放射免疫分析方法第二抗體作用

『壹』 放射免疫法的簡介

放射免疫法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發生競爭性抑制反應的方法，研究機體對抗原物質反應的發生、發展和轉化規律。美國女免疫學家雅洛，因創立了放射免疫法而榮獲1977年諾貝爾生理學及醫學獎。雅洛1921年生於紐約。父母都是猶太人，她從小酷愛自然科學。在大學里，她熱衷於物理學，卻致力於醫學研究，她工作於紐約市布隆克斯區退伍軍人醫院，致力於「勝太荷爾蒙的放射免疫分析」。居里夫人自傳和核子物理學家美籍義大利人費米的講演，對她後來的事業產生了很大的影響。她渴望從事科學研究工作。然而，當時的美國，哪個大學也不同意將一筆物理學獎金給一個女人。她主動給一位傑出的化學家當非全日制秘書。由於工作出色，幾個月後，伊利諾依大學給了她一份獎學金，並給了她一個助理研究員的位置。從1941年到1945年，她把主要精力都用在三項活動上：教學、鑽研高深課題和准備核物理博士論文。她於1945年獲得博士學位。從1945年起，她邊授課，邊研究，邊著書立說，並在勃隆克斯醫院籌備和開發新的放射性同位素應用工作。
早在得獎的二十多年，雅蘿便在一個偶然的機會里，發現豬胰臟的胰島素可用來治療糖尿病，可以使病人產生抗體。這種發現與當時的治療理論不太合適。因為治療葯物能引起抗體是不可思議的事，因此其發現並不為當時的人所接受。然而，這個發現卻引導近代內分泌學的研究進入了新的境界，更由此而推展，使得已往不易測定的身體中的物質得以測定。這個方法就是放射免疫測定法，又叫放射免疫測定法（radioimmunoassav，簡稱RIA）。

『貳』 免疫分析方法有哪些

（1）放射免疫分析法（radioimmunoassay，RIA）。RIA技術是使用以放射性同位素（如125I、32P、3H等）作標記的抗原或抗體，用γ－射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ－射線或β－射線的放射性強度，來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）。前者以液相競爭結合法居多，既測大分子抗原又測小分子抗原；後者以固相法測大分子抗原為主。

RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重，建立了狄氏劑、艾氏劑、2，4－D和2，4，5－T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳（RIA通常為10-9g、10-12g，甚至10-15g），應用范圍廣，但進行RIA需使用昂貴的計數器，也存在放射線輻射和污染等問題，因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制，並逐步為其他免疫分析方法所取代。

（2）酶免疫分析法（enzymeimmunoassay，EIA）。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似，但所用的標記物為酶，它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來，通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）和鹼性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP）、葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GO）、脲酶（urease）等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板（MTP）作為固相支持物。這種板的檢測容量大，樣本數量多，只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究，其原理是將高分子材料（聚苯乙烯、聚氯乙烯等）包裹到金屬小顆粒（Fe2O3，Fe3O4）外面，再通過化學方法鍵合上氨基（－NH2）、羧基（－COOH）、羥基（－OH）等活性基團，再與抗體或抗原耦聯，製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大，吸附能力強，能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物，通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離，從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。

由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉，酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術，故近年來EIA技術發展很快，已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法（，ELISA）是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。

（3）熒光免疫分析法（fluorescenceimmunoassay，FIA）。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合，以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子，制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時，能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時，能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能，產生熒光。繪制農葯濃度－熒光強度曲線，可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。

適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求：①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團，或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構；②標記後，熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變；③熒光效率高，與蛋白質結合的需要量很少；④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速，游離的熒光素及其降解產物容易除去；⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定，可保存使用較長時間。

（4）化學發光免疫分析法（luminescentimmunoassay，LCIA）。LCIA又可分為化學發光免疫測定（chemiluminescentimmunoassay，CLCIA）和生物發光免疫測定（bio-luminescentImmunoassay，BLCIA）。

1976年，Shroeder首先用生物素（B）－親和素（A）系統建立了均相化學發光免疫測定技術，爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系，現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合，當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後，底物與酶作用，或與發光劑產生氧化還原反應，或使熒光物質（例如紅熒烯等）激發，釋放光能。最後用光度計測定其發光強度，進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶（HRP）、魯米諾（luminol）、異魯米諾（isoluminol）、咯粉鹼（lophine）、光澤精（lucigen）、雙（2、4、6－三氯苯）草酸酯、聯苯三酚和6[N-（4－二氨基丁基）－N－乙基]－氨基-2，3－二氫吩嗪-1，4－二酮（ABEI）等。用上述發游標記物標記的抗體（或抗原）在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原（或抗體）結合時，在協同因子（例如H2O2等）的作用下發光，其發光強度與被測物的濃度成正比，故可以用於定量分析。

發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高（檢測限量達10-15mol/L）、快速（1～3h）、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。

（5）金免疫層析分析法（goldimmuno-chromatographyassay，GICA）。GICA檢測原理是將配體（抗體或抗原）以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上，膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上，通過毛細作用，使樣品溶液在層析條上泳動，當泳動至膠體金標記物處時，如樣品中含有待檢受體，則發生第一步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時，發生第二步高度特異性的免疫反應，形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區，通過標記的膠體金而顯紅色條帶（檢測帶），而游離的標記物則越過檢測帶，與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。

2金標試紙條檢測

GICA法具有快速（5～20min）、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法，該方法檢測靈敏度稍低，主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域，尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。

（6）免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少，而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法（LC）聯合起來使用，從而簡化了分析方法，提高了檢測效率。LC-IA的聯用，將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜（GC/MS）的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應，以降低假陽性。

