腸道菌群定量分析方法

1. 如何分析腸道微生物菌群的數量和種類

摘要 你好，可以按照下面的方法進行分類

2. 腸道菌損群失調是指小腸還是大腸

小腸

健康人的胃腸道內寄居著種類繁多的微生物，這些微生物稱為腸道菌群。腸道菌群按一定的比例組合，各菌間互相制約，互相依存，在質和量上形成一種生態平衡，一旦機體內外環境發生變化，特點是長期應用廣譜抗生素，敏感腸菌被抑制，未被抑制的細菌而乘機繁殖，從而引起菌群失調，其正常生理組合被破壞，而產生病理性組合，引起臨床症狀就稱為腸道菌群失調症（alteration of intestina flora）。本症的發生率約為2％～3％。
【治療措施】
一全身支持療效：對施行大手術患者，手術前注意補充營養，亦可肌注丙種球蛋白以提高機體免疫機能。有研究表明，潰結患者肌注入免疫球蛋白可使結腸內乳酸桿菌和雙岐桿菌增加，某些條件致病菌減少。也可試用注射轉移因子，免疫核糖核酸、胸腺素等，亦可用白細胞介素2，每次5萬U肌注，10日為一療程，可連續應用。
二原因治療：如由於巨結腸，膽囊炎引起的腸球菌過度繁殖；維生素缺乏造成的腸球菌減少或消失；小腸蠕動過快而引起的酵母菌過多等，都必須無除去這些原因，然後再扶持正常菌群，方能奏效。
三調整菌群治療：
1.飲食調整：發酵性腹瀉應限制碳水化合物；腐敗性腹瀉應限制蛋白質的攝入。增強腸粘膜的局部防禦屏障功能，防止細菌易位，應增加纖維食物。
2.抗菌葯物：立即停止原抗生素，應根據菌群分析以及抗菌葯物敏感試驗，選用合適的抗生素以及抑制過度繁殖的細菌，從而間接扶植腸道繁殖不足的細菌。此外還可採用廣譜抗菌葯物將腸道細菌大部分消滅，然後再灌入正常腸道菌群的菌液以使其恢復。
3.活菌制劑：目前常用的活菌制劑有嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、乳酸乳桿菌、芽胞乳桿菌、分叉乳桿菌、糞鏈球菌、大腸桿菌、糞桿菌和枯草桿菌等。其中以分叉乳桿菌制劑療效最好。枯草桿菌制劑療效也較好，其療效機制可能是由於該菌是需氧的，能吸收氧氧，降低腸腔氧化還原電位，支持厭氧菌（類桿菌、乳桿菌）生長，從而間接扶植了正常菌菌群。還可以用正常人大便懸液做成復方活菌制劑用來治療葡萄球菌引起的偽膜性腸炎，收到較好的效果。用乳酸鏈球菌製成的乳酶生，臨床廣泛應用效果亦好。適用腸道正常菌群中繁殖不足的耐葯株做成制劑，以利定值，亦是調整腸道菌群失調的有效方法。目前最新的生物製品麗珠腸樂（回春生膠囊）為雙岐桿菌活菌制劑(bifidobiogne)，據葯一研究表明該制劑具有屏障作用、控制內黴素血症作用、營養作用、抗腫瘤作用、免疫增強作用、抗衰老作用等。
4.菌群促進劑：口服菌群促進劑，亦可達到扶植正常菌群的目的。如用乳醣扶植在腸桿菌，用葉酸扶植腸球菌，兒童常用分叉桿菌因子促進分叉乳桿菌生長。應用半乳糖甙一果酸，受細菌分解後形成乳酸或醋酸，使pH值降低，抑制其他細菌，而支持乳桿菌生長。
5.耐葯性腸球菌制劑：日本目黑氏等採用增厚傳代培養法獲得了耐鏈黴素、紅黴素、四環節、氨苄青黴素的腸球菌一類鏈球菌BIO—4R株。經動物和人體內試驗表明，本菌具有耐多種抗菌素性，故能阻止其他菌群異常繁殖，克服菌群失調，改善大便性異常，且比以往單用抗菌素治療療效迅捷，並能防止糞鏈球菌BIO—4R株的耐葯因子向大腸桿菌K—12株轉移。
6.中醫中葯：中醫認為：「泄瀉之本，無不由於脾胃」。急性泄瀉病多偏實，責在脾胃；慢性泄瀉病多為虛，每及脾腎。前者當清熱化濕，後者應高補脾腎。中葯中的清熱解毒葯對體液免疫有影響，如蒲公英、白花蛇舌草等能促進抗體生成，魚腥草能提高備解素濃度，而備解素、C3、Mg++組成的備解系統對痢疾桿菌、沙門氏菌、綠膿桿菌等革蘭氏陰性桿菌有一定殺滅作用，是機體產生抗體前的一種重要的非特異性的免疫防禦功能。在應用中醫辯證論治治療腸道菌群失調時，均應考慮以上葯物的作用，於清熱化濕、補氣健脾、和胃滲濕、溫腎健脾等法中，適當配伍應用則效果比較理想。
