紫杉醇液相分析方法

1. 什麼植物中含有紫杉醇即如何提取

紅豆杉樹的樹皮里含有微量的紫杉醇。
從紫杉植物中提取紫杉醇的簡化方法
紅豆杉Taxus又名紫杉，也稱赤柏松，生於海拔1000～1200m處的山地，是世界上公認的瀕臨滅絕天然珍稀植物，從其根、皮、莖、葉中提取的紫杉醇taxol是目前世界上最有效的抗癌葯物之一。全球每年大約需要1500～2500kg紫杉醇，而1 kg樹皮僅能提取50～100mg。 10-脫乙醯巴卡亭Ⅲ又稱10-脫乙醯基漿果赤黴素Ⅲ，10-deacetylbaccatinⅢ，10-DABⅢ為有抑制腫瘤作用的紫杉烷二萜類化合物。Bissery等報道，可利用10-DABⅢ合成具有比紫杉醇更高抗癌活性的多烯他賽docetaxel。紫杉醇主要存在於樹桿和樹皮中，10-DABⅢ主要存在於樹葉中，其含量大大高於紫杉醇的含量。 紅豆杉是國家珍稀保護植物，生長緩慢，如果直接從紅豆杉樹皮中提取紫杉醇，不僅資源有限，而且不利於資源保護。以10-DABⅢ為原料採用酶催化半合成工藝方法來制備紫杉醇，可大大簡化合成過程，使紫杉醇骨架修飾所需步驟更少，操作更簡單，提高了紫杉醇合成的選擇性和生產率，進而為在更大規模上進行紫杉醇生產提供了技術支持，最終使紫杉醇的化學合成半合成的產業化有了實現的可能。
目前文獻報道從各種紫杉植物中提取紫杉醇的方法，均需經過繁冗的分離過程。本實驗採用了一種適合於以各種紫杉植物樹葉或樹枝做原料，通過極性梯度溶劑萃取的方法逐步脫除大量不相干雜質，得到合成紫杉醇的前體10-DABⅢ的方法，然後通過反相層析柱加成，即可獲得抗癌活性成分紫杉醇； 材料與方法 1 材料與儀器
南方紅豆杉Taxus mairei枝葉取自浙江寧海紅豆杉種植基地，8年樹齡。10-DABⅢ對照品為Sigma公司產品，純度98％；所用甲醇；乙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、氯仿、正己烷、石油醚、乙腈等均為分析純試劑。JJ一1精密增力電動攪拌儀，江蘇金壇市江南儀器廠；SENCO R一201旋轉蒸發儀，上海申順生物科技有限公司；玻璃硅膠柱為2cm×40cm，杭州常盛科教器具廠；UV一2802PC／PCS型分光光度計，UNICO上海儀器有限公司；Sigma一3K18低溫離心機4℃，轉速18000rmin；LabAlliance高效液相色譜儀美國SSI公司。
2 實驗方法
取南方紅豆杉枝葉研磨成細粉，於燥保存。稱取100g紅豆杉細粉，45℃烘乾，石油醚預處理，5L甲醇冷浸，輔以攪拌，超聲40min，反復2次。浸漬液過濾，減壓濃縮至100mL。加入75 mL正己烷萃取分液，重復操作2～3次。棄去正己烷層，萃余液旋干溶劑，製成浸膏。加入氯仿與水的混合液1：1反復提取。氯仿層減壓濃縮至10～15mL上柱，用硅膠正相色譜柱分離。分段收集洗脫液，紫外監測，收集有效段合並濃縮，在甲醇／水中重結晶。 3 分析測試方法
採用反相高效液相色譜RP―HPLC方法檢測。分析柱為Kromasil C18柱250mm×4.6 mm，5μm，流動相為乙腈-水30：70，流速為2.0 mLmin，每次進樣體積為10μl，進樣間隙用純乙腈對柱子進行梯度沖洗。紫杉醇最大吸收波長為227nm，檢測器測定波長為232nm，溫度30℃，相關數據計算均採用峰面積歸一化法。
結 果 1 預處理
由於紅豆杉枝葉中含有大量蠟質、植物色素諸如葉綠素等低極性雜質，故在提取前應首先加入低極性溶劑如正己烷、石油醚浸泡脫脂，以除去大量存在的此類非極性雜質，簡化後續操作。該法可除去紅豆杉枝葉中多達72％的極性比10-DABⅢ小且可溶於正己烷的雜質。
2 有機溶劑粗提
目前用於紫杉烷類物質提取的最普通的初級萃取劑是乙醇甲醇和水，Xu等採用的是體積比95：5的甲醇和二氯甲烷的混合物，萃取時間為35~60min；而Hoke等和Powell等都選擇的是純甲醇，所需萃取時間為16～48h。將南方紅豆杉枝葉的細粉在45℃烘乾，甲醇浸漬，攪拌過夜。在攪拌的不同時間內其提取出的10-DABⅢ的含量。可以看出，有機溶劑粗提時的浸漬攪拌時間應以12h左右為佳。
3 初級萃取

