同源重組方法如何設計引物

❶ 引物設計原則

引物設計有 3 條基本原則：

• 引物與模板的序列要緊密互補。

• 引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構。

• 再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。

❷ 如何設計引物

2.在框中粘貼入你的原始序列(要比你要擴的目的片段兩端延伸一點) 3.在框的下方有許多可以設定的限制條件,如片段長度,一定包含的片段位置,引物長度,引物退火溫度等,你可以進行設定 4.點擊"pickup primers"就會出現下一頁,上面會列出多種設計，一般來說，第一對引物是最適合的。 同時引物設計和選擇目的DNA序列區域時可遵循下列原則： (1) 引物長度約為16-30bp，太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費,且難以合成。 (2) 引物中G+C含量通常為40%-60%,可按下式粗略估計引物的解鏈溫度 Tm＝4(G+C)+2(A+T). (3) 四種鹼基應隨機分布，在3'端不存在連續3個G或C,因這樣易導致錯誤引發。 (4) 引物3'端最好與目的序列閱讀框架中密碼子第一或第二位核苷酸對應, 以減少由於密碼子擺動產生的不配對。 (5) 在引物內, 尤其在3'端應不存在二級結構。 兩引物之間尤其在3'端不能互補, 以防出現引物二聚體, 減少產量。兩引物間最好不存在4個連續鹼基的同源性或互補性。 (7) 引物5'端對擴增特異性影響不大, 可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等. 通常應在5'端限制酶位點外再加1-2個保護鹼基。 引物不與模板結合位點以外的序列互補。所擴增產物本身無穩定的二級結構, 以免產生非特異性擴增,影響產量。 (9) 簡並引物應選用簡並程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡並性。否則可能由於產量低而看不見擴增產物。

