連接dna的方法

⑴ .有哪些方法可以使外源DNA與載體DNA相連接比較它們的優缺點

外源DNA片段和線狀質粒載體 的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞後可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下沉反應條件下，它就能有效地將平端DNA片段連接起來。

⑵ DNA的片段之間有哪些連接

（1）具互補黏性末端片段之間的連接：連接反應可用emphasis：role=italicE.coliemphasis：DNA連接酶，也可用T4：DNA連接酶。待連接的兩個DNA片段的末端如果是用同一種限制性內切核酸酶酶切的，連接後仍保留原限制性內切核酸酶的識別序列。如果是用兩種同尾酶酶切的，雖然產生相同的互補黏性末端，可以有效地進行連接，但是獲得的重組DNA分子往往消失了原來用於酶切的那兩種限制性內切核酸酶的識別序列。

（2）具平末端DNA片段之間的連接：連接反應必須用T4：DNA連接酶。只要兩個DNA片段的末端是平末端的，不管是用什麼限制性內切核酸酶酶切後產生的，還是用其他方法產生的，都同樣可以進行連接。如果用兩種不同限制性內切核酸酶酶切後產生的平末端DNA片段之間進行連接，連接後的DNA分子失去了那兩種限制性內切核酸酶的識別序列。如果兩個DNA片段的末端是用同一種限制性內切核酸酶酶切後產生的，連接後的DNA分子仍保留那種酶的識別序列，有的還出現另一種新的限制性內切核酸酶識別序列。

（3）DNA片段末端修飾後進行連接：待連接的兩個DNA片段經過不同限制性內切核酸酶酶切後，產生的末端未必是互補黏性末端，或者未必都是平末端，因此無法進行連接。在這種情況下，連接之前必須對兩個末端或一個末端進行修飾。修飾的方式主要是採用核酸外切酶Ⅶ（exonuclease：Ⅶ，Exo：Ⅶ）將黏性末端修飾成平末端；採用末端脫氧核苷酸轉移酶（簡稱末端轉移酶）將平末端修飾成互補黏性末端。有時為了避免待連接的兩個DNA片段自行連接成環形DNA，或自行連接成二聚體或多聚體，可採用鹼性膦酸酯酶將其中一種DNA片段5′-P修飾成-OH。

（4）DNA片段加連桿後連接：如果要連接既不具互補黏性末端又不具平末端的兩種DNA片段，除了上述用修飾一種或兩種DNA片段末端後進行連接的方法外，還可以採用人工合成的連桿（linker）或銜接頭（adaptor）。先將連桿連接到待連接的一種或兩種DNA片段的末端，然後用合適的限制性內切核酸酶酶切連桿，使待連接的兩種DNA片段具互補黏性末端，最後在DNA連接酶催化下使兩種DNA片段連接，產生重組DNA分子。此外，也可以根據兩DNA片段的末端，選用合適的銜接頭直接把兩DNA片段連接在一起。

⑶ DNA分子中磷酸、脫氧核糖和含氮鹼基的連接方式

連接方式：

脫氧核糖是一個環狀五碳糖，碳原子編號1'-5'。每個脫氧核苷酸中，1'碳與含氮鹼基相連，5'碳與磷酸相連。脫氧核苷酸間則通過一個脫氧核苷酸中脫氧核糖上面3'碳與另一個脫氧核苷酸中5'碳上的磷酸相連。

⑷ 分子克隆中常用的連接方法

方法：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

基因克隆是一個比較直觀而簡單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學意義，是因為這一技術可以為我們提供一個純粹的基因標本。

通常，一個基因總是和細胞里其他基因同在。基因克隆技術誕生之前，我們根本無法純化單個基因，這意味著我們只能對基因群、而不是特定基因的結構與功能進行研究和開發利用。

重要意義與應用

分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開辟了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對於工業、農牧業和醫學產生深遠影響，並將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。

⑸ dna的兩條脫氧核苷酸鏈由什麼連接

dna是雙鏈結構，兩條鏈之間通過鹼基互補配連在一起，而互補的鹼基之前就是通過氫鍵連接，所以連接兩條脫氧核苷酸的是氫鍵，而每一條脫氧核苷酸鏈相鄰的兩個脫氧核苷酸才是通過磷酸二酯鍵連接的