【病因學】
一飲食因素：運用測定細菌酶類的方法研究菌叢代謝活性的結果表明，飲食可使糞便菌叢發生明顯改變。無纖維食物能促進細菌易位。Spaeth G用大鼠作試驗研究，結果表明食物纖維能維持腸道菌群正常生態平衡，且細菌代謝纖維的終產物對小腸上皮有營養作用，纖維能維持腸粘膜細胞的正常代謝和細胞動力學。Hosoda等報道加入纖維的低渣飲食對保存腸的結構和功能有好的效果，纖維的保護作用是否通過直接刺激激腸粘膜或誘導釋放營養性胃腸激素尚不清楚。食物纖維能減少細菌易位，但不能使屏障功能恢復至正常。
二菌叢的變化因素：菌叢組成可因個體不同而存在差異，但對同一個人來說，在相當長的時期內菌叢組成十分穩定。每個菌種的生態學地位由宿主的生理狀態、細菌間的相互作用和環境的影響所確定。在平衡狀態下，所有的生態學地位都被占據。細菌的暫時棲生可使生態平衡發生改變。
三葯物的代謝因素：腸道菌叢在許多葯物的代謝中起重要作用，包括乳果糖、水楊酸偶氮磺胺吡啶、左旋多巴等。任何抗生素都可導致結腸菌叢的改變，其取決於葯物的抗菌譜及其在腸腔內的濃度。氯林可黴素和氨苄青黴素可造成大腸內生態學真空狀態，使艱難梭菌增殖。應用甲氰咪胍等H2—受體拮抗劑可導致葯物性低胃酸和胃內細菌增殖。
四年齡因素：隨著年齡的增高，腸道菌群的平衡可發生改變，雙尾菌減少，產氣莢膜桿菌增加，前者有可能減弱對免疫機能的刺激，後者導致毒素增加使免疫受到抑制。老年人如能維持年青時的腸道菌群平衡，也許能夠提高免疫能力。
五胃腸道免疫功能障礙因素：胃腸道正常免疫功能來自粘膜固有層的漿細胞，漿細胞能產生大量的免疫球蛋白，即分泌型IgA，此為胃腸道防止細菌侵入的主要物質。一旦胃腸道粘膜合成單體，或雙體IgA，或合成分泌片功能發生障礙，致使胃腸道分泌液中缺乏分型IgA，則可引起小腸內需氧菌與厭氧菌過度繁殖，從而造成菌群失調，引起慢性腹瀉。無症狀的IgA缺乏者，小腸內菌群亦可過度繁殖。新生兒期菌群失調發生率較高，亦可能與免疫系統發育未成熟或不完善有關。
【病理改變】
一細菌生長過盛：胃腸道的解剖和生理學異常會導致近段小腸內結腸型叢增殖，而出現各種代謝紊亂，包括脂肪瀉，維生素缺乏和碳水化合物吸收不良。並可伴發生於小腸假性梗阻、硬皮病、糖尿病性植物神經病變、慢性營養不良等。小腸內細菌生長過盛，其多種厭氧菌（主要有類桿菌、雙岐桿菌、韋榮氏球菌、腸球菌和梭狀芽胞桿菌）能水解結合膽鹽，導致微膠粒形成障礙、肝硬化、無明顯代謝紊亂的低胃酸症等。結腸菌叢的改變能導致因廣泛小腸切除後伴有神經功能不全的D-乳酸性酸中毒。應用廣譜抗生素，尤其是氯林可黴素和氨苄青黴素能使艱難梭菌增殖，產生一種蛋白質黴素，引起結腸粘膜壞死和潰瘍，稱為假膜性結腸炎。
二細菌產生IgA分解酶：溶血性鏈球菌屬、綠色鏈球菌、肺炎鏈球菌屬、流感嗜血桿菌屬、腦膜炎雙球菌，淋病雙球菌屬等菌能夠產生分解IgA的蛋白酶，並能分解人血清中的IgA1和初乳中的分泌型IgA。其中前2例細菌是構成口腔內菌群的主要菌種，後4種則為附著粘膜表面增殖的毒力性強的致病菌。由此可見，IgA蛋白酶對於這些細菌在粘膜表面作為常住菌生存或致病都是至關重要的。
三腸道叢與結核癌：結腸菌叢產生多種具有代謝活性的酶類，在一些自然產物、食物保存劑、染料、添加劑及污染物質變為致突變物質的反應中起媒介作用。許多細菌可因長期接觸底物而使細菌酶系系統活性增高。若此底物為致癌物原（procarcinogen），則長期接觸可使致癌物質的產生增加。
【臨床表現】
症狀體症