❸ 如何設計含attb位點的pcr引物

使用Multisitegateway技術構建載體的方法 Multisite gateway 實驗步驟如下 設計含有attB位點的PCR引物建議使用Vector NTI Advance 軟體來設計含有attB和attBr的引物。 上游引物必須同時滿足以下條件 含有2225 bp的attB位點 至少1825 bp的模板或插入片段特異性的序列 multisitegateway引物序列的特異性 Fig specificsequences Multisitegateway 下游引物的設計也需滿足以上三個條件。 因為我們要在E coli 體內表達蛋白 所以設計上游引物時 要在attB位點之前加上SD Shine Dalgarno 序列來保證翻譯的准確性。同時為了保證閱讀框的正確性 需要在attB位點之前加上兩個核苷酸 但不能是AA AG和GA 因為它們會和attB位點末端的胸腺嘧啶核苷酸T形成終止密碼子。 得到PCR產物並電泳檢測PCR程序設置和電泳方法同上 需要指出的是 若PCR的模板是包含卡那抗性基因 kanamycin resistance gene 的質粒 需要在電泳檢測和純化PCR產物前對其進行消化 使用的酶是Dpn 作用是為了去除模板對後續反應的干擾。 消化的體系和過程 在50μl的PCR反應體系中 加入5 μl10X REact Dpn37 孵育15 min 65 熱激15 min使Dpn BP反應得到entryclone 反應體系如下 BP反應的引物組分Table BPreaction Components Sample Negative control positive control attB PCR proct 20 50 fmoles pDONRTMvector 150 ng pMSGW control plasmid 100 ng TEBuffer pH 其中攜帶attB位點的PCR產物的量可以用以下公式來計算 50 fmoles 2500 bp 660 fg fmoles ng106fg 82 PCRproct required 實驗步驟如下 按上面計算方法和反應體系加入合適體積的pDONRTMvector 和PCR產物 20冰箱里拿出BP Clonase II enzyme mix 放在冰盒上兩分鍾左右使其解凍。 輕輕渦旋BP酶兩次每次兩秒鍾 BPClonaseII enzyme mix 並立即將其送回 20 冰箱里 樣品輕輕渦旋幾次使其混合均勻。 25孵育1 蛋白酶K37 孵育10 min。 之後進入轉化環節後續實驗流程同經典載體構建 最終得到含有attL位點的entry clone。 LR反應組分Table LRreaction Component Sample Negative Control attL4 attR1entry clone 10 fmoles attL2entry clone 10 fmoles attR2 attL3entry clone 10 fmoles pDEST R4 R3 Vector II 20 fmoles TEBuffer pH 使用Infusion方法快速大量構建載體的方法 fusion是一種不依賴於限制性內切酶Restriction Free 的克隆方法 引入此方法的最初動機是為了在一個載體的任意位置引入外源DNA片段。此方法基於DNA片度的擴增
得到的大量的DNA可以作為線性載體擴增的模板。這個方法可實現將多個不同的外源基因同時插入某一個特定的載體的任意我們感興趣的位置 從而彌補了位點特異性重組系統中對特異位點和特殊系統的需求 為分子克隆和蛋白表達的調控提供廣闊的思路和方法。這種方法的原理是DNA片段之間的同源重組 現在應用比較廣泛的是由Clontech公司提供的In FusionTM system
它可以實現以下克隆需求 同時克隆多個DNA片段 Simultaneous cloning 基因的替換 Gene replacement 多位點突變 Multisite mutagenesis 多組分重組 Multi componentassembly 同時插入和刪除基因 Simultaneous insertionand deletion 引物設計及目的基因片段擴增該方法的原理和步驟同前in fusion PCR 只是這個方法中PCR產物需用Dpn 將模板消化。
載體線性化載體線性化的方法既可以用特異性酶切消化也可以通過常規PCR 使用PCR的方式使載體線性化消除了對特異性酶切位點的依賴和限制 同時徹底實現載體和片段之間的無縫連接 消除後續由於特殊鹼基序列的加入對實驗結果的影響 同時大華 35大節省了時間和成本投入。