『叄』 免疫學在生命科學中的地位和作用

1、免疫學是當今生命科學學科和支撐學科的現代醫學的前沿陣地之一。人類的免疫系統來執行的免疫功能。免疫系統，包括免疫器官，免疫細胞和免疫分子。

2、從實質上說，現代免疫學不過是生物醫學的一個分支。但是，隨著科學技術的發展，它本身又派生出許多獨立的分支學科，例如，與現代生物學有密切關系的分子免疫學、免疫生物學和免疫遺傳學，與醫學有密切關系的免疫血液學、免疫葯理學、免疫病理學、生殖免疫學、移植免疫學、腫瘤免疫學、抗感染免疫學、臨床免疫學等。

3、21世紀初期我們對免疫學的研究已經達到細胞水平和分子水平，人們正在努力探討生物的基本生理規律——免疫的自身穩定機制。醫學中的許多重要問題，如自身免疫、超敏反應、腫瘤免疫、移植免疫、免疫遺傳等，必將得到更好的解決。

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免疫學研究的發展應用：

新中國成立以來，免疫學在醫學上的應用已經有了很大進展。防治傳染病的生物製品不僅滿足國內的需要，而且支援其他一些國家。21世紀初期研製的新疫苗如化學疫苗、乙型肝炎疫苗等，已經接近世界先進水平。中國已經消滅天花，並且基本上消滅和控制了人間鼠疫和真性霍亂等烈性傳染病。脊髓灰質炎、麻疹、白喉、百日咳、破傷風等常見傳染病的發病率已經大大降低。

現代免疫學逐步發展成為既有自身的理論體系、又有特殊研究方法的獨立學科。它為生物學的研究提供了一些新的手段。

早在20世紀初，人們已經利用免疫學來區分人類的血型。植物分類學很早就應用免疫學的方法。在研究植物和動物的毒素時也採用了免疫學技術。例如，1889～1890年，人們用免疫學技術研究白喉毒素和破傷風毒素，隨後又用它來研究植物毒素，如蓖麻毒素、巴豆毒素和動物毒素中的蛇毒、蜘蛛毒。另外，人們很早就利用沉澱反應鑒別動物的血跡。21世紀初期發展起來的一些新技術，如放射免疫、免疫熒光和酶免疫等，都為生物學提供了實用的研究手段。

『肆』 大家誰知道放射免疫法詳細的實驗步驟嗎，拜託大家了

(一)液相放射免疫測定
1．抗原一抗體反應
將抗原(標准品和受檢標本)、標記抗原和抗血清按順序定量加入小試管中，在一定溫度下反應一定時間，使競爭抑制反應達到平衡。不同質量的抗體和不同含量的抗原對溫育的溫度和時間有不同的要求。
2．B、F分離技術
在RIA反應中，標記抗原和特異性抗體的含量極微，形成的結合態標記抗原(B)不能自行沉澱，因此需用一種合適的沉澱劑使它徹底沉澱，以完成與游離標記抗原(F)的分離。另外對小分子量的抗原也可採取吸附法使B與F分離。
(1)第二抗體沉澱法 這是RIA中最常用的一種沉澱方法。將產生特異性抗體(第一抗體)的動物(例如兔)的IgG，製得羊抗兔IgG血清(第二抗體)。由於在本反應系統中採用第一、第二兩種抗體，故稱為雙抗體法。在抗原與特異性抗體反應後加入第二抗體，形成由抗原一第一抗體一第二抗體組成的雙抗體復合物。但因第一抗體濃度甚低，其復合物也極少，無法進行離心分離，為此在分離時加入一定量的與第一抗體同種動物的血清或Ig，使之與第二抗體形成可見的沉澱物。與上述抗原的雙抗體復合物形成共沉澱。經離心即可使含有結合態標記抗原(B)的沉澱物沉澱，與上清液中的游離標記抗原(F)分離。
(2)聚乙二醇(PEG)沉澱法 最近各種RIA反應系統逐漸採用了PEG溶液代替第二抗體作沉澱劑。PE(；沉澱劑的主要優點是制備方便，沉澱完全。缺點是非特異性結合率比用第二抗體高，且溫度高於30~C：時沉澱物容易復溶。
此外，B、F分離技術還有PR試劑法和活性炭吸附法等。 ．
3．放射性強度的測定
B、F分離後，即可進行放射性強度的測定。測量儀器有兩類，即液體閃爍計數儀和晶體閃爍計數儀。
計數單位是探測器輸出的電脈沖數，單位為cpm(計數／min)，也可用cps(計數／s)表示。如果知道這個測量系統的效率，還可算出放射源的強度，即dpm(衰變／min)或dps(衰變／s)。
每次測定均需作標准曲線圖，以標准抗原的不同濃度為橫坐標，以在測定中得到的相應放射性強度為縱坐標作圖。放射性強度可任選B或F，也可用計算值B／(B+F)、B／F和B／B0。標本應作雙份測定，取其平均值，在製作的標准曲線上查出相應的受檢抗原濃度。
(二)固相放射免疫測定方法(以雙層非競爭法為例)
1．抗體的包被
先將抗體吸附於固相載體表面，製成免疫吸附劑。常用的固相載體為聚苯乙烯，形狀有管、微管、小圓片、扁圓片和微球等。還可根據自己的工作設計新的形狀，以適應特殊的需要。
2．抗原抗體反應
免疫吸附劑與標本一起溫育時，標本中的抗原與固相載體上的抗體發生免疫反應。當加入標記的抗體後，由於抗原有多個結合點，又同標記抗體結合，最終在固相載體表面形成抗體一抗原一標記抗體免疫復合物。
3．B、F分離
用緩沖液洗滌除去游離的標記抗體，使B、F分離。
4．放射性強度的測定
測定固相所帶的放射性計數率(cpm)：設樣品cpm值為P，陰性對照標本cpm值為N，P／N≥2．1為陽性反應。標本中的抗原越多，最終結合到固相載體上的標記抗體越多，其pm值也就越大；反之則小。當標本中不存在抗原時；其cpm值應接近於儀器的本底計數。