本症以嚴重腹瀉或慢性腹瀉為主要臨床表現，在應用抗生素治療過程中，如突然發生腹瀉，或原有腹瀉加重，即有可能發生本症。腹瀉多為淡黃綠色水樣便，有時如蛋花樣。真菌感染可呈泡沫樣稀便，有腥臭味，膿血便；葡萄球菌感染可排黃綠色稀便，每日3～20餘次，伴有腹脹，腹痛一般不著，吐瀉嚴重者可伴有脫水，電解質紊亂、血尿素氮升高、血壓下降；白色念珠菌感染一般多從上消化道開始，蔓延到小腸甚至肛周，鵝口瘡常是白色念珠菌腸炎最早的信號，如小腸粘膜糜爛或潰瘍可引起多次的無臭粘液膿性糞便，有時可呈水瀉，伴有消化不良，如治療不及時，可擴散至呼吸道、泌尿道甚至腦組織；綠膿桿菌感染能產生藍綠色熒光素使糞便帶綠色，但並不經常引起腹瀉，個別病例糞便中有粉一般腹痛輕，少數伴惡心、嘔吐、多有水、電解質紊亂，重症可發生休克。有些旅遊者可能因氣候和環境的改變而發生腸道菌叢失調俗稱水土不服。近年來，由於冰箱的普及使用，有的家庭儲存大量的肉食品及疏萊，過久的儲存使食物變質，食用後引起腸道菌群失調，造成嘔吐、腹瀉，有地出現精神不集中甚至精神恍惚。
臨床常見腸道菌群失調症狀類型如下：
一白色念珠菌性腸炎：是腸道菌群失調症最常見的一種。多見於瘦弱的嬰兒、消化不良、營養不良、糖尿病、惡性腫瘤、長期應用抗生素或激素的患者。
二葡萄球菌性腸炎：多見於長期應用抗生素（四環素類、氨苄青黴素等）、腎上腺皮質激素和進行腸道手術的老年患者或慢性病患者。
三產氣莢膜桿菌性急性壞死性腸炎：產氣莢膜桿菌所產生的β黴素可引起急性壞死性腫瘤、消耗性疾病、以及使用抗生素、皮質激素等情況下最易發生感染。
四綠膿桿菌腸道感染：綠膿桿菌為條件致病菌，常為繼發感染，在嬰幼兒、老人、某些惡性腫瘤、消耗性疾病、以及使用抗生素、皮質激素等情況下最易發生感染。
五變形桿菌腸道感染：變表桿菌在一定條件下可為條件致病菌，如普通桿菌、奇異桿菌、摩根氏變形桿菌均可引起食物中毒，無恆變形桿菌可引起嬰幼兒夏季腹瀉。
六肺炎桿菌腸道感染：當機體抵抗力降低或其他原因，正常寄生在腸道的肺炎桿菌可引起感染，特別是小兒的嚴重腹瀉。
【輔助檢查】
一菌群分析：為主要檢查方法，有定性分析和定量分析2種。
1.定性分析：與一般微生物學檢查相同，如葡萄球菌炎糞便塗片革蘭氏染色可發現成堆的陽性葡萄球及中性多形核細胞，糞便培養可有大量葡萄球菌生長。白色念珠菌性腸炎可採取其病理材料直接塗片，經氫氧化鉀溶液處理並革蘭氏染色，鏡檢可見成簇的卵圓形白色念珠菌。革蘭氏染色陽性，細胞內著色不均勻、細菌培養可形成奶油色表面光滑細菌樣落，帶有酵母氣味。但除三度比例失調（即菌群交替症）能檢出外，其他比例失高則難以分析。因此，除定性檢查外，尚需進一步作定量檢查，以判斷數值是否正常。
2.定量檢查：首先需將糞質均質化，並按一定比例稀釋，培養後還須計算各類細胞菌落計數以求出細菌總數值，手續麻煩，一般實驗室很少採用。正常菌群分析所用的培養基，要求具有高度的選擇性，如S培養基對腸道致病菌，伊紅美藍培養基對腸道需氧的革蘭氏陰性桿菌，7.5%氯化鈉瓊脂對葡萄球菌，少鮑氏瓊脂對真菌等。培養方法除需氧培養外，必要時尚需厭氧培養，需氧培養與一般細菌培養相同，厭氧培養則採用生物厭氧法或厭氧缸法。
二結腸鏡檢查：腸粘膜呈彌漫性充血、水腫、血管分支模糊不清或消失。有散在的糜爛潰瘍及出血，有時可見黃色假膜附著。
【預防】
合理應用抗生素。對年老體弱、慢性消耗性疾病者，使用抗生素或者激素時，嚴格掌握適應症，最好能作葯物敏感試驗，選擇最敏感的抗生素。對老、細及病後體弱者，在用抗生素的同時並配合使用乳酸菌素或雙岐桿菌活菌制劑及維生素B族或維生素C等，以防腸道菌群失調。在大手術前，應注意配合全身支持療法，如提高營養、輸血、肌注丙種球蛋白、服用維生素等。
【預後】
腸道菌群失調症狀除引起嚴重吐瀉脫水、失血、發生毒血症、甚至休克，預後較差外，一般預後良好。

