pcr分析mrna的離心方法

㈠ RNA的提取方法步驟及原理.

RNA抽取一般使用Trizol法抽提:

Trizol是一種總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速裂解細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法進行提取組織或細胞中的RNA。

Trizol作用原理:

在勻質化或溶解樣品中，Trizol試劑可保持RNA的完整性，同時能破壞細胞及溶解細胞成分。加入氯仿離心後，裂解液分層成水相和有機相。RNA存在於水相中。

水相轉移後，RNA通過異丙醇沉澱回收。移去水相後，用乙醇可從中間相沉澱得到DNA，加入異丙醇沉澱可從有機相得到蛋白質。

(1)pcr分析mrna的離心方法擴展閱讀

與DNA不同，RNA一般為單鏈長分子，不形成雙螺旋結構，但是很多RNA也需要通過鹼基配對原則形成一定的二級結構乃至三級結構來行使生物學功能。

RNA的鹼基配對規則基本和DNA相同，不過除了A-U、G-C配對外，G-U也可以配對。

在細胞中，根據結構功能的不同，RNA主要分三類，即tRNA（轉運RNA），rRNA（核糖體RNA），mRNA（信使RNA）。mRNA是合成蛋白質的模板，內容按照細胞核中的DNA所轉錄；tRNA是mRNA上鹼基序列（即遺傳密碼子）的識別者和氨基酸的轉運者；rRNA是組成核糖體的組分，是蛋白質合成的工作場所。

㈡ 怎樣從總RNA中提取mRNA原理是什麼

大多數真核細胞mRNA的3』端通常具有由20-30個腺苷酸組成的polyA尾巴，寡聚胸腺嘧啶脫氧核糖核苷（OligoT）可以與之配對結合，這就是提取mRNA最基本的原理。具體到實驗手段上，現在磁珠法、纖維素柱層析法都有在用。
磁珠法一般是用生物素標記OligoT，親和素標記磁珠（生物素和親和素間具有高度親和力）。實驗時生物素標記的OligoT與mRNA的polyA高效雜交形成復合體，此復合體又與標有親和素的磁珠結合。用磁性分離架就可以將這堆復合物分離出來。最後用無RNase去離子水將mRNA從復合物中洗脫下來即可。
寡聚dT纖維素柱層析法的大致流程：總RNA流經寡聚dT纖維素柱時，在高鹽緩沖液中，帶polyA尾的mRNA被特異地結合在柱上。降低鹽濃度，mRNA被洗脫。一般過兩次柱後，就可得到較高純度的mRNA。

當然有些mRNA沒有polyA尾巴，這種就比較難辦了，我最近的實驗就是在對付這種東西。如果你是拿mRNA做RT-PCR，其實一般是不必分離mRNA的，設計好引物就可以用總RNA做了。

㈢ PCR實驗中離心的目的是什麼

擴增靶基因

㈣ 簡述檢測mRNA表達的PCR法原理，檢測mRNA時有哪些方法避免DNA對結果的影響

聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術。它具有特異、敏感、產率高、快速、簡便、重復性好、易自動化等突出優點；能在一個試管內將所要研究 的目的基因或某一DNA片段於數小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷；可從一根毛發、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研 究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫學領域中的一項革命性創舉和里程碑。
PCR技術簡史
PCR的最早設想 核酸研究已有100多年的歷史，本世紀60年代末、70年代初人們致力於研究基因的體外分離技術，Korana於1971年最早提出核酸體外擴增的設想：「經過DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，並不斷重復該過程便可克隆tRNA基因」。
PCR的實現 1985年美國PE-Cetus公司人類遺傳研究室的Mullis等發明了具有劃時代意義的聚合酶鏈反應。其原理類似於DNA的體內復制，只是在試管中給 DNA的體外合成提供以致一種合適的條件---摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合適的緩沖體系，DNA變性、復性及延伸的溫度與時間。
PCR的改進與完善 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大腸桿菌DNA聚合酶I的 Klenow片段，其缺點是：①Klenow酶不耐高溫，90℃會變性失活，每次循環都要重新加。②引物鏈延伸反應在37℃下進行，容易發生模板和引物之 間的鹼基錯配，其PCR產物特異性較差，合成的DNA片段不均一。此種以Klenow酶催化的PCR技術雖較傳統的基因擴增具備許多突出的優點，但由於 Klenow酶不耐熱，在DNA模板進行熱變性時，會導致此酶鈍化，每加入一次酶只能完成一個擴增反應周期，給PCR技術操作程序添了不少困難。這使得 PCR技術在一段時間內沒能引起生物醫學界的足夠重視。1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶進行PCR，其擴增的DNA片段很均一，真實性也較高，只有所期望的一種DNA片段。但每循環一次，仍需加入新酶。1988年Saiki 等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取到一種耐熱DNA聚合酶。