『伍』 放射免疫法有什麼用處

放射免疫法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發生競爭性抑制反應的方法，研究機體對抗原物質反應的發生、發展和轉化規律。美國女免疫學家雅洛，因創立了放射免疫法而榮獲1977年諾貝爾生理學及醫學獎。

1950年開始，雅洛專門從事放射同位素的研究。她與她的合作者貝爾森博士合作了20年，共同創立了放射免疫檢驗方法。放射免疫法包括兩個方面的技術：第一是生物學方面的。它利用特殊抗體的反應，甄別所給定的有機物質；第二是物理學方面的。它將有放射性的原子引入有機物質中，給這些有機物質打上記號。放射免疫法，是一種靈敏度高、較簡便的測量法，幾乎可測定生物體內任何物質，包括生物體本身分泌的各種激素，病人口服或注射的各種葯物，一些病毒抗原等，已廣泛用於臨床常規檢驗。

『陸』 測小鼠血清激素放射免疫測定和酶聯免疫哪個好

利用同位素標記的與未標記的抗原同抗體發生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法。又稱競爭性飽和分析法。1960年美國化學家R.S.耶洛和S.A.貝爾森提出此法，耶洛因此於1977年獲得諾貝爾生理學或醫學獎。
耶洛1921年生於紐約。父母都是猶太人，她從小酷愛自然科學。在大學里，她熱衷於物理學，卻致力於醫學研究，她工作於紐約市布隆克斯區退伍軍人醫院，致力於「勝太荷爾蒙的放射免疫分析」。居里夫人自傳和核子物理學家美籍義大利人費米的講演，對她後來的事業產生了很大的影響。她渴望從事科學研究工作。然而，當時的美國，哪個大學也不同意將一筆物理學獎金給一個女人。她主動給一位傑出的化學家當非全日制秘書。由於工作出色，幾個月後，伊利諾依大學給了她一份獎學金，並給了她一個助理研究員的位置。從1941年到1945年，她把主要精力都用在三項活動上：教學、鑽研高深課題和准備核物理博士論文。她於1945年獲得博士學位。從1945年起，她邊授課，邊研究，邊著書立說，並在勃隆克斯醫院籌備和開發新的放射性同位素應用工作。
早在得獎的二十多年，耶洛便在一個偶然的機會里，發現豬胰臟的胰島素可用來治療糖尿病，可以使病人產生抗體。這種發現與當時的治療理論不太合適。因為治療葯物能引起抗體是不可思議的事，因此其發現並不為當時的人所接受。然而，這個發現卻引導近代內分泌學的研究進入了新的境界，更由此而推展，使得已往不易測定的身體中的物質得以測定。這個方法就是放射免疫測定法，又叫放射免疫測定法（radioimmunoassav，簡稱RIA）。80年代初，應用此法測定的生物活性物質已達300種以上。