fusion「連接」反應將純化的DNA片段和載體按照2 1的摩爾比混合入250 EP管中必要時可以加入In fusionTM enzyme 由Clontech提供 和相應buffer 是反應總體系為10 μl。之後共同轉入感受態細胞 進入篩選環節。 感受態細胞的制備在線蟲載體構建的整個過程中 最重要的實驗材料是各種促進反應進行的酶和高轉化效率的感受態細胞。不同的載體因其攜帶篩選基因或者特異表達的宿主的不同 需要諸如DH5α、TOP10等不同類型的感受態細胞 例如在Multisite gateway反應中 通常需要藉助ccdB的篩選機制 這種情況下就不能使用攜帶有ccdA基因的菌株 如TOP10F』 。
所以 在不同方法的構建中 要嚴格選擇感受態細胞類型。以下以實驗室常用的感受態細胞DH5α為例 詳述用氯化鈣 CaCl2 法的制備過程。 用CaCl2法制備感受態細胞的原理是通過低滲的CaCl2溶液在低溫 時處理快速生長的細菌從而得到感受態菌株細菌外形膨脹為球形 這樣的形態結構有利於外源DNA分子形成抗DNA酶的羥基 鈣磷酸復合物 這種復合物會粘附在細菌表面 如果熱激 細胞對DNA的吸收將大大加強。 實驗的關鍵是選取出於對數生長期的菌株 所有的操作必須盡可能保持在完全無污染無雜菌並且低溫的條件下進行。
實驗材料及准備事項 100ml 胰化蛋白腖 CaCl2的制備稱取22 CaCl2溶於200ml事先滅菌的水中 充分溶解後保存於4 冰箱中。
將濃度為100的甘油120 高溫滅菌。 器材10 ml移液管 需滅菌玻璃大培養皿 內鋪一張濾紙 需滅菌大、中、小槍頭各一盒 需滅菌 50 ml離心管 mlEP管 用鐵飯盒滅菌 100 ml SOB培養基需40個EP管 步驟如下 80冰箱里取出DH5α 常溫使其凍融後通過接種環接種細菌與無抗培養皿中。將培養板放入3 將預先水浴鍋滅菌的15ml離心管放在超凈台中 紫外照射半個小時以上。從培養皿上挑取單個菌落 接種至離心管中 導入3 ml無抗培養基LB 37 搖床振盪過夜培養 轉速為300 rpm 。次日取1 ml菌液接種至100 ml LB培養基中 以215 rpm的轉速37 培養2 3小時。期間 要每隔半個小時測定一下600 nm的OD值。 停止培養將燒瓶置於冰上10 15分鍾 同時將預先滅好菌的50 ml離心管也置於冰上冷卻至0 在超凈台中將菌液盡可能平均的分裝入兩個50 ml離心管中 以4000 rmp的轉速離心10分鍾。 棄上清將離心管倒置在濾紙上1分鍾 以吸干殘留的培養基。每個離心管中加入5 ml預冷的濃度為0 1M的CaCl2溶液 重懸菌體 並開始計時 可以用移液槍輕輕反復吹打30分鍾。 將懸浮好的菌液再次以4000rmp的轉速離心5分鍾 去掉上清 吸干殘余培養基後 每管加入2 ml預冷的濃度為0 M的CaCl2溶液反復吹打以重懸菌體 此時可以將兩個離心管合為一個 放於冰上預冷20分鍾 這期間 可以將已滅菌的1 mlEP管放於冰上預冷。 加入500 μl濃度為100 的甘油 mlEP管中。等全部分裝完成時 投於液氮中1個小時 之後再轉移到 80 冰箱中。 細菌轉化效率的檢測方法 設置陽性對照和陰性對照 陽性對照是為了估算細菌的轉化效率 陰性對照是排除感受態細胞被污染的可能 及查明失敗的可能因素。 陰性對照 只將感受態細胞塗於含某種抗性的平板上 而不加入任何DNA 正常情況下不應該有單菌落出現。 陽性對照 選擇標准質粒 一般是pUC19 以50 pg、100 pg的量分別轉化到感受態細胞里 將平板放於37 培養箱里過夜培養。數單菌落的個數以估計感受態的轉化效率。
效率估算公式為 轉化率 1000克隆 10pg DNA 當此值達到1 106時 可滿足一般克隆的實驗需求 當此值達到1 107時 可用作更復雜克隆的構建需求。 線蟲的顯微注射通過將外源基因顯微注射到雌雄同體的線蟲的性腺 gonad 能夠獲得有種系特異性的線蟲。DNA片段可以通過染色體之間的同源和非同源的整合被傳遞到下一代中。顯微注射的步驟如下 製作Pad將配置好的2 的瓊脂糖放在水浴鍋內防止其凝固。吸取100 μl於干凈的載玻片上 並迅速將另一塊載玻片輕壓上面 待瓊脂糖稍微乾燥時取走載玻片 標記Pad的正反面之後放於乾燥箱 80 中過夜。
拉制電極常常用含有內芯的硼硅玻璃微電極作為注射用電極 該電極的外徑為1 nm內徑0 75 nm。用拉制儀拉制好的電極尖端是封閉的 在用之前需要打開一個開口 開口的大小要適宜。