㈤ 要做（mRNA）RT PCR，需要的儀器有哪些

首先，RT不是證明RNA有無表達的很好方法，RT批不出來會有很多原因，並不僅僅是沒有模板。建議你做northern。
做RT需要
1，很乾凈整潔的實驗環境，RNA提取對操作環境的要求很高。
2，電動組織分散儀（IKA公司的T10那種）或研缽+液氮或玻璃組織研磨器，以上提取效果遞減。
3，1.5ml管冷凍離心機。
4，移液槍1ml、200ul、10ul一套，最好專用。
5，紫外分光光度計、石英狹縫比色皿。
6，核酸電泳儀、電泳槽（電泳槽最好專用）
7，RNase
free的各式槍頭、1.5ml離心管；RNase
free的雙蒸水。
8，如果樣品不會立即進入下一步實驗，建議具備超低溫冰箱。

㈥ 怎樣從總rna中進行mrna的分離和純化

真核生物的mRNA分子是單順反子，是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物，因此，高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5?g RNA，理論上認為每克細胞可分離出5～10mg RNA。其中 rRNA為75％～ 85％，tRNA佔10％～16％，而mRNA僅佔1%～5％，並且mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一，表達豐度也不一樣。
真核生物mRNA有特徵性的結構，即具有5』端帽子結構（m7G）和3』端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3』端存在20~300個腺苷酸組成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，這種結構為真核mRNA分子的提取、純化，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在於此。
一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3』 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚（dT）（即oligo(dT)）纖維素柱時，在高鹽緩沖液作用下，mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中，mRNA可被洗下，經過兩次oligo(dT)纖維素柱，即可得到較純的mRNA。
目前常用的mRNA的純化方法有：
（1）寡聚（dT）－纖維素柱層析法，即分離mRNA的標准方法；
（2）寡聚（dT）－纖維素液相離心法，即用寡聚（dT）－纖維素直接加入到總的 RNA溶液中並使mRNA與寡聚（dT）－纖維素結合，離心收集寡聚（dT）－纖維素／mRNA復合物，再用洗脫液分離mRNA，然後離心除去寡聚（dT）－纖維素；
（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。
本實驗應用方法（1）進行mRNA的分離純化。
【試劑與器材】
（一）試劑
1． 0.1mol/L NaOH ，每組200mL
2． 寡聚Oligo（dT）-纖維素
3． 加樣/洗滌緩沖液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
4． 洗滌緩沖液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。
配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經高壓消毒後按各成分確切含量，經混合後再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經65℃溫育（30min）的10%SDS至終濃度。
5． 5 mol/L NaCl，每組10mL
6． 3 mol/L NaAc pH5.2，每組10mL
7． 無RNase雙蒸水(DEPC水)，每組100mL
8． 70%乙醇，每組10mL
注意：溶液5，6的配製都應該加0.1% DEPC處理過夜，溶液1，3，4，8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配製，Tris應選用無RNase的級別。溶液配製後，最好能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次實驗只用一份，避免多次操作造成對溶液的污染。
（二）器材
1． 恆溫水浴箱
2． 冷凍高速離心機
3． 紫外分光光度計
4． 巴斯德吸管
5． 玻璃棉
6． 5ml一次性注射器
【操作方法】
（一） oligo(dT)纖維素的預處理
1． 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
2． 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理並經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為0.5-1.0mL，用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
3． 用3-5倍柱床洗滌緩沖液I沖洗oligo(dT)纖維素，直到流出液的pH值小於8.0。
4． 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出，用適當的柱床洗滌緩沖液I懸浮，濃度約為0.1g/mL，保存在4℃待用。
（二） 總RNA濃度的調整
1． 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中，如果總RNA的濃度大於0.55mg/mL，則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL，總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置於65℃水浴加熱5 分鍾，然後迅速插在冰上冷卻。
2． 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。
（三） mRNA的分離
1． mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合：用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素，按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中，蓋上蓋子，顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。於37℃水浴保溫並溫和搖盪15分鍾。
總RNA (mg)寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL)洗滌緩沖液1，2 (mL)洗脫體積(mL)
<0.20.21.01.0
0.2-0.50.51.51.5
0.5-1.01.03.03.0
1.0-2.02.05.05.0