『柒』 抗原抗體反應的應用

（1）抗原：免疫動物是制備抗血清的第—步。免疫所用的抗原可用病毒、細菌或者其他蛋白質抗原，如果使用半抗原如小分子激素等，必須與大分子載體連接。抗原的用量視抗原種類及動物而異，—次注射小鼠可以少至幾個微克，免、羊甚至更大的動物每次注射的量就相應增加，從幾百μg/次至幾mg/次。
〔2）佐劑及乳化：佐劑可以幫助抗原在注射部位緩慢釋放，以增加免疫刺激的效果。佐劑有完全和不完全佐劑之分。完全佐劑加有滅活的分枝桿菌（如卡介苗）或棒狀桿菌。福氏佐劑可從試劑公司購買，也可用羊毛脂和石蠟油按1：2—4混合自行制備。佐劑與抗原按1：1的比例混合乳化為均勻的乳液，放置後不會發生油水分離。
（3）免疫動物：常用於制備抗血清的動物打豚鼠、家免、小鼠、大鼠等，如果大量生產可用動物羊、馬等，動物接受免疫的乳液量小鼠為1．0—2．0 mL，家兔為2—4mL。抗原免疫動物的途徑取決於動物種類、抗原特性和是否使用佐劑。腹腔注射（i．p），肌肉注射（i．m），皮內注射（i．d．）和皮下注射(s．c．）適合於任何抗原，這些途徑主要刺激局部淋巴結發生免疫應答，初次免疫和免疫加強注射均可使用。靜脈注射（i.v.）則只適合於可溶性抗原及分散的單細胞懸液，且不能使用佐劑，其誘發的免疫應答主要發生在脾臟。此外，在單克隆抗體制備時，亦可用脾臟直接注射或體外免疫方法，尤其對微量抗原比較實用。體外免疫方法也常用於人源單克隆抗體的制備。體外免疫時將脾細胞或外周血淋巴細胞（包括B細胞，T細胞及抗原遞呈細胞）與抗原一起作體外培養，然後再與骨髓瘤細胞融合。初次免疫後要經過2—3次以上的免疫加強以保證能形成較高水平的IgC抗體。兩次免疫注射之間的時間間隔，一般3—4周比較適合大部分動物，小動物可間隔10—14d，大動物則在2月左右。在免疫加強最後一次注射後的一周內採集抗血清，可獲得高水平的抗體。 （1）采血：加強免疫的動物2—3次後，可通過耳靜脈或眼球（小鼠）采血，進行抗血清效價測定。當效價達到理想的高度後，可以采血。采血方式可以從心臟直接取血，也可通過動脈放血。待血液凝固後用針筒或吸管吸取血清。
（2）抗血清的純化與保存：除抗體外血清中含有多種其他蛋白成分。為了避免這些蛋白質干擾抗體（免疫球蛋白）標記反應和抗原抗體反應，抗血清可經過純化以獲得單一的機體（常為IgG）組分。常用的純化IgG的方法為飽和硫酸胺鹽析和層析法。蛋白質在不同的鹽濃度的溶液中，其溶解度不一樣，鹽離子干擾蛋白質和水分子間氫鍵形成，因為水—鹽結合比水—蛋白質結合更穩定，蛋白質即可從溶液中沉澱出來。蛋白質分子越大，沉澱時所需鹽離子濃度越低。免疫球蛋白（Mr 1.5×105）比血清中主要蛋白質白蛋白（M r 6.7×104）的分子大得多，抗體在30%—50%飽和度的硫酸鹽中析出，而白蛋白需在70%—80%飽和度才析出，因此常用33%飽和度的硫酸胺純化血清中的IgG。鹽析時為了減少抗體變性，需在4℃進行，同時用pH8.0緩沖液稀釋抗血清，以減少蛋白濃度過高而發生共沉澱。銨鹽的溶解度不隨溫度變化而明顯改變，0℃和25℃僅差3%，而鈉鹽則相差5倍，因此常在低溫沉澱時用銨鹽，室溫沉澱用鈉鹽。銨鹽對抗體的標記反應（如FITC和biotin標記時）有一定的干擾作用。
鹽析法只能部分純化抗體，更高純度的抗體制劑可用層析法制備。IgM五聚體相對分子質量達9.7×10，比血清中任何其他蛋白都大，用分子篩層析很容易將其純化。IgG在PH 8．0時帶負電荷，能與DEAE纖維素上的陽離子結合，因此可用離子交換層析來純化IgG。IgG純化最常用的方法為親和層析。IgG與葡萄球菌A蛋白和鏈球菌G蛋白具合高度的親和性，可用這兩種蛋白質交聯親和層析柱將IgG純化。大部分IgG與蛋白A結合PH為8—9，洗脫PH為2—4；而與蛋白G的結合PH為5—7，洗脫PH為9—10。C蛋白更適合於IgG的純化，不但反應條件為溫和的弱酸性或弱鹼性，並且與IgG的結合力高於A蛋白。G蛋自能與大部分動物種類的IgG結合，而A蛋白對小鼠IgG1、大鼠IgG2b、人IgG3、馬和綿羊IgG結合力弱或不能結合G蛋白和A蛋白均不能與雞IgG結合。
抗血清或純化的抗體在低溫保存可維持活性數年，反復凍融使抗體很快失活，被細菌或黴菌污染的抗血清或IgG製品也易失去活性。稀釋的抗血清加入防腐劑疊氮化鈉和保護劑如BSA等可於4℃保存。長期保存常用等量甘油於—20℃以下冷藏。也可置於 50%飽和硫酸銨中4℃保存，還可以冷凍乾燥保存。 根據不同目的制備的抗血清，對其中所含抗體的濃度，特異性及免疫球蛋白種類的要求也不一樣。為了獲得質量和數量上合符要求的抗血清，在收集動物血清前必須對免疫效果進行檢測，對收獲後的抗血清也必須對—些參數進行分析，如效價、親和力及交叉反應等。根據不同的抗原性質選用合適的檢測方法。最常用的為免疫沉澱，ELISA，放射免疫等。
效價又稱滴度（titer），是常用於表達抗血清中特異性抗體相對含量的—個半定量指標，即在給定的條件下，結合—定量抗原的抗血清的稀釋度。抗血清經一系列稀釋後（如倍比稀釋）與定量的抗原反應，以能檢測抗血清最大稀釋倍數即為該抗血清的效價。不同的檢測方法測定同一種抗血清的效價，靈敏度不一樣，抗血清的效價也不一樣，如沉澱反應（瓊脂雙擴散）與ELISA二者的效價相差甚大，後者遠高於前者。放射免疫分析（RIA）常用於標記小分子抗原來檢測抗血清的效價。
親和力（affinity）表示抗血清與相應抗原的結合強度，是描述抗體持異性的重要指標，