3. 大腸桿菌檢測方法國標是用什麼方法檢測的

大腸桿菌檢測方法分為三種：

1、細菌分離鑒定法

分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液先經肉湯增菌，然後轉種血瓊脂平板。其他標本同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。

37℃孵育18～24小時後，觀察菌落塗片染色鏡檢。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要的時候檢定腸黴毒素。

2、衛生細菌學檢查法

大腸桿菌會不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，則表示樣品被糞便污染的越嚴重，表明樣品中存在腸道致病菌的可能性也就越大。

大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群，瓶裝汽水和果汁中每100ml大腸菌群不能超過5個。

3、全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測法

全自動微生物定量分析（TEMPO）儀大腸桿菌群計數檢測有TEMPOTC和TEMPOCC兩種方法。

TEMPOTC的開發是為獲得NF ISO4832標准相當性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群方法。

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大腸桿菌在生物技術中的應用

這些菌株由於失去了細胞壁等重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。即便由於操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。

生物工程用的菌株基因組都被優化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用於分子克隆實驗。

真核基因在大腸桿菌中表達，必須有合適的表達載體(Vector),常用載體：pBV220,pET系統。

目的基因在大腸桿菌中表達的情況：

大腸桿菌更適合原核基因的表達，外源基因表達產量與單位體積產量是正相相關的，外源基因拷貝數和表達 產物產量之間存在動態平衡，單個細胞的產量又與外源基因拷貝數，基因表達效率，表達產物的穩定性和細胞代謝負荷等因素有關。

4. 大腸桿菌的檢測方法

多管發酵法。

多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而後能產生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特徵熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。