將甲醇萃取液減壓旋蒸至干，得浸膏。用10倍體積以甲醇浸膏的量為基準的純凈水分幾次全部溶解，因目標產物10-DABⅢ不溶於水，故而形成懸浮液。用石油醚或正己烷反復萃取，因目標產物不溶於非極性溶劑正己烷中，經此可基本去除極性比10-DABⅢ小的雜質。
在大多數情況下，還須對甲醇粗提物進行萃取操作。一般是在初級萃取物中加入二氯甲烷和水的混合物，即液液萃取，該方法可有效除去萃取液中50％質量比的非紫杉烷類物質。但實驗發現要嚴格掌握好甲醇、二氯甲烷、水三者的比例，否則會出現提取不徹底，在兩相中均含有目標產物，且還會有乳化現象發生。
本實驗中是採用加入氯仿／水的混合溶液 1：1將浸膏完全溶解然後進行液液萃取。操作中 應按照每次向水相中加入4～5倍體積的氯仿來進行，並輕輕振盪分頁漏斗，以避免出現嚴重的乳化現象。因實驗中發現二氯甲烷在用鹼液和水洗時不可避免嚴重乳化，造成目標產物損失難以回收，而氯仿因與目標產物極性相匹，對10-DABⅢ的溶解性更高，與水相分層界面明顯，可在更大程度上實現目標產物10-DABⅢ與極性水溶性雜質的分離。
4 重結晶
將已檢測確認的洗脫液收集，濃縮，製成浸膏。在少量乙腈中重結晶。濾出的殘渣再用甲醇／水洗滌2～3次，即可得到10-DABⅢ的晶體，烘乾，稱重，共計79.16mg。10-DABⅢ純度達到91％，該步收率可達72％。
由於單一萜類化合物在植物中含量低，需要較多分離步驟才能純化出來。因此，採用有效的提取方法和縮短分離步驟提高每步的收率是成功的關鍵。本研究利用萃取和層析方法相結合，使繁瑣的分離步驟大為縮減，工藝路線為：紅豆杉枝葉採集、粉碎，45℃烘於，石油醚預處理後用甲醇浸漬，同時輔以攪拌、超聲。然後過濾，濾液旋蒸以縮小體積，濃縮液用正己烷反復萃取之後再蒸干製成浸膏。浸膏用氯仿／水反復抽提，萃取分液，得到氯仿的抽提物再上柱細分。收集含有10-DABⅢ的洗脫段，旋蒸去除溶劑，適量乙腈溶解，進行重結晶，再用乙醇／水反復洗滌晶體，得到10-DABⅢ的純品。
本工藝中採用的南方紅豆杉樹葉中10-DABⅢ的含量經測定為在1‰，得到的紫杉醇合成的前體物10-DABⅢ純度大於90％，總收率達到7.9％，與文獻相比較說明實驗採用的原料及分離和純化工藝都是可行的。但由於本實驗目前還處於實驗室研究階段，在重結晶操作環節中尚存在一些問題，如怎樣去除殘留溶劑對重結晶的影響及晶形的改善等還都需要進一步的研究。

2. 紅豆杉中紫杉醇的提取和凈化條件

樹皮>根>其他組織含量

1,單純去雜超凈設備
2,高壓液相色譜儀及液相色譜分析拄

你應該都會用吧...