常用親和常數K表示。親和常數K與抗原抗體反應的平衡常數有關：
抗體特異性與交叉反應：抗體是特異的。只與相應抗原反應。實際制備的抗體卻常有非特異性反應，這是因為抗原不純造成的。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇，或者兩個抗原決定簇結構類似能與同一抗體結合，均可出現抗體與異源抗原的交叉反應。用瓊脂雙擴散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應。 原理1：單克隆抗體（MAb）與抗血清（又稱多克隆抗體，PAb）最主要的區別是MAb為單一種B細胞克隆所產生的一種均一的免疫球蛋白分子。所以MAb是B細胞克隆的標志，是一種獨特型的抗體，它的特異性是針對一個抗原決定簇的。制備單克隆抗體不能用化學分離的方法從多克隆抗體中去分離純化得到它，而是用分離產生抗體的B細胞克隆的方法得到它。為了使B細胞克隆能在體外人工培養下長期存活並產生完全均一的MAb，G．KÖhler合Milstein於1975年創立了雜交瘤方法。所以制備單克隆抗體的技術又稱雜交瘤技術（hybredoma technique）。
雜交瘤技術的基本原理是用分泌抗體但不能長期培養的B細胞與能在體外長期培養並可低溫保存的腫瘤細胞進行雜交。篩選得到的雜交瘤細胞應該是既能分泌抗體又有瘤細胞的特性，可長期傳代培養，又可在液氮中保存的細胞。把這些細胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細胞進行單克隆抗體的生產。
原理：最常用的單克隆抗體是小鼠的單抗，此外也有大鼠的和人源的單抗。人源單抗制備比較復雜。小鼠單抗的制備通常是使用Balb/c小鼠的B細胞和它的骨髓瘤細胞。大鼠的單抗制備通常用Lou/c大鼠及其骨髓瘤和Y3/AO大鼠及其骨髓瘤細胞。B細胞是從免疫動物的脾臟中分離出來的。動物免疫方法與抗血清制備相同，只是在制備脾臟前3d必須進行一次靜脈加強注射以保證得到的B細胞有旺盛的分泌抗體的活性。骨髓瘤細胞有許多細胞株是經過誘變和篩選得到的缺陷型。篩選的標準是①瘤細胞本身不產生抗體或者產生抗體的某種鏈，但不能分泌；②是次黃嘌呤鳥嘌呤核苷酸轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶激酶（TK）的缺陷型。因為這種缺陷型的瘤細胞正常的核酸合成途徑被氨基喋吟（aminopterin）阻斷後，由於缺失這些酶，即使補充它的底物次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T），核酸合成的旁路也不能起到救援的作用，結果導致瘤細胞死亡（圖7—2）。而雜交瘤細胞因帶有B細胞的全套基因，在HAT存在的條件下藉助於HGPRT和TK的作用通過替代的核酸合成途徑能正常合成DNA和RNA。所以雜交瘤能正常地生長繁殖而被選擇出來。未被融合的游離的B細胞只能存活3d而後自行死亡。這就是用HAT培養基進行選擇的原理。 （1）融合：細胞雜交之前，要分別准備好脾臟的B細胞懸液和小鼠骨髓瘤細胞（如SP2/0—Agl4細胞株）。免疫後的小鼠脾臟在無菌條件下破碎，將B細胞懸浮在沒有血清的培養液中（通常使用RPMIl640商品配製），並洗滌3次去掉小鼠的血清。SP2/0細胞是用加有10%胎牛或小牛血清培養的，每天更換新鮮培養液使成為對數分裂期生長旺盛的細胞。細胞用RPMIl640洗滌2—3次，把兩種細胞合並在同—試管中，用50%的聚乙二醇（相對分子質量為1000—1500）作為融合劑，在37℃條件下融合l—2min。然後用1640培養液緩慢稀釋，然後除去PEG，將細胞分散至HAT選擇培養板中。電融合方法也可用於單克隆抗體制備，雖融合率較高，但一次融合的細胞數少，且需專門設備，故限制了其廣泛使用。融合時脾細胞和骨髓瘤細胞的比例在5：1—10：1均可獲得滿意結果，每次融合細胞數量在10—10較為合適。融合後的細胞在40或96孔板上的HAT培養液(RPMIl640含10%—20%胎牛或小牛血清和HAT）中37℃，5%CO2條件下培養。融合後的細胞懸液中只有脾細胞和骨髓瘤細胞形成的雜交瘤細胞能在HAT培養基中生長，其他形式的融合細胞均不能生長．未融合的細胞也不能在HAT培養液中生存。
在融合後的細胞培養過程中，飼養細胞（feeder cell）有助於雜交瘤細胞的生長。飼養細胞可用同種動物的腹腔細胞或胸腹細胞。腹腔細胞中的吞噬細胞能清除死亡細胞碎片。使背景更為清潔「干凈」。同時飼養細胞分泌的細胞因子或活性物質有助於雜交瘤細胞的生長。現有商品「雜交瘤細胞生長因子」可用於替代飼養細胞。
（2）陽性雜交瘤細胞的篩選與單克降化：雜交細胞經約10—14d培養後，形成可用的細胞集落（克隆）。經過幾次更換培養液（HT培養液）後進行抗體活性檢測。常用的篩選槍測方法是ELISA和凝集試驗，前者常用於可溶性抗原，後者適用於細胞、細菌等表面抗原。此外，Dot－ELISA、免疫印跡及免疫熒光試驗均可用於雜交瘤細胞的篩選。
使許多細胞克隆混合生長的細胞分離為單個的細胞克隆的過程稱克隆化（colonization）最常用的單克隆化方法是有限稀釋法（limited dilution），即將混合細胞經稀釋後分裝於培養板上，使培養板的大部分孔中只出現一個細胞。為了確保抗體分泌細胞來源於單個細胞，克隆化過程可重復進行，稱為亞克隆化（subclonization）。除有限稀釋法外，熒光激活細胞分揀法（FACS）也用於雜交瘤細胞的克隆化過程。 產生特異性抗體的單克隆雜交瘤細胞株應立即擴大培養，以獲得足夠的細胞用於保存和生產可供應用的抗體。生產大量單克隆抗體的方法目前常用的有3種：小鼠腹水制備、大瓶培養和中空纖維反應器，前者多用於實驗室制備，後二者適應於工廠化生產。