在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵，分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離，接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最後通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。

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注意事項：

1、檢樣時注意無菌操作。

2、稀釋時採用的稀釋液可以用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，接種時可採用九管法，設置三個梯度，分別為0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一個稀釋度的試管應充分混勻。

3、每次實驗需要有陰性對照。

4、使用小倒管培養基配製時，為排凈氣泡，滅菌時不要把試管的蓋子蓋的太緊，滅菌後注意觀察一下倒管中的氣體是否排完全、

5、高壓滅菌後等高壓滅菌鍋的壓力表達到0，取出培養基放到冰箱冷卻，效果會比較好。

5. 大腸桿菌的檢查方法

細菌的分離鑒定
1、標本：腸道外感染取中段尿、血液、膿液、腦脊液等，腹瀉者取糞便。
2、分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液需先經肉湯增菌，再轉種血瓊脂平板。其他標本可同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。37℃孵育18～24小時後，觀察菌落並塗片染色鏡檢。採用一系列生化反應進行鑒定。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要時檢定腸黴毒素。
泌尿系統除確定大腸桿菌外，還應計數，每毫升尿含菌量≥100，000時，才有診斷價值。
衛生細菌學檢查
大腸桿菌不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境和水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，表示樣品被糞便污染越嚴重，也表明樣品中存在腸道致病菌的可能性越大。故應對飲水、食品、飲料進行衛生細菌學檢查。
1、細菌總數：檢測每毫升或每克樣品中所含細菌數，採用傾注培養計算。中國規定的衛生標準是每毫升飲水中細菌總數不得超過100個。
2、大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國的衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群；瓶裝汽水、果汁等每100ml大腸菌群不得超過5個。
全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測
全自動微生物定量分析（TEMPO）儀的大腸桿菌群計數檢測有TC和CC兩種方法。TEMPO TC的開發是為了獲得NF ISO4832標准相當性能水平。TEMPO CC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群的方法。該法是為了獲得和AOAC官方方法966.24及美國公共健康聯合會檢測乳製品檢測方發（SMEDP）一致的效果。TEMPO系統根據陽性空的大小和數目來推算出原始樣本中大腸桿菌群數目。
食品檢測方法 大腸菌群MPN 計數法 1 樣品的稀釋 1.1 固體和半固體樣品：稱取25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內,
8000 r/min～10000 r/min 均質1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋
中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，製成1:10 的樣品勻液。
1.2 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶
（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，製成1:10 的樣品勻液。
1.3 樣品勻液的pH 值應在6.5～7.5 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 調節。
1.4 用1 mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1 mL，沿管壁緩緩注入9 mL 磷酸鹽緩沖液
或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1 mL 無菌
吸管反復吹打，使其混合均勻，製成1:100 的樣品勻液。
1.5 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋
1 次，換用1 支1 mL 無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min。 2.初發酵試驗 每個樣品，選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3
管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL，則用雙料LST肉湯），36
℃±1 ℃培養24 h±2 h，觀察倒管內是否有氣泡產生，24 h±2 h產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續
培養至48 h±2 h，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。 3.復發酵試驗 用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，36 ℃±1
℃培養48 h±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。 4.大腸菌群最可能數（MPN）的報告 按3確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MPN表（見附錄B），報告每g（mL）樣品中大腸菌群的
MPN值。 大腸菌群平板計數法 1 樣品的稀釋 按上一方法稀釋。 2 平板計數 2.1 選取2個～3個適宜的連續稀釋度, 每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。同時取1 mL生理鹽
水加入無菌平皿作空白對照。
2.2 及時將15 mL～20 mL冷至46 ℃的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）約傾注於每個平皿中。小心
旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固後，再加3 mL～4 mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉平
板，置於36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h。 3 平板菌落數的選擇 選取菌落數在15 CFU～150 CFU 之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。
典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5 mm 或更大。 4 證實試驗 從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於BGLB 肉湯管內，36 ℃±1 ℃
培養24 h～48 h，觀察產氣情況。凡BGLB 肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。