3. 紫杉醇提煉方法

色層分離提取紫杉醇紫杉醇呈白色結晶粉末，不溶於水，易溶於氯仿、丙酮等有機溶劑，是從紅豆杉樹中提
取的1種高效、低毒、廣譜、作用機制獨特的抗癌天然葯物，能夠治療卵巢癌、乳腺癌，也可用於治療肺癌、頭頸部癌、食管癌、生殖細胞腫瘤、子宮內膜癌、淋巴瘤及膀胱癌等。

國內多採用硅膠正相層析法，國外多採用大孔吸附樹脂或反相層析法。前者因負載純化量小，純化步驟多而使生產效率難以提高，且耗費大量溶劑；後者克服了前者的不足，但因大孔吸附樹脂或反相填料介質價格昂貴，且易被雜質污染，導致使用壽命很短，再生十分困難，且耗費大量溶劑，很難在大規摸生產中重復使用。
而我國採用的技術利用特殊色層分離介質，不僅回收率提高，且可使得部分非紫杉醇結構物轉化為紫杉醇。
該技術具以下優點：
1.分離純化量大；
2.載體可反復使用，並且有良好的重復性；
3.綜合成本降低40%以上；
4.整個生產純化工序僅2－3步；
5.提高了紫杉醇與其類似物（尤其是三尖杉寧鹼）的分離效率；
6.用同樣規摸的設施可使紫杉醇的生產量比用其它方法高3－5倍之多。

還有：樹皮>根>其他組織含量

1,單純去雜超凈設備
2,高壓液相色譜儀及液相色譜分析拄

4. 目前紫杉醇生物合成的主要問題

當前，人類獲得紫杉醇的方法有：1.天然提取. 2.人工合成. 3.半人工合成. 4.生物發酵. 後三種方法大都停留在實驗室階段。 （1） 紫杉醇的生物合成： 紫杉醇的分子式為：C47H51NO14是萜類環狀結構的天然次生代謝物。主要由紫杉烷環和側鏈組成。研究其生物合成，對於人為定向的提高合成效率及克隆組合，形成關鍵的酶的基因，提高紫杉醇的產量意義重大。目前的關鍵是能否找到一兩個關鍵酶的發現，並使得其基因純化和基因克隆。克隆紅豆杉基因能否突破還有待於觀察，不過人們已經找到的假想途徑，目前這些技術還處在實驗室階段。 （2）.紫杉醇的化學合成 根據研究及報道：從紅豆杉植物中分離得到的10---去乙醯漿果赤黴素Ⅲ （巴卡亭Ⅲ），顯然活性低於紫杉醇，但可以從紅豆杉針葉中提取。該物質經過四步化學過程可合成紫杉醇。為解決紫杉醇新來源途徑，取得重大進展。以NICOLAOU博士為首的美國研究小組在1994年報道通過化學方法全合成紫杉醇的結果。但化學合成從實質意義上說還沒有取得徹底的突破，目前還不具備應用價值。 （2） 紫杉醇的微生物合成 STTERLE等從短葉紅豆杉韌皮部分， 分離得到一種寄生真菌（taxo myces an dreanae）.可以在特定的培養基中產生紫杉醇及相關烴合物，但由於目前產量極低，所以還不能在生產中得到應用。重組DNA技術可望提高紫杉醇的產量。 通過研究還發現：根是除樹皮外紫杉醇含量最高的器官。人們利用發根農桿菌（agrobac terium rhizogenes ）浸然紅豆杉植物外植體誘導生根。這一辦法不需外援激素，發根生長迅速，遺傳性狀穩定而受到重視。如能把尋找合成紫杉醇或其類似衍生物，從微生物合成途徑中，定向得到關鍵酶和克隆紅豆杉相關基因結合起來，可使這一方法得到突破 具第五界北京生物醫葯發展論壇介紹，從植物中提取紫杉醇的發展過程大體情況是： 從60年代起，抗癌新葯的發現主要是從原始植物的代謝產物中尋找，就是目前正在使用的幾種抗癌化療試劑，也不是從高等植物中提取的化合物。 比如：從長春花中分離出的「長春花類生物鹼」 從盾葉鬼臼中分離得到的「表鬼臼毒素」類衍生物。 從喜樹中分離得到的「喜樹鹼類衍生物」 以至到現在的從紅豆杉中分離得到的「紫杉二帖類」成份等。 提取紫杉醇所需的相關技術和設備： 1. 用紅豆杉提取紫杉醇的關健技術及相關資料. 2. 紫杉醇含量的精度測定方法及質量標准及相關資料. 3. 去雜超凈設備. 4. 高壓液相色譜儀及液相色譜分析拄等。