2． 轉移：取1個5ml的一次性注射器，取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端，並把它固定在無RNase的支架上，再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器，推進塞子直至底部，把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中（保留至確定獲得足夠的mRNA）。
3． 洗滌：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩沖液1，溫和振盪，充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子，用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260，當洗出液中OD為0時准備洗脫。
4． 洗脫：根據上表直接用注射器慢慢吸取適量（2-3倍柱床體積）的洗脫緩沖液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素，推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。
5． 測定每一管的OD260，合並含有RNA的洗脫液組分於4℃，2500g，離心2-3分鍾，上清轉移至新的離心管中，去掉殘余的oligo(dT)-纖維素。
6． 沉澱：洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇，混勻後，-20℃30分鍾或放置過夜。
7． 離心收集：12000g, 4℃離心15分鍾，小心棄去上清，mRNA沉澱此時往往看不見，用70%乙醇漂洗沉澱，12000g, 4℃離心5 分鍾，小心棄去上清液，沉澱空氣乾燥10分鍾，或真空乾燥10分鍾。將mRNA沉澱溶於適當體積的無RNase的雙蒸水，立即用於cDNA合成（或保存在70%乙醇中並貯存於-70℃）。
8． 定量：測定OD260和OD280，計算產率以及OD260/OD280的比率（同上一實驗）。
【注意事項與提示】
1． 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
2． 提取的總RNA必須完整，不能被降解，這是mRNA質量的先決條件。
3． 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當，過量的總RNA，容易造成mRNA不純。
4． RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置於65℃加熱5 分鍾，這一步很重要，其作用（1）破壞mRNA的二級結構，特別是poly(A+)尾處的二級結構，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解離mRNA與rRNA的結合。加熱後應立即插入冰上，以免由於溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
5． 應注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可嚴重影響實驗結果。
6． mRNA制備後，可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀，無明顯區帶，但大部分的mRNA應在1-2.0kb范圍內（如下圖）。一般來說，經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留，但一般來說不會對後續實驗造成很大的影響，如果樣品充足，可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次，進一步提高其純度。
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA;
Lane 3, 老鼠肝臟mRNA
7． 為防止mRNA降解，應避免多次凍融，可將mRNA少量分裝後保存。另外，如果有低溫冰箱,最好在 -70℃～ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
8． 寡聚(dT)纖維素柱用後可用0.3mol/l NaOH洗凈，然後用層析柱加樣緩沖液平衡，並加入0.02%疊氮鈉（NaN3)冰箱保存，重復使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。
9． 一般而言，107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當於上柱總RNA量的1%-2%。
【實驗安排】
1． 第一天：試劑的配製和所用一次性塑料製品和玻璃器皿的去RNase處理（0.1%DEPC浸泡或高溫干烤）。
2． 第二天：進行（一）、（二）和（三）1-6。
3． 第三天：進行（三）7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。
4． 為了避免由於保存時間過長造成的RNA降解，最好能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。
【實驗報告要求與思考題】
1． mRNA的OD260和OD280值，OD260/OD280比率和計算mRNA產率；
2． mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳結果；
3． 為什麼mRNA提取是cDNA合成成敗的關鍵？
附錄：
1．逆轉錄酶及其活性
逆轉錄酶（reversetranscriptase）又稱RNA指導的DNA聚合酶，是以RNA為模板合成DNA的酶。這種酶是1970年美國科學家特明（H.M.Temin）和巴爾的摩（D.Baltimore）分別於動物致癌RNA病毒中發現的，他們以此獲得了1975年度諾貝爾生理學或醫學獎。人們發現，當RNA致癌病毒，如鳥類勞氏肉瘤病毒（Rous sar-coma virus）進入宿主細胞後，其逆轉錄酶先催化合成與病毒RNA互補的DNA單鏈，繼而復制出雙螺旋DNA，並經另一種病毒酶的作用整合到宿主的染色體DNA中，該整合的DNA可能潛伏數個世代不表達，等到適合的條件時被激活，才利用宿主的酶系統轉錄成相應的RNA，其中一部分作為病毒的遺傳物質，另一部分則作為mRNA翻譯成病毒特有的蛋白質。最後，這些RNA和蛋白質被組裝成新的病毒粒子。在這個過程中，遺傳信息流動的方向是從RNA到DNA，正好與轉錄過程相反，故稱反轉錄（reversetranscription，RT）。逆轉錄酶在許多方面與DNA聚合酶相似，含Zn2+，以脫氧核苷三磷酸為底物，從5』到3』合成DNA，反應需要引物。目前已發現不少動物反轉錄病毒，近年來也發現了幾種人類反轉錄病毒，艾滋病毒也是一種反轉錄病毒。
一些生物公司已經提純了逆轉錄酶，生產出了各自的主打產品，比如TAKARA從禽類成髓細胞瘤病毒純化到的禽類成髓細胞病毒(AMV)逆轉錄酶，Invitrogen 從表達克隆化的Moloney鼠白血病病毒反轉錄酶基因的大腸桿菌中分離到的鼠白血病病毒(MLV)反轉錄酶, 以及進一步開發的更耐高溫的ThermoScript，Gibco 開發的SuperScripⅡ等，可作為合成某些特定RNA的互補DNA的工具酶，也可用於DNA的序列分析和克隆重組DNA。
AMV反轉錄酶包括兩個具有若干種酶活性的多肽亞基,這些活性包括依賴於RNA的DNA合成,依賴於DNA的 DNA合成以及對DNA:RNA雜交體的RNA部分進行內切降解(RNA酶H活性)。MLV反轉錄酶只有單個多肽亞基,兼備依賴於RNA和依賴於DNA的DNA合成活性,但降解RNA:DNA雜交體中的RNA的能力較弱,且對熱的穩定性較AMV反轉錄酶差。MLV反轉錄酶能合成較長的cDNA(如大於2-3kb)。AMV反轉錄酶和MLV反轉錄酶利用RNA模板合成cDNA時的最適pH值,最適鹽濃度和最適溫室各不相同,所以合成第一鏈時相應調整條件是非常重要。因為RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響，良好的逆轉錄效果非常重要。研究表明，ThermoScript比AMV的靈敏性強得多。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。同MMLV相比，SuperScripⅡ顯著提高了長RT-PCR產物的產量。
不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，並降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。研究表明，SuperScriptⅡ逆轉錄酶，RNaseH- 的MMLV逆轉錄酶及ThermoScript逆轉錄酶，RNaseH- 的 AMV，比MMLV和AMV得到更多量和更多全長的cDNA。RNaseH- 的逆轉錄酶同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高於正常的37-42℃的溫度下進行。
2．引物的設計一般遵循的原則：
1）典型的引物20-24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是太長的引物可能會與錯誤配對序列雜交降低了特異性，同時因為 比短序列雜交慢，從而降低了產量。
2）設計5"端和中間區為G或C，且GC含量為50％~60％的引物，以增加引物的穩定性及其與目的序列雜交的穩定性。
3）3"末端盡量不要富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。但因為3"端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，為了避免3"末端的錯誤配對，所以末端盡量避免為核苷A。
4）在引物對3"末端盡量避免互補序列以免形成引物二聚體，抑制擴增。如果引物序列可能產生內部二級結構會破壞引物退火穩定性，也要盡量避免。
此外，目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5"端而不影響特異性。
有時候，僅有有限的序列信息可供用於引物設計。比如，如果僅知道氨基酸序列，可以設計簡並引物，同時使用較高的引物濃度（1μM到3μM），因為許多簡並混合物中的引物不是特異性針對目的模板。
為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的鹼基使用偏好，減少簡並性。次黃嘌呤可以同所有的鹼基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3"端使用簡並鹼基，因為3"端最後3個鹼基的退火足以在錯誤位點起始PCR。