6. 大腸菌群是如何測定的分離培養時使用什麼培養基

大腸菌群鑒定用的是BGLB，觀察產氣情況，如有產氣者，計為大腸菌群陽性。分離培養時使用主要有ss平板，EMB:伊紅美蘭培養基和雙糖鐵培養基。
大腸菌群主要包括暢桿菌科中韻埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、魔雷伯氏菌屬和腸桿菌屬。這些屬的細菌均來自於人和溫血動物的腸道，需氧與兼性厭氧，不形成芽孢；在35～37℃條件下，48 小時內能發酵乳糖聲酸產氣，革蘭氏陰性。
由於大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

7. 大腸菌群檢測方法

GB 4789.3-2016 《食品安全國家標准 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》中的規定操作步驟：

1、乳糖發酵試驗：樣品稀釋後，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發酵管。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。

2、分離培養：將產氣發酵管培養物轉種於伊紅美藍瓊脂平板上，36±1℃培養18-24h，觀察菌落形態。

3、證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發酵管36±1℃培養24±2h，觀察產氣情況。

SN0169-92 《中華人民共和國進出口商品檢驗行業標准出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢驗方法》規定操作：

1、推測試驗：樣品稀釋後，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管LST肉湯。36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。

2、證實試驗：將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯管中，36±1℃培養48±2h，觀察是否產氣。以BGLB產氣為陽性。查MPN表，報告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。

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大腸菌群並非細菌學分類命名，而是衛生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面並非完全一致。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。

大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。

糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在，因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。

8. 腸道致病菌的分類及常用檢測方法

根據可培養細菌的數量分類在腸道菌群中，可以培養到的細菌有400餘種，依據其數量多少可以分為主要(優勢)菌群(predominant microflora)和次要菌群(sub—dominant microflora)。

①主要(優勢)菌群：指腸道菌群中數量大或種群密集度大的細菌，一般在10～10cfu/g以上，包括類桿菌屬、優桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬於原籍菌群。優勢菌群是對宿主發揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個菌群的功能，決定著菌群對宿主的生理病理意義。

②次要菌群：數量在10～10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動性大，有潛在致病性，大部分屬於外籍菌群或過路菌群。

檢測方法：

1、采樣及稀釋

（1）按無菌操作法將檢樣25g（或25mL）放於含有225mL無菌水的三角瓶中（瓶內預置適當數量的玻璃珠）或滅菌乳缽內，經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用無菌均質器，以8000～10000r/min的速度離心1min，做成1：10的稀釋液。

（2）用1mL滅菌吸管吸取1：10稀釋液1Ml，注入含有9mL無菌水的試管內，振搖混勻，做成1：100的稀釋液，換用1支lmL滅菌吸管，按上述操作依次作l0倍系列稀釋液。

（3）根據食品的衛生要求或對檢驗樣品污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。也可直接用樣品接種。

2、乳糖初發酵試驗

即通常所說的假定試驗。其目的在於檢查樣品中有無發酵乳糖產生氣體的細菌。將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在1mL以上者，用雙倍乳糖膽鹽發酵管。

lmL及1mL以下者，用單倍乳糖膽鹽發酵管。每一個稀釋度接種3管，置36±1℃溫箱內，培養24±2h，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。

3、分離培養

將產氣的發酵管分別劃線接種於伊紅美藍瓊脂平板，置36±1℃溫箱內培養18～24h，然後觀察菌落形態並作革蘭氏染色、鏡檢並作復發酵試驗。

4、乳糖復發酵試驗

即通常所說的證實試驗，其目的在於證明經乳糖初發酵試驗呈陽性反應的試管內分離到的革蘭陰性無芽胞桿菌，確能發酵乳糖產生氣體。

在上述選擇性EMB培養基上，挑取可疑的大腸菌群菌落1～2個進行革蘭染色，同時接種乳糖發酵管，置36±l℃溫箱內培養24±2小時，觀察產氣情況。

凡乳搪發酵管產氣，革蘭染色為陰性反應的無芽胞桿菌，即報告為大腸菌群陽性；凡乳糖發酵管不產氣或革蘭染色為陽性，則報告為大腸菌群陰性。

(8)腸道菌群定量分析方法擴展閱讀：

有益菌菌群的生理功能：

如果腸內有益菌菌群占優，腸內黏膜呈現粉紅色，表示腸內環境相當良好。

1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄

在胃部分解消化的食物，經由小腸吸收營養後，成為粘稠狀物體送至大腸。然後再經過18小時將水分及礦物質吸收，就變成容易排泄的糞便。腸道內環境良好時，糞便的軟硬適中，排便會較為順利。