⑹ 平末端DNA的連接方法

用taq酶在72°反應半個小時，末端加A，然後用T載體進行連接克隆

⑺ 基因的不同黏性末端要怎樣連接

不同的黏性末端原則上無法直接連接，但可將它們轉化為平頭末端後再進行連接，所產生的重組分子往往會增加或減少幾個鹼基對，並且破壞了原來的酶切位點，使重組的外源DNA片段無法回收；若連接位點位於基因編碼區內，則會破壞閱讀框架，使之不能正確表達。

不同黏性末端的連接有四種類型：①待連接的兩種DNA分子都具有5′突出末端。在連接反應之前，兩種DNA片段或用Klenow酶補平，或用S1核酸酶切平，然後進行連接。前者產生的重組分子多出4對鹼基，而後者產生的重組分子則少去4對鹼基。一般情況下大多使用Klenow酶補平的方法，因為S1核酸酶量如果掌握不好，容易造成雙鏈DNA的降解反應；

②待連接的兩種DNA分子都具有3′突出末端。Klenow酶對這種結構沒有活性，可以用Tsubscript4subscript：DNA聚合酶將這兩種DNA的3′突出末端切除，形成平頭末端後再連接，所產生的重組分子同樣少了4對鹼基；

③一種DNA分子具有3′突出末端，另一種DNA分子攜帶5′突出末端。這種情況要求兩種DNA分子在連接前，分別進行相應的處理，若5′突出末端用Klenow酶補平，而3′突出末端用Tsubscript4subscript：DNA聚合酶修平，則連接產生的重組DNA分子並沒有改變鹼基對的數目；

④兩種DNA分子均含有不同的兩個黏性末端。通常先用Klenow酶補平一種DNA分子的5′突出末端，再用Tsubscript4subscript：DNA聚合酶切平3′突出的另一末端，而且兩種DNA分子可以混合一同處理。

在有些情況下，含有不同5′突出黏性末端的兩種DNA分子經Klenow酶補平連接後，形成的重組分子可恢復一個或兩個原來的限制性內切酶識別序列，甚至還可能產生新的酶切位點，如emphasis：role=italicXbaemphasisI與emphasis：role=italicHindemphasisⅢ的黏性末端（emphasis：role=italicXbaemphasisI切點恢復）、emphasis：role=italicXbaemphasisI與emphasis：role=italicEcoemphasisRI（兩者切點均保留）以及emphasis：role=italicBamemphasisHI與emphasis：role=italicBglemphasisⅡ（產生emphasis：role=italicClaemphasisI位點）。

⑻ 分子克隆中常用的連接方法及原理

方法：DNA片段的制備、載體的選擇、片段與載體連接。在分子水平上提供一種純化和擴增特定DNA片段的方法。

原理：外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。

但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口，當雜本導入感受態細胞後可被修復。

載體DNA的選擇

質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以游離超螺旋狀存在，很容易制備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是「緊密型」；二是「鬆弛型」。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

以上內容參考：網路-分子克隆

⑼ 今日課堂作業:用同一種限制酶切割運載體和目的基因,他們有哪些連接方式

具有相同黏性末端的DNA會連接在一起。因此用同一種限制酶切割運載體和目的基因，有3種連接方式:目的基因和目的基因連接、目的基因和運載體連接、運載體和運載體連接。

⑽ DNA雙鏈是靠什麼連接

DNA雙聯依靠鹼基之間的氫鍵結合起來。
DNA包括四種鹼基，而且四種鹼基之間遵循嚴格的配對規則：Adenine（A，腺嘌呤）一定與Thymine（T，胸腺嘧啶）配對，Guanine（G，鳥嘌呤）一定與Cytosine（C，胞嘧啶）配對，反之亦然。鹼基間的這種一一對應的關系叫做鹼基互補配對原則。腺嘌呤與胸腺嘧啶之間有兩個氫鍵，鳥嘌呤與胞嘧啶之間有三個氫鍵，即A=T,G≡C。
由於氫鍵不等於化學鍵，屬於比較弱的結合，因此較低的能量就可以被打破。這樣一方面保證了DNA能夠發揮生物功能：如果結合很緊密，無法打開，那麼也就不可能完成轉錄翻譯等一系列生物功能。同時，這也意味著DNA很容易受到損傷，因為結合較弱，容易受到外界因素的干擾和破壞。