腹水制備：雜交骨髓瘤細胞在腹腔中定植，並產生大量腹水。選用與單克隆抗體制備所用相同的動物品系或者含有相同基因的Fl代雜交品系。雜交F1代品系更適合於腹水制備，如果用異源動物制備腹水時可選用無MHC限制性的裸鼠。用小鼠制備腹水時，先用礦物油或Pristane致敏，以抑制其免疫功能，利於腹水的形成。腹腔注射10—10個雜交瘤細胞，經過7—10 d後形成腹水。每隻小鼠可獲得3—5mL腹水，每mL含IgG抗體可達5—10mg。腹水中含有較多的雜蛋白和非特異性IgG，並且含有許多蛋白酶，易使抗體失活，因此腹水收集後應盡快純化，以防止降解。
大瓶培養：採用1000mL或更大的搖瓶培養。大瓶培養上清體積大，但抗體濃度低，給抗體純化帶來很大困難，消耗人力和培養液，增加生產成本。
中空纖維反應器：是比較經濟的單克隆抗體生產方法。該裝置由具有半透膜性質的成束的微孔纖維組成，雜交瘤細胞位於纖維外部的小量培養液中，培養液在纖維的微孔中循環，供給營養和帶走廢物，抗體大分子和小分子化合物被隔開。高密度的雜交瘤細胞能在此系統中維持數月，每天可產生數百毫克的抗體，抗體濃度高，體積小易於純化。
胎（小）牛血清一直是細胞培養所必須的，在單克隆抗體生產過程中培養液中的血清蛋白使抗體的純化增加了困難，近年開發的無血清培養技術已逐漸用於單克隆抗體的生產中。 小鼠的單克隆抗體蛋白應用於人體後，作為抗原能引起人的免疫應答，大大降低其生物活性，並可能導致變態反應。因此人源單克隆抗體在臨床治療上有廣泛應用前景，引起人們的普遍興趣。但是人單克隆抗體制備存在許多技術上和倫理上的障礙，如人雜交瘤細胞系不穩定，有些抗原不能對人進行人工免疫，人B細胞只能從外周血中分離而無法從脾臟取得等。盡管如此，一些人源單克隆抗體已經獲得，技術上也在逐步完善起來。
人的瘤細胞株U—266常用來與人外周血B細胞融合以獲得人源單克隆抗體。另一些淋巴母細胞抹（LCL）則來源於EB病毒轉化的淋巴細胞，如GMl500，W1—L2和ARH77等也用於雜交瘤細胞的制備。這些細胞系表現ED病毒核抗原（EBNA）陽性，且形成的雜交瘤細胞抗體的分泌水平不高。
獲得人單克隆抗體的另一方法是用EBV直接轉化某些抗體分泌細胞，使之成為「不死」的細胞在體外培養。EBV感染人B細胞後，病毒基因插入人B細胞基因組中，有1%的細胞轉化為「不死」的細胞。B細胞轉化可通過「病毒驅動」和「細胞驅動」兩種方法獲得。前者是將B細胞與分泌EBV的B95—8細胞系一同培養，後者則是與EBNA陽性的LCL細胞一同培養。「細胞驅動」轉化的B細胞比較穩定，抗體分泌能力也較強。
人淋巴母細胞系和人雜交瘤細胞較難獲得，人單克隆抗體也可以通過異源雜文的辦法制備，即將EBV轉化的B細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合，將獲得的異源雜交瘤細胞再與免疫後的B細胞融合，得到人單克隆抗體分泌細胞，不產生自身免疫球蛋白，EBVA也是陰性。 抗體的化學修飾：
抗體Fc段用雙功能連接劑與熒光素，同位素，酶，發光化合物，稀土元素以及葯物，毒素等連接後，並不影響其Fab功能區與特異性抗原結合。根據交聯物的性質不同，標記的抗體可用作診斷試劑，也可作為葯物的定向載體，引導葯物或毒素到達抗原存在部位使葯物或使毒素發揮更有效的作用，即俗稱「生物導彈」。從而減少葯物、毒素、同位素、酶在腫瘤治療過程中引起嚴重的副作用，大大提高治療腫瘤的效果。
許多毒素如蓖麻毒素，白喉毒素，天花粉，紅豆毒素等均為蛋白質或糖蛋白，可用雙功能劑與抗體相連；嗎啡，前列腺素，氨甲喋吟，磷酸酯酶C等含有羧基能用碳二亞胺（EDC），混合酸酐法與抗體的氨基形成醯胺鍵；同樣，含脂肪胺的葯物如慶大雷素，阿黴素在水溶性EDC的作用下與抗體的羧基連接；而含芳香胺的葯物則先在低溫下與亞硝酸作用形成重氮化合物，再與抗體分子上的酪氨酸或組氨酸殘基形成偶氮鍵。總之通過抗體的化學修飾把抗體的特異性用到定向給葯和定位檢測上。 抗體基因文庫（antibody recombination library）是將不同的重鏈和輕鏈基因隨機組合，克隆到合適的表達載體中，在原核細胞表達不同的抗體，形成一個抗體庫，從這個抗體庫中，用抗原可以篩選到相應的抗體基因。抗體基因來源於雜交瘤細胞或動物B細胞（免疫或未免疫）的DNA和mRNA。
用質粒作為抗體文庫的載體，雖然也可能表達有活性的抗體分子或片段，但由線狀噬菌體表達更為方便有效。M13、fd、F1等噬菌體的外殼蛋白由5種蛋白組成：pⅢ、pⅥ、pⅦ、pⅧ和pⅨ。每種含量不一，其中pⅧ含量最多，每個噬菌體有2700個pⅧ亞基，其餘4種蛋白僅5個拷貝。增加噬菌體外殼蛋白的長度並不影響噬菌體的裝配，抗體以融合蛋白的形式表達於噬菌體表面。噬菌體表達質粒常用的有fd－CAT1、fd－tet－DOG1、PHEN1、pComb3和pComb3H等。抗體融合蛋白構建多用pⅢ和pⅧ，pⅧ拷貝數高，低親和力的抗體蛋白容易篩選出來。