2、緩和的蠕動，能順利將糞便排出

藉由腸的蠕動，將糞便緩慢的推送至肛門。如果蠕動過快或太慢，都將影響糞便的構成，導致便秘或者腹瀉。而如果腸內干凈，則蠕動的速度就相當的有規律，糞便可順利排出。

3、有助維他命的合成

比菲德氏菌等好菌能維護肌膚的健康，並具有合成有助熱量產生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會不斷繁殖，維他命的合成也可順利進行。

4、迅速排出有害物質

健康的腸道並非完全沒有壞菌的存在，有害物質多少會產生。當然還包括，吃進體內的食品化學添加物或是無法成為營養成分的物質。只要腸內環境良好，這些物質在開始危害身體前就被排出體外。

5、避免病原菌的侵害

比菲德氏菌等好菌可以刺激並提高身體的免疫機能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內繁殖。

腸道有益菌菌群除了以上功能之外，對人體還有營養作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對人類的毛發具有重要的作用，當缺少這些營養元素，會導致頭發脫落或毛發發黃、發叉，容易折斷等現象。

9. 水體中大腸菌群如何檢測

水的大腸菌群數是指100 mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞鏈球菌和厭氧芽孢桿菌等多種細菌。這些細菌都可以隨人畜排泄物進入水源，由於大腸菌群在腸道內數量多，所以，水源中大腸菌群的數量，是直接反映水源被人畜排泄物污染的一項重要指標。目前，國際上已公認大腸菌群是糞便污染的指標。因而對飲用水必須進行大腸菌群的檢查。水中大腸菌群的檢測方法，常用多管發酵法和濾膜法。多管發酵法可適用於各種水樣的檢驗，但操作繁瑣，需要的時間較長。濾膜法僅適用於自來水和深井水，操作簡單、快速，但不適用於雜質較多、易於堵塞濾孔的水樣。

10. 細菌總數怎麼檢測

細菌總數檢測目前國標規定的方法為平板計數法，其檢驗方法是：

在玻璃平皿內，接種一毫升水樣或稀釋水樣於加熱液化的營養瓊脂培養基中，冷卻凝固後在37°C培養24小時，培養基上的菌落數或乘以水樣的稀釋倍數即為細菌總數。

有的國家把培養溫度定為35°C或其他溫度，也有把培養時間定為48小時的。這種方法精度高，但耗時長，難以滿足實際工作需要。

為了簡化檢測程序、縮短檢測時間，國內外學者進行了大量的快速檢測方法的研究，提出了阻抗檢測法、Simplate TM全平器計數法、微菌落技術、紙片法等檢測方法，取得了一定的成果，但檢測時間仍在4 h以上。

本研究在分析了已有研究成果的基礎上，提出了在濾膜上染色後，直接計數的細菌總數檢測方法，具體步驟為：

用集菌儀進行細菌收集→在膜上進行染色→在油鏡下計數→按公式計算出菌液濃度。實驗結果表明，該方法與傳統的平板培養法無顯著性差異，檢測時間約1 h，是一種快速的細菌總數檢測方法。

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水中通常存在的細菌大致可分為三類：

1、天然水中存在的細菌。普通的是熒光假單孢桿菌、綠膿桿菌，一般認為這類細菌對健康人體是非致病的。

2、土壤細菌。當洪水時期或大雨後地表水中較多。它們在水中生存的時間不長，在水處理過程中容易被去除。腐蝕水管的鐵細菌和硫細菌也屬此類。

3、腸道細菌。它們生存在溫血動物的腸道中，故糞便中大量存在。水體中發現這類細菌，可以認為已受到糞便的污染。致病性腸道細菌有沙門氏桿菌（傷寒和副傷寒菌）、B型炭疽菌、痢疾志賀氏菌和霍亂弧菌等。