5. 請問紫杉醇的檢測,一般用什麼色譜柱

紫杉醇及其注射液是2010版葯典的新增品種，規定在鑒別、相關物質、含量測定等項下均需採用液相色譜法。葯典規定的檢測方法：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-水為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為227nm。
下圖為賽分科技的BR-C18 4.6×150mm色譜柱對紫杉醇提取物的分離圖譜，從圖中可以看出雜質與目標產物紫杉醇得到良好的分離。(無法提供，抱歉）

6. 從紅豆杉中提取紫杉醇有哪些方法

當前，人類獲得紫杉醇的方法有：1.天然提取. 2.人工合成. 3.半人工合成. 4.生物發酵. 後三種方法大都停留在實驗室階段。
（1） 紫杉醇的生物合成：
紫杉醇的分子式為：C47H51NO14是萜類環狀結構的天然次生代謝物。主要由紫杉烷環和側鏈組成。研究其生物合成，對於人為定向的提高合成效率及克隆組合，形成關鍵的酶的基因，提高紫杉醇的產量意義重大。目前的關鍵是能否找到一兩個關鍵酶的發現，並使得其基因純化和基因克隆。克隆紅豆杉基因能否突破還有待於觀察，不過人們已經找到的假想途徑，目前這些技術還處在實驗室階段。
（2）.紫杉醇的化學合成
根據研究及報道：從紅豆杉植物中分離得到的10---去乙醯漿果赤黴素Ⅲ （巴卡亭Ⅲ），顯然活性低於紫杉醇，但可以從紅豆杉針葉中提取。該物質經過四步化學過程可合成紫杉醇。為解決紫杉醇新來源途徑，取得重大進展。以NICOLAOU博士為首的美國研究小組在1994年報道通過化學方法全合成紫杉醇的結果。但化學合成從實質意義上說還沒有取得徹底的突破，目前還不具備應用價值。
（2） 紫杉醇的微生物合成
STTERLE等從短葉紅豆杉韌皮部分， 分離得到一種寄生真菌（taxo myces an dreanae）.可以在特定的培養基中產生紫杉醇及相關烴合物，但由於目前產量極低，所以還不能在生產中得到應用。重組DNA技術可望提高紫杉醇的產量。
通過研究還發現：根是除樹皮外紫杉醇含量最高的器官。人們利用發根農桿菌（agrobac terium rhizogenes ）浸然紅豆杉植物外植體誘導生根。這一辦法不需外援激素，發根生長迅速，遺傳性狀穩定而受到重視。如能把尋找合成紫杉醇或其類似衍生物，從微生物合成途徑中，定向得到關鍵酶和克隆紅豆杉相關基因結合起來，可使這一方法得到突破
具第五界北京生物醫葯發展論壇介紹，從植物中提取紫杉醇的發展過程大體情況是：
從60年代起，抗癌新葯的發現主要是從原始植物的代謝產物中尋找，就是目前正在使用的幾種抗癌化療試劑，也不是從高等植物中提取的化合物。
比如：從長春花中分離出的「長春花類生物鹼」
從盾葉鬼臼中分離得到的「表鬼臼毒素」類衍生物。
從喜樹中分離得到的「喜樹鹼類衍生物」
以至到現在的從紅豆杉中分離得到的「紫杉二帖類」成份等。
提取紫杉醇所需的相關技術和設備：
1. 用紅豆杉提取紫杉醇的關健技術及相關資料.
2. 紫杉醇含量的精度測定方法及質量標准及相關資料.
3. 去雜超凈設備.
4. 高壓液相色譜儀及液相色譜分析拄等。