在噬菌體表達抗體時，常常不表達完整的抗體分子，（因為CH2上不能進行糖基化）。根據不同的引物得到重鏈的VH或VHCH1區，輕鏈的VL或VLCL區。VL和VH兩個片段用一短肽作連接片段，形成單鏈可變區（single－chain fragment variable，scFv）；VHCH1和VLCL兩片段則形成Fab片段。另外，單獨的VH和VL也能結合抗原，如果二者形成同源或異源二聚體（dAb），則穩定性和親和性明顯提高（圖7—4）。此外在抗體片段DNA末端加上一些功能蛋白（如鹼性磷酸酶和蛋白毒素）的基因，則表達的抗體就帶有一定生物活性功能片段，可用於檢測或治療。如果在抗體基因末端加上終止子（TAG）則表達的抗體片段是可溶性的，而不是結合在噬菌體表面。
用特異性抗原免疫的動物B細胞構建抗體的噬菌體文庫，抗體親和性高，用與免疫抗原不同的抗原篩選得到的抗體親和性普遍較低。可用模擬天然體細胞突變的方法來提高親和力。如混雜重組法，即將己獲得的輕鏈或重鏈的V片段切下，再克隆至隨機的文庫中的V區構成二級文庫，使H鏈和L鏈混雜，可以使抗體片段的親和性提高。利用PCR錯配將隨機突變引人至抗體的抗原結合區，也能提高對抗原的親和力。先用低親和力的載體在噬菌體的PⅧ表達，篩選後、將抗體基因片段PCR擴增轉至PⅢ上表達，可獲得高親和力的抗體片段。
抗體基因文庫有兩個優點，一是從不適合進行人工免疫的物種獲得單克隆抗體，如人源單克隆抗體；二是可快速方便獲得單克隆抗體。 將鼠源抗體的V區基因與人源抗體C區基因重組，獲得的嵌合抗體（chimericalantibody），可保留鼠抗體對抗原的高親和性，又減弱鼠源抗體對人的免疫原性，提高治療性抗體的效果。
重組的嵌合抗體基因轉化骨髓瘤細胞或中國地鼠卵細胞（CH0），可在其中表達。為了進一步地消除鼠抗體V區框架區（FW）的異源性，可實行CDR移植（CDR grafting），以獲得與鼠FW類似的人FW結構的嵌合抗體。
噬菌體表達的抗體僅含V區（scFv）或Fab片段，缺乏Fc區，使抗體的穩定性下降，半衰期縮短，與Fc受體結合功能也消失。因此在抗體功能片段的末端連接A蛋白、酶、細胞因子、CD4和毒素等分子，既可增加抗體片段的穩定性，又可發揮某些生物學活性功能。
用抗體基因工程方法獲得的抗體與效應分子交聯物比用化學交聯法具有優點：可以大量生產，不會因修飾作用影響抗體及效應分子的活性，效應分子還可根據需要進行改造。
此外在抗體片段的末端連接一段特異的雙親性螺旋（amphiphilic helixes）結構，如亮氨酸拉鏈結構（leucine zipper），可使單價的scFv或Fab片段在體內或體外形成穩定的雙分子聚合體，從而提高抗體片段的親和力。此法也可用於制備雙特異性抗體。 噬菌體表達的抗體片段常常是在原核細胞（E.coli）中完成。原核系統表達抗體片段產量
高，成本低，快速易於操作。但抗體片段在原核表達系統中不能進行CH2糖基化，從而影響抗體的活性。因此重組抗體基因片段可轉移至適合的骨髓瘤細胞系或哺乳動物細胞系（如CHO），甚至於植物細胞中表達，可以得到與淋巴細胞表達相同的抗體分子。免疫球蛋白IgA的重鏈和輕鏈及分泌片基因可以分別轉化不同的植株，將表達這些蛋白的植株進行有性雜交，在雜交後代中可以裝配成完整的IgA雙分子。以植物作為生物反應器進行抗體的表達已有許多成功的研究報道，與動物細胞相比更為經濟，具有廣泛的應用前景。 抗體酶是抗原決定簇處於轉換態結構的抗體。因為轉換態分子極不穩定無法制備抗體，所以催化性抗體的獲得主要是通過設計穩定的轉換態的類似物作為半抗原，與載體蛋白交聯後，免疫動物，獲得針對半抗原的抗體，從中篩選具有催化活性的抗體。篩選催化性單克隆抗體所用的ELISA與篩選一般抗體的方法不完全一樣，應根據催化反應的特點而進行適當的修改。經典的方法是先篩選出與底物或半抗原結合的抗體，然後從中再篩選出有催化活力的抗體，這種方法費時費力。利用催化性抗體對底物的催化活性，對底物進行適當修飾，使催化反應的產物可直接表現抗體的催化活性，這樣可以簡化檢測步驟。
轉換態類似物半抗原的設計，必須了解催化反應的轉換態模型的結構特點。催化抗體的抗原結合位點上與轉換態互補的某些催化基團的形成，能穩定轉換態分子。此外有人把單克隆抗體分子用化學修飾方法引入一些活性基團，提高催化性抗體的催化與親和效率。應用噬菌體抗體文庫也可以篩選催化性抗體，可省去制備轉換態類似物的復雜過程，直接用底物從文庫中篩選有催化活性的抗體片段。如用半抗原免疫後制備的文庫或文庫經過多次混雜重組，則可以得到更高的親和力的催化性抗體。抗獨特型抗體也用於催化性抗體的制備，用酶作為抗原免疫小鼠獲得能夠封閉酶活性位點的單克隆抗體，將這個抗體用蛋白酶除去Fc片段，用Fab免疫其他品系的小鼠或家兔，得到的抗體具有相應的酶催化活性。
從理論上看，B細胞具有全套免疫球蛋白的多樣性的胚系基因，當然也包括有催化作用的自身抗體在內。然而1989年Paul W.首次報道了人體的一種能催化蛋白質水解的免疫球蛋白。它是—種自身抗體，能水解血管活性腸肽（vasoactive intenstinal peptide，VIP）的Glnl6—Met17鍵。用VIP作為抗原能得到有催化作用的單克隆抗體，也能催化Glnl6—Met17鍵。大約有17%的人有這種自身抗體酶，但患有氣喘的病人中該抗體與VIP的親和力比健康人高50倍。由於VIP是一種氣管鬆弛劑，因此有人認為這種VIP自身抗體的長期作用可能與氣喘的過敏應答有一定關系。由此推測除了人工設計催化抗體以及發現的自身催化抗體外，用篩選單抗的方法，也有可能找到所需要的催化抗體。