准備注射液注射液的體系一般選取10 目的載體質粒的濃度范圍為110 μl。其餘體積用1TE補平。以12 000 rpm轉速離心3分鍾。 吸取1μl注射液到拉好的電極中 放置1520分鍾 目的是為了使注射液通過內芯的虹吸作用流入電極尖端 並排除內氣泡。 拿出注射要用的Pad在上面滴一滴油 保證有足夠的油使線蟲減慢乾燥的過程 但不能太多以使其移動。 用一個干凈的針needle 觸碰到油上面 挑取N2時期的成蟲 線蟲挑取的區域應該遠離菌斑所在位置 以避免將菌落帶到pad上面。選擇有容易辨別的gonad的線蟲也同樣重要。將線蟲垂直放在pad上 使其gonad位於左側 通常 線蟲的陰部 vulva 會指向與needle的方向 兩側的gonad會直接與體壁對應。 當needle恰好位於載玻片上時將線蟲聚焦在10 的物鏡下 確定看到線蟲的gonad。將線蟲以和needle成15 到45 的角度擺放 通過輕輕降低needle使其和線蟲出於同一水平。轉換到40 物鏡 聚焦到胞體的gonad 使用調試器上下移動needle 直到針尖對准胞體的gonad。 輕輕沿著needle移動線蟲當needle插入線蟲體內時 按照gonad和蟲體壁處於相反位置的方式輕輕壓線蟲。輕旋調節器 knob 開始DNA注射液的流入 快速的開合 如果needle確定位於gonad處 此處部位會膨脹並充滿液體。如果液體流動不暢 輕輕觸碰桌面有助於解決此問題。要避免因加入液體過多導致液體沿著needle進入部位流散到線蟲的其他部位。 將needle從線蟲中拿出建議沿著逆時針方向。回到10 物鏡下 滴一滴M9 buffer使線蟲懸浮。使用眉毛挑將線蟲放置於另外一個含有M9 buffer的板子上。這樣做的目的是為了洗掉多餘的油。再將線蟲挑到含有細菌的板子上。一個板子上可以放置多條注射後的線蟲。
兩三天後 數F1轉基因線蟲 並將折射成功的線蟲單獨轉移到板子上以得到有穩定轉基因種系的線蟲。 顯微注射線蟲的gonadFig elegansgonad 3910 可能出現的問題及策略 注射後線蟲破裂或者死掉的原因可能是needle太大了 或者線蟲缺水死亡 方法可能是每注射一個線蟲的gonad就換一個新的needle 如果線蟲沒有直立 原因可能是pad太薄或者需要沒烘乾 可以通過將板子放在罩子上幾個小時來烘乾 如果線蟲乾的太快 可以使用更薄的pad或者在注射前將線蟲轉移到較濕的板子上。 實驗結果與討論實驗中用到的質粒的構建方法 在前言部分和方法部門已做了詳細闡述 需要研究的相關基因的啟動子的信息 諸如啟動子大小 表達部位等 藉助於相關文獻的報道 在Wormbase中截取特定長度的DNA序列 在NCBI中查找此基因的上下游序列和基因方向 藉助網頁UCSC提供的序列信息最終得到啟動子序列。但在設計啟動子引物時 必須留意到序列中3』端和5』端的序列可以根據引物的匹配性在小范圍內適當調整。還有一些神經元的位置因為缺乏確切表達譜的啟動子而無法最終確定。
線蟲有302個神經元 標記這些神經元需要大量的質粒構建。在實驗初期 我們通過傳統酶切連接方法和改造的常用線蟲載體組成的BP反應來實現。但隨著課題的發展和方法的改進 我們發現Multisite gateway方法更為便捷和高效 特別是在購買了雌雄同體線蟲啟動子庫後 這種技術不僅被用來標記線蟲神經元 更多的用在rescue實驗和鈣信號的測定的構建中。同時 為了使整個課題有一套完整的體系 我們又花費大量的精力將之前不太標準的由gateway反應得到的構建進行了改造 得到一個可以通用的表達體系。 改造Multisitegateway 中的載體pDESTR4 R3為pPD49 26 R4 R3 在使用Multisite gateway 技術構建多克隆載體的過程中 我們發現 這個系統並不是完美的
因為這個系統中各個重組位點的序列有一定的相似性 所以如果想要插入載體的片段的序列 特別是與引物匹配的那一段 與重組位點有相似性時 可能會導致這個技術中所涵蓋的反應失敗。同時 當我們想用一個啟動子驅動不止兩個以上基因的表達時 不能直接只用Invitrogen公司提供的試劑盒中的pDESTR4R3 因為外源基因在線蟲體內表達時 需要3』UTR穩定整個翻譯過程中的順利進行 但該公司試劑盒提供的載體中不含我們需要的3』UTR 因此 我們改造了一個新的LR反應的載體pPD49 26 R4R3 因為pPD49 26中含帶unc54 3』UTR 而且實驗證華 41明我們改造的載體同樣有很高的反應效率 1在Multisitegateway反應中驗證pPD49 26 R4 R3的有效性 Pgpa 4特異性標記ASI神經元 可以驅動TagRFP t在此神經元中表達。 為明場與熒光共定位的圖。Fig pPD4926 R4 R3 LRreaction multisitegateway ASI can 改造attL1Promoter attL2為attL4 promoter attR1 驗證adaptor clone 如前所述 我們將攜帶attB1 attB2位點的啟動子進行改造得到了標准Multisite gateway反應中的第一個entry clone 在這個改造的過程中 需要引入一個中間反應物 adaptor clone。如果我們可以觀察到改造後的啟動子能夠驅動熒光蛋白在特定部位表達 由此可以驗證adaptor clone的有效性。在本課題中 我們使用改造後的啟動子Pdaf 7驅動熒光蛋白在神經元ASI里表達 由此adaptor clone的有效性得到驗證。