㈦ 求助做熒光定量PCR，mRNA的提取方法

您好！現在做熒光定量PCR，RNA的提取方法有磁珠法，離心柱法。磁珠法提取RNA特異性，敏感性都比離心柱法要高，檢測下線更低。

㈧ RNA的提取方法

1、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然後用酚和酚-氯萃取，高速離心後取上清，所得DNA大小為100-150kb

2、甲醯胺解聚法：破碎細胞同上，然後用高濃度甲醯胺解聚蛋白質與DNA的結合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

3、玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪於乙醇上，然後用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉澱液繞於玻棒。生成DNA約80kb。

4、異丙醇沉澱法：基本同1法，僅用二倍容積異丙醇替代乙醇，可去除小分子RNA（在異丙醇中可溶狀態）

5、表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然後用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉澱或透析。

6、加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鍾，然後離心後取上清，可用於PCR反應。

7、鹼變性快速制備：先用NaOH作用20分鍾，再加HCI中和，離心後取上清，含少量DNA。

(8)pcr分析mrna的離心方法擴展閱讀：

DNA提取原則：

1、保證核酸一級結構的完整性；

2、核酸樣品中不應存在對酶有抑製作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；

3、其他生物大分子如蛋白質、多糖和脂類分子的污染應降低到最低程度；

4、其他核酸分子，如RNA，也應盡量去除。

㈨ 在材料上培養了細胞，想做PCR 試驗，請教如何提取mRNA

把材料取出來，先用PBS沖洗材料2-3次，然後用0.25%胰酶在37度條件下消化材料30分鍾，用吸管輕輕吹打溶液，目的是盡量將貼附在材料上生長的細胞吹打下來，然後收集溶液，如果細胞數量不多，可以再用PBS洗滌材料，洗滌溶液與上次收集的消化溶液合並，然後4000RPM離心，輕輕棄去上清溶液，收集細胞，再用RNA試劑盒收集細胞RNA，進行PCR實驗。