7. 紫杉醇的含量測定方法

色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-乙腈(23：41：36)為流動相，檢測波長為227nm。取有關物質項下系統適用性溶液10µl注入液相色譜儀，紫杉醇峰與紫杉醇雜質A峰及雜質B峰的分離度均應大於1.0。
測定法取紫杉醇標准品對照品(貴州迪大生產)約12mg，精密稱定，加置100ml量瓶中，加乙腈使溶解並稀釋至刻度，搖勻，精密量取10µl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取紫杉醇對照品適量，精密稱定，同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。
本品為天然提取或半合成制備。本品為(2S,5R,7S,10R,13S)-10,20-雙(乙醯氧基)-2-苯甲醯氧基-1，7-二羥基-9-氧代-5，20-環氧紫杉烷-11-烯-13-基(3S)-3-苯甲醯氨基-3-苯基-D-乳酸酯。按乾燥品計算，含C47H51NO14應為98.0%~102.0%。【性狀】本品為白色或類白色結晶性粉末。本品在甲醇、乙醇或三氯甲烷中溶解，在乙醚中微溶，在水中幾乎不溶。比旋度 取本品，精密稱定，加甲醇溶解並定量稀釋製成每1ml中含10mg的溶液，依法測定(附錄VI E)，比旋度為 -49.0º ~-55.0 º。【鑒別】(1)在含量測定項下的色譜圖中，供試品溶液主峰應與對照品溶液主峰的保留時間一致。(2)紫杉醇的紅外吸收圖譜應與對照的圖譜(光譜集875圖)一致。【檢查】溶液的澄清度與顏色 取本品0.1g，加甲醇10ml溶解後，溶液應澄清無色。有關物質 取本品，加乙腈製成每1ml中約含0.5mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取適量，分別加乙腈稀釋成每1ml中約含2.5µg、0.5µg的溶液，作為對照溶液⑴和對照溶液⑵；另取紫杉醇、紫杉醇雜質A(三杉尖寧鹼)與紫杉醇雜質B(7-表10-去乙醯基紫杉醇)對照品適量，用乙腈溶解並稀釋製成每1ml中約含紫杉醇0.5mg、紫杉醇雜質A與紫杉醇雜質B均為2.5µg的溶液，作為系統適用性溶液。照高效液相色譜法(附錄V D)測定，用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填

8. 液相色譜問題

兩種紫杉醇屬於兩種化合物，用液相色譜是很容易分開的，你不需要特別設計實驗，只是看你的現有條件，如果你擁有的事一台可以走梯度的HPLC，你直接走一個甲醇-水，乙醇-水，乙腈-水的體系，結果一目瞭然，柱子的選擇上你可以參考文獻，因為紫杉醇的研究已經非常的成熟了！改變流動相對分離效果有一定影響，但是影響不大，柱子的影響比較大。如果有連ms，建議你打個ms，這樣再參考一下文獻，就不用打核磁，基本可以確定化學式。
如果你有的只是一個能走等度比例的hplc，那我建議你查一下文獻，一定能找到最好的比例，然後你設計一下其他比例，這樣可以對比出哪個梯度下分離效果最好，但是我個人不喜歡這樣，因為這樣沒有任何實際意義，就寫個文章能用上，我覺得其實就是無用功！如果能幫到你請給個滿意哦，如果還有疑問請繼續追問！

9. 紫杉10DABIII與紫杉醇是一樣的物質嗎

分析和比較海南和四川不同生長年限曼地亞紅豆杉3種紫杉烷類活性成分的的含量差異。方法:利用甲醇和CHCl3混合液超聲浸提後再用甲醇溶解得到相關成分;通過高效液相色譜法對10-DABⅢ、三尖杉寧鹼和紫杉醇含量進行測定和比較。結果:1)不同生長年限,海南栽培曼地亞紅豆杉3年生枝條中10-DABⅢ和紫杉醇含量均最高,7年生枝條中三尖杉寧鹼含量最高;四川栽培曼地亞紅豆杉4年生枝條中10-DABⅢ和三尖杉寧鹼含量均最高,紫杉醇含量在不同生長年限間不存在顯著性差異(P>0.05)。2)相同生長年限,四川栽培曼地亞紅豆杉10-DABⅢ含量普遍高於海南栽培曼地亞紅豆杉,三尖杉寧鹼含量兩個產地間有高有低,海南栽培3年生曼地亞紅豆杉紫杉醇含量在所有年限間最高。結論:四川栽培曼地亞紅豆杉10-DABⅢ含量高於海南栽培曼地亞紅豆杉,可以優先作為10-DABⅢ提取的材料來源產地;海南栽培4年生和3年生曼地亞紅豆杉分別作為三尖杉寧鹼和紫杉醇粗提原料來源更優。