❹ 設計引物時同源臂怎麼加

用PCR擴的時候就把同源重組片段引入，vector酶切後 5'端選15nt，3'端選15nt分別加到正向引物和反向引物上，就做成了同源臂。

同源序列是指在同一物種不同個體間或不同物種間相同或相似的DNA序列，而同源臂是指一段同源序列，類似於tRNA氨基酸臂的結構，所謂臂，指的是手臂樣結構。

弓|物是人工合成的兩個寡核苷酸序列:一個引物與靶區域-端的一條DNA模板鏈互補,另一個弓|物與靶區域另一端的另-條DNA模板鏈互補,其功能是作為核苷酸聚合作用的起始點,核酸聚合酶可由其3端開始合成新的核酸鏈。

好的引物會讓PCR實驗成功一半，因而，引物設計一直都是PCR非常重要的環節。PrimerPremier5和Oligo7這兩款軟體想必是備受科研汪們推崇的引物設計軟體。

引物設計簡介：

引物設計是一小段單鏈DNA或RNA，作為DNA復制的起始點，在核酸合成反應時，作為每個多核苷酸鏈進行延伸的出發點而起作用的多核苷酸鏈，在引物的3′-OH上，核苷酸以二酯鏈形式進行合成，因此引物的3′-OH，必須是游離的。

❺ 關於同源重組進行基因敲除PCR的引物設計

提取細胞總rna然後用試劑盒反轉錄成cdna，用cdna作為模板擴增基因的cds區，然後想要轉染進細胞中。比如myod1基因，首先在ncbi找到它的mrna序列，然後找到它的cds序列，全部復制下來，在primer
5.0
中。正向引物直接從cds的第一個核酸開始（比如18bp），反向引物從cds最後一個核酸開始，向前選擇序列（比如17bp），調節2個引物的長度（不一定要一致），盡量避免錯配，二聚體，產生錯的產物即可。最後在引物的5『端添加酶切位點以及保護鹼基。

❻ 同源重組中引物的設計為什麼需要設計兩端引物

看你准備用什麼系統來做敲除了。原則上，不同系統對於同源臂長度要求不同，根據這個來設計引物。做敲除一般啟動子等元件無需考慮

❼ 同源重組的引物一般要什麼純化方法

C18脫鹽、RPC純化、PAGE純化、HPLC純化。
拓展：
HPLC()是使用高效液相色譜的原理，依據DNA的疏水性來分離產物的。合成粗產物中不同長度的DNA片段的疏水性不同，一般來說較長的片段具有較強的疏水性，AT含量高的片段也具有較強的疏水性。先將粗產物檢測主峰位置，再增加加樣量，回收主峰位置的部分。該方法用於分離純化時能達到很高的純度和靈敏度，可以有效的去除大部分N-短片段，因而可以除去失敗序列或未結合的標記物，從而對DNA片段進行純化。同時配合質譜對DNA進行定性分析，以保證回收片段的正確性。由於HPLC產品的純度非常高，使用本法純化的DNA製品可適用於各種基因工程實驗。主要用於PCR克隆、定點突變、人工合成基因、長鏈和修飾引物的純化等。它的優點是自動化程度高、省人力；弱點是純化量通量小、成本較高。

❽ 如何設計引物

一般是通過設計軟體，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟體下載和使用說明，是比較容易的。
至於設計引物的一般原則如下：
*
序列選取應在基因的保守區段
*
避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
*
典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
*
Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
*
引物之間的TM相差避免超過2℃
*
引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
*
為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
*
Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
*
引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

❾ 怎樣設計引物

一般是通過設計軟體，例如oligo6，primer5等，你可以在網上搜一下引物設計軟體下載和使用說明，是比較容易的。
至於設計引物的一般原則如下：
* 序列選取應在基因的保守區段
* 避免引物自身或與引物之間形成4個或4個以上連續配對，避免引物自身形成環狀發卡結構
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* Tm值在55－65℃（因為60℃核酸外切酶活性最高），GC含量在40%－60%
* 引物之間的TM相差避免超過2℃
* 引物的3』端避免使用鹼基A，引物的3』端避免出現3個或3個以上連續相同的鹼基
* 為避免的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子。
* Taqman探針PCR要求片段長度在80bp－150bp
* 引物末端（最後5個核苷酸）不能有超過2個的G和C。

❿ 同源重組設計引物後，怎麼把一個連接有載體的目的

t載體沒表達載體需要酶切位點要重新設計帶酶切位點引物PCR擴增t載體酶切並連表達載體t載體需要酶切位點直接酶切收目片段連接表達載體