㈩ 病毒RNA的提取方法主要有哪幾種

方法很多（我從小木蟲粘貼了一份很全的流程），主流的有三種。
一、提禽流感病毒的詳細步驟，可參考（我提過N次做定量PCR都沒問題）：
1.取200ul樣品數+陰性對照+陽性對照個1.5ml滅菌eppendorf管
2.加600ul異硫氰酸胍，然後加入對照和樣品，再加200ul氯仿，顛倒混勻
3.13000rpm離心15min
4.在第3步離心快結束時，另取同樣多eppendorf管，加入400ul -20度預冷的異丙醇
5.取第3步離心的上清（一定不要吸取到中間白色層，第3步離心結束往外拿的時候，管子盡量不要傾斜）轉移到第4步准備的管中，顛倒混勻
6.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
7.加600ul 75％乙醇，顛倒數次以洗滌殘存異丙醇
7.13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；在吸水紙上盡量沾干液體
8.4000rpm離心10sec，將管壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸干，室溫乾燥2－3min（不可過分乾燥，防止下一步RNA不溶解）
9.加入20ul DEPE水(加入depc的純水高壓後的水即為DEPE水)，輕輕混勻溶解RNA。2000rpm離心5sec，冰上保存備用（最好2小時內使用，以免RNA降解）
二、用TRIzol LS提取
應用TRIzol LS提取病毒RNA
所提取物為血清、血液、細胞培養液、雞胚尿囊液等液體中的病毒。提取時盡量在人少時進行，防止空氣中RNA酶的污染。所用一切物品也應是無RNA酶的。
1.1 在1.5ml的eppendorf管中加入病毒原液500ul，再加入TRIzol LS 500ul，充分混勻，室溫放置10min。
1.2 加入200ul的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震盪離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現象），室溫放置10min （由於氯仿沸點低、易揮發，振盪時離心管可能爆開，小心）。
1.3 離心 4℃、13000r/min、15min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。
1.4 加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10min。
1.5 離心 4℃、13000r/min、15min，（這時乍一看會發現管子里好像沒有東西，再仔細看看，會發現靠近管底的壁上有一星點的白色沉澱物，就是它了）用槍小心吸去所有上清。
1.6 1ml75%乙醇洗一遍，離心 4℃、8000r/min、10min，（這時又會發現管子沒東西了，不要擔心，有的，但是因為量太少看不見罷了）用槍小心吸去所有上清，在超凈台中乾燥5min。
1.7 加入適量DEPC處理水。（如果材料來源豐富的話，加入的水量為下一步RT的total減去其他試劑的量；若要省著點用，則自己看著辦了，盡量不要加太多的水）。
1.8 建議立即做RT。若要保存，可在上一步加入乙醇後凍存於－70℃，可保存一年；若加入DEPC水後則只能在－20℃保存1個月左右。
三、Trizol法提禽流感病毒protocol
Trizol法適用於人類、動物、植物、微生物的組織或培養細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
1、 取雞胚尿囊液，加入5-10倍體積 Trizol液，混勻；
2、 室溫放置5分鍾，然後以每1ml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖盪離心管15秒；
3、 取上層水相於一新的離心管，按每ml Trizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鍾，12000g離心10分鍾；
4、 棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，混勻，4℃下7500g離心5分鍾；
5、 重復第4步；
6、 小心棄去上清液，然後室溫乾燥5-10分鍾，注意不要乾燥過分，否則會降低RNA的溶解度；
7、 然後將RNA溶於水中，放置10分鍾。
[注意]
1、 整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作。
2、 加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年
真核生物的基因組是DNA，為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區，稱為內元（intron），真正編碼蛋白的區段是被這些內元隔開的，這些編碼區叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉錄成為RNA之後，經過剪切和拼接，去掉這些非編碼區，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA裡面會含有非編碼區。要表達真核生物的基因並表達出相應的蛋白，只能通過提取其mRNA並RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1．RNA的提取
RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細胞或者組織，然後經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉澱，洗滌，晾乾，最後溶解。但是由於RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。
1．1 分離高質量RNA
成功的cDNA合成來自高質量的RNA。高質量的RNA至少應保證全長並且不含逆轉錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。RNA的質量決定了你能夠轉錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍／酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結果。另外，分離poly(A)+RNA會導致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產生偏差。然而，當分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1．2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶
在所有RNA實驗中，最關鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由於RNA酶廣泛存在而穩定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在於操作人員的手汗、唾液等，也可存在於灰塵中。在其它分子生物學實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃製品、塑料製品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。而各種組織和細胞中則含有大量內源性的RNA酶。
1．3 常用的RNA酶抑制劑
*焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環結合使蛋白質變性，從而抑制酶的活性。
*異硫氰酸胍：目前被認為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細胞結構使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。
*氧釩核糖核苷復合物：由氧化釩離子和核苷形成的復合物，它和RNA酶結合形成過渡態類物質，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑製作用。
1．4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和准備的工作
*盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區，離心機、移液器、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，並定期進行除菌。
*操作過程中應始終戴一次性橡膠手套和口罩，並經常更換，以防止手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內或污染用具。盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料製品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。
*關於一次性塑料製品，建議使用廠家供應的出廠前已經滅菌的tips和tubes等。多數廠家供應的無菌塑料製品很少有RNase污染，買來後可直接用於RNA操作。用DEPC等處理的塑料製品，往往由於二次污染而帶有RNase，從而導致實驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應在使用前於180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。
*無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通常可以消除RNase的活性。
*配製溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應採用未開封的新瓶裝試劑。
*塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇乾燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然後用0.1% DEPC水沖洗，晾乾。
*配製的溶液應盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然後用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應當用DEPC處理過的無菌雙蒸水配製，然後經0.22μm濾膜過濾除菌。
1．5 RNA提取的一般步驟
RNA提取的一般步驟是：破碎組織→分離RNA→沉澱RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA
破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
分離RNA一半用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布於上層，與蛋白層分開。
沉澱RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇。
洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之後可以晾乾或者烤乾乙醇，但是不能過於乾燥，否則不易溶解。
融解RNA一般使用TE。
保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對於長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大於4kb的轉錄本對於痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲醯胺中，存於-70℃。用於保存RNA的甲醯胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源於胰臟的RNA至少可以在甲醯胺中保存一年。當准備使用RNA時，可以使用下列方法沉澱RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鍾。
1．6RNA抽提新方法-TRIZOL法
TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性。加入氯仿後離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在於水樣層中。收集上面的的水樣層後，RNA可以通過異丙醇沉澱來還原。在除去水樣層後，樣品中的DNA和蛋白也能相繼以沉澱的方式還原。乙醇沉澱能析出中間層的DNA，在有機層中加入異丙醇能沉澱出蛋白。共純化DNA對於樣品間標准化RNA的產量十分有用。
TRIZOL是有毒物，接觸皮膚或者不慎吞服，會導致灼傷，一旦接觸皮膚後立即以大量的洗滌劑和清水清洗。TRIZOL在室溫下能穩定保存12個月。盡管如此，為達到最佳效果，建議保存在2-8°C的環境下。
2．RT-PCR
RT-PCR是指將逆轉錄(Reverse Transcription；RT)反應和PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。
2．1 RT-PCR的原理
RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用於對表達信息進行檢測或定量。另外，這項技術還可以用來檢測基因表達差異或不必構建cDNA文庫克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及S1核酸酶分析在內的RNA分析技術，更靈敏，更易於操作。
RT-PCR的模板可以為總RNA或poly(A)+選擇性RNA。逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物（GSP）起始。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然後取出1/10的反應產物進行PCR。在一步法RT-PCR中，逆轉錄和PCR在同時為逆轉錄和PCR優化的條件下，在一隻管中順次進行。
2．2 RT-PCR的步驟
⑴在冰浴離心管裡面加入模板RNA 4uL，引物2uL，去離子水5uL，混勻，離心3-5秒；
⑵70度水浴5分鍾，冰浴30秒（此處是為了使引物和模板正確配對）；
⑶加入5×反應液4uL，RNase抑制劑1uL，dNTP 2uL（這些應該先配好，然後分再裝到每一管），混勻；
⑷37度水浴5分鍾，加入1uL AMV-RT反轉錄酶，混勻；
⑸37度水浴1小時（此步是反轉錄過程）；
⑹70度10分鍾結束反應（此處是滅活酶活性，避免對後續實驗產生干擾），產物置冰上進行下一步PCR實驗，餘下的-70度保存。
2．3 RT-PCR的引物設計
RT-PCR引物設計和一般PCR引物設計可以遵循同樣的原則。細心地進行引物設計是PCR中最重要的一步。理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點，而設計失敗的引物則各有各的缺點：
* 典型的引物18到24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是長度大於24核苷的引物並不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。
* 選擇GC含量為40％到60％或GC含量反映模板GC含量的引物。
* 設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。
* 避免引物對3'末端存在互補序列，這會形成引物二聚體，抑制擴增。
* 避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。
* 避免3'末端的錯誤配對。3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。
* 避免存在可能會產生內部二級結構的序列，這會破壞引物退火穩定性。
目的序列上並不存在的附加序列，如限制位點和啟動子序列，可以加入到引物5'端而不影響特異性。當計算引物Tm值時並不包括這些序列，但是應該對其進行互補性和內部二級結構的檢測。
引物的穩定性依賴於儲存條件。應將乾粉和溶解的引物儲存在-20℃。以大於10μM濃度溶於TE的引物在-20℃可以穩定保存6個月，但在室溫（15℃到30℃）僅能保存不到1周。乾粉引物可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃到30℃）最多可以保存2個月。
2．4 引物退火溫度
引物的另一個重要參數是熔解溫度（Tm）。這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對於設定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結合。合理的退火溫度從55℃到70℃。退火溫度一般設定比引物的Tm低5℃。
根據所使用的公式及引物序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點。可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低於估算的Tm 5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成。為獲得最佳結果，兩個引物應具有近似的Tm值。引物對的Tm差異如果超過5℃，就會由於在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始。如果兩個引物Tm不同，將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃。或者為了提高特異性，可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環，然後再根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的循環。這使得在較為嚴謹的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。
2．5 提高逆轉錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助於RNA二級結構的打開，增加了反應的產量。對於多數RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然後迅速置於冰上冷卻，可以消除大多數二級結構，從而使引物可以結合。然而某些模板仍然會存在二級結構，即使熱變性後也是如此。較高的保溫溫度也可以增加特異性，尤其是當使用基因特異性引物（GSP）進行cDNA合成時。如果使用GSP，確保引物的Tm值與預計的保溫溫度相同。不要在高於60℃時使用oligo(dT)和隨機引物。隨機引物需要在增加到60℃前在25℃保溫10分鍾。除了使用較高的逆轉錄溫度外，還可以通過直接將RNA/引物混合物從65℃變性溫度轉到逆轉錄保溫溫度，並加入預熱的2×的反應混合物提高特異性（cDNA熱啟動合成）。這種方法有助於防止較低溫度時所發生的分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度切換。
2．6 促進逆轉錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內的添加劑加到第一鏈合成反應中，可以減低核酸雙鏈的穩定並解開RNA二級結構，最多可以加入20％的甘油或10％的DMSO而不影響或MMLV的活性。AMV也可以耐受最多20％的甘油而不降低活性。為了在逆轉錄反應中最大限度提高RT-PCR的靈敏度，可以加入10％的甘油並在45℃保溫。如果1/10的逆轉錄反應產物加入到PCR中，那甘油在擴增反應中的濃度為0.4％，這不足以抑制PCR。
