大屬沙門氏菌可引起人的沙門氏菌性食物中毒，王中民等人採用免疫滲濾法可檢出85%的引起食物中毒的沙門氏菌，靈敏度為2．4×107CFU/ml，對最常見的鼠傷寒、豬霍亂和腸炎沙門氏菌，檢出率達100%，而採用膠體金免疫層析法的靈敏度為2．1×106CFU/mlt30j。被美國列為七種主要食源性致死病菌之一的李斯特菌，如果按照傳統的分離培養和鑒定技術需要l～2周時間，而採用免疫膠體金層析法只需10min就能得到檢測結果，靈敏度達到87．5%。
2．5 真菌毒素的檢測
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌(Fungi)產生的具有毒性的二級代謝產物，廣泛存在食品和飼料中，人類若誤食受污染的食品，就會中毒或誘發一定疾病，甚至癌症。檢測食品中的真菌毒素常用理化方法或生物學方法。但理化法需要較昂貴的儀器設備，操作復雜。而運用免疫技術檢測真菌毒素敏感性高，特異性強，非常適用於食物樣品的檢測。D．J．Chiao等使用金標免疫層析法在10min之內即可檢測50ng/ml的肉毒桿菌毒素B(BoNT/B)，如果使用銀增強則其檢測限可以達到50pg/ml，而且對A、E型肉毒桿菌毒素沒有交叉反應。貉麴黴毒素是麴黴屬和青黴屬產生的一類真菌毒素，其中毒性最大、與人類健康關系最密切、對農作物的污染最重、分布最廣的是赭麴黴素A(OTA)，賴衛華等研製的赭麴黴毒素A快速檢測膠體金試紙條，檢測限達到了10ng/mlt331，遠遠低於目前我國對赭麴黴毒素的限量要求5μg/L。黃麴黴毒素B z的快速檢測國內也有很多研究，孫秀蘭研製的黃麴黴毒素B，金標免疫試紙條，其最低檢測限達到2．5ng/ml，而且能定性或半定量檢測食品中的黃麴黴毒素B，含量。
小 結
隨著科學技術的不斷發展，食品分析檢測技術也在不斷地更新、完善和迅速發展，尤其是快速檢測技術更能適應現代高效、快速的節奏和滿足社會的要求。儀器分析法可以保證數據的精確性和准確性，但其流程仍比較煩瑣。盡管以納米金為標記物的免疫分析法及其它速測技術的開發過程需投入較多資金和較長時間，但具有簡單、快速、靈敏度高、特異性強、價廉、樣品所需量少等優點，其靈敏度與常規的儀器分析一致，適合現場篩選，而且其中的金免疫層析技術正在向定量、半定量檢測和多元檢測的方向發展，更加體現出金標技術的優勢。總之，快速檢測技術的快速、靈敏、簡便等優點，使之在食品衛生檢疫和環境檢測中有著廣泛的應用價值和發展前景。

應用領域
食品、玻璃、生物體的著色劑。
用於遺傳基因的鑒定技術。
用於環境凈化產品的提煉。
用於食品、化妝品的防腐劑。
加入到化妝品中起到美白、抗衰老、潤膚的作用。
生產抗菌、抑菌、消炎類葯品，醫療器械，保健用品，美容護理器械。
生產與人們生活息息相關的各類生活日用品、食品、飲品等。如納米金香皂，牙刷，各種美容面膜。