在逆轉錄反應中經常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產量。RNase抑制劑要在第一鏈合成反應中，在緩沖液和還原劑（如DTT）存在的條件下加入，因為cDNA合成前的過程會使抑制劑變性，從而釋放結合的可以降解RNA的RNase。蛋白RNase抑制劑僅防止RNase A，B，C對RNA的降解，並不能防止皮膚上的RNase，因此盡管使用了這些抑制劑，也要小心不要從手指上引入RNase。
使用無RNaseH活性（RNaseH-）的逆轉錄酶：逆轉錄酶催化RNA轉化成cDNA，不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，並降解RNA：DNA復合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產量和長度。因此消除或大大降低逆轉錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。RNaseH-的MMLV逆轉錄酶及RNaseH-的AMV，比MMLV和AMV能得到更多量和更多全長。RT-PCR靈敏度會受cDNA合成量的影響。RT-PCR產物的大小受限於逆轉錄酶合成cDNA的能力，尤其是克隆較大的cDNA時。RNaseH-的逆轉錄酶可以顯著提高長RT-PCR產物的產量，同時增加了熱穩定性，所以反應可以在高於正常的37-42℃的溫度下進行。
2．7 RNaseH處理
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應可以提高靈敏度。對於某些模板，據認為cDNA合成反應中的RNA會阻止擴增產物的結合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當擴增較長的全長cDNA目標模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的。對這種困難模板，RNaseH的處理加強了或AMV合成的cDNA所產生的信號。對於多數RT-PCR反應，RNaseH處理是可選的，因為95℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復合物中的RNA水解掉。
2．8 小量RNA檢測方法的提高
當僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助於增加小量樣品的產量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。糖元是水溶性的，可以同RNA保持在水相中以輔助隨後的沉澱。對於小於50mg的組織或106個培養細胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。
2．9 一步法同兩步法RT-PCR的比較
兩步法RT-PCR比較常見，在使用一個樣品檢測多個mRNA時比較有用。然而一步法RT-PCR具有其他優點。一步法RT-PCR在處理大量樣品時易於操作，有助於減少殘余污染，因為在cDNA合成和擴增之間不需要打開管蓋。一步法可以得到更高的靈敏度，最低可以達到0.1pg總RNA，這是因為整個cDNA樣品都被擴增。對於成功的一步法RT-PCR，一般使用反義的基因特異性引物起始cDNA合成。
2．10 增加RT-PCR特異性
第一鏈cDNA合成的起始可以使用三種不同的方法，各種方法的相對特異性影響了所合成cDNA的量和種類。
隨機引物法是三種方法中特異性最低的。引物在整個轉錄本的多個位點退火，產生短的，部分長度的cDNA。這種方法經常用於獲取5'末端序列及從帶有二級結構區域或帶有逆轉錄酶不能復制的終止位點的RNA模板獲得cDNA。為了獲得最長的cDNA，需要按經驗確定每個RNA樣品中引物與RNA的比例。隨機引物的起始濃度范圍為50到250ng每20μl反應體系。因為使用隨機引物從總RNA合成的cDNA主要是核糖體RNA，所以模板一般選用poly(A)+RNA。
Oligo(dT)起始比隨機引物特異性高。它同大多數真核細胞mRNA 3'端所發現的poly(A)尾雜交。因為poly(A)+RNA大概占總RNA的1%到2％，所以與使用隨機引物相比，cDNA的數量和復雜度要少得多。因為其較高的特異性，oligo(dT)一般不需要對RNA和引物的比例及poly(A)+選擇進行優化。建議每20μl反應體系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18適用於多數RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因為其熱穩定性較好，適用於較高的保溫溫度。
基因特異性引物（GSP）對於逆轉錄步驟是特異性最好的引物。GSP是反義寡聚核苷，可以特異性地同RNA目的序列雜交，而不象隨機引物或oligo(dT)那樣同所有RNA退火。用於設計PCR引物的規則同樣適用於逆轉錄反應GSP的設計。GSP可以同與mRNA3'最末端退火的擴增引物序列相同，或GSP可以設計為與反向擴增引物的下游退火。對於部分擴增對象，為了成功進行RT-PCR，需要設計多於一個反義引物，因為目的RNA的二級結構可能會阻止引物結合。建議在20μl的第一鏈合成反應體系中使用1pmol反義GSP。
2．11 提高逆轉錄保溫溫度
為了充分利用GSP特異性的全部優點，應該使用有較高熱穩定性的逆轉錄酶。熱穩定逆轉錄酶可以在較高溫度保溫以增加反應嚴謹性。比如，如果一個GSP退火溫度為55℃，那麼如果使用AMV或M-MLV在低嚴謹性的37℃進行逆轉錄，GSP所帶有的特異性就沒有完全利用。然而某些特別的逆轉錄酶可以在50℃或更高進行反應，這就會消除較低溫度時產生的非特異性產物。為獲得最大的特異性，可以將RNA/引物混合物直接從65℃變性溫度轉移到逆轉錄保溫溫度。這有助於防止低溫時分子間鹼基配對。使用PCR儀可以簡化RT-PCR所需的多種溫度轉換。
2．12 減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中沾染的基因組DNA。使用較好的RNA分離方法，如Trizol，會減少RNA制備物中沾染的基因組DNA。為了避免產生於基因組DNA的產物，可以在逆轉錄之前使用擴增級的DNaseⅠ對RNA進行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鍾以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發生的依賴於鎂離子的RNA水解。
為了將擴增的cDNA同沾染的基因組DNA擴增產物分開，可以設計分別同分開的外顯子退火的引物。來源於cDNA的PCR產物會比來源於沾染的基因組DNA的產物短。另外對每個RNA模板進行一個無逆轉錄的對照實驗，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉錄時所得到的PCR產物來源於基因組。