『捌』 放射免疫法的反應原理

放射免疫法是利用同位素標記的與未標記的抗原，同抗體發生競爭性抑制反應的方法，研究機體對抗原物質反應的發生、發展和轉化規律。美國女免疫學家雅洛，因創立了放射免疫法而榮獲1977年諾貝爾生理學及醫學獎。
先把名字拆開來看一看，放射--免疫--測定法，這里頭有兩個葫蘆，第一是放射，也就是有放射性的東西，第二是免疫，有抗原抗體關系的事情。
先講免疫這個葫蘆。大家都打過預防針，打針的目的多半是使身體可以產生一種抗體。至於如何預防離題太遠，略去不談。多數蛋白質的異物叫做抗原，都能使動物產生抗體，而這種抗體十分特化，就是說一種抗原多半隻能引起一種抗體，而且多半隻能與一種抗體結合。比較容易了解的說法是，一種抗體只「認得」一種抗原，的實驗證明抗體也「認得」帶有放射性的抗原，這就是另外一個葫蘆：有放射性的抗原。
由上面的敘述，可知放射免疫測定法的方法至少有三件東西；第一、抗體，第二、有放射性的抗原，第三、無放射性的抗原。當這三樣東西放在一起，在某一種特定的環境下，抗體便開始與抗原始合，根據質量定律，這種作用會達到平衡。平衡的時候，抗體上結合的有放射性的抗原與沒有放射性的抗原的量成反比。換句話說，在一定的體積中，一定量的抗體和一定量的有放射性的抗原，加入無放射性的抗原愈多，結在抗體上的有放射性的抗原愈少。這樣，若是能夠把結合有抗原的抗體和無結合的抗原分開，然後以測定放射性的方法，測這些抗體的放射性，就可以推算出有多少不具放射性的抗原了。
放射免疫測定法將放射性的靈敏度與免疫的特異度融合於一爐，既簡便准確又靈敏可靠；剛開始時是為勝太荷爾蒙設計的定量法，已推延到一些葯物及環境中一些毒素的微量定量，真是功德無量。

『玖』 免疫組化中，一抗、二抗的制備方法原理

ELISA是酶聯接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術之後發展起來的一種免疫酶技術。此項技術自70年代初問世以來，發展十分迅速，目前已被廣泛用於生物學和醫學科學的許多領域。

(一) 原理

ELISA是以免疫學反應為基礎，將抗原、牽9體的特異性反應與酶對底物的高效催化作用相結合起來的一種敏感性很高的試驗技術。由於抗原、抗體的反應在一種固相載體——聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育後，可通過洗滌除去多餘的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。即:用於檢測抗體的間接法(圖a)、用於檢測抗原的雙抗體夾心法(圖b)以及用於檢測小分子抗原或半抗原的抗原競爭法等等。比較常用的是ELISA雙抗體夾心法及ELISA間接法。

(二) 操作步驟

方法一 用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鍾。(簡稱洗滌，下同)。

2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。

3. 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鍾。

5. 終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以「+」、「-」號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，於450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二 用於檢測未知抗體的間接法：

用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，
每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

↓

加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔
中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)

↓

於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，
37℃孵育30-60分鍾，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。

↓

其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

(三) 試劑器材

1. 試劑

(1) 包被緩沖液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):

Na�CO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

(2) 洗滌緩沖液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O 2.9克

NaCl 8.0克

KCl 0.2克

Tween-20 0.05％ 0.5ml

加蒸餾水至1000ml

(3) 稀釋液：

牛血清白蛋白(BSA) 0.1克

加洗滌緩沖液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10％使用。

(4) 終止液(2M H2SO4）：

蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。

(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):

0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml

0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml

加蒸餾水50ml。

(6) TMB(四甲基聯苯胺)使用液:

TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml

底物緩沖液(PH5.5) 10ml

0.75％H2O2 32μl

(7) ABTS使用液:

ABTS 0.5mg

底物緩沖液(PH5.5) 1ml

3％H2O2 2μl

(8) 抗原、抗體和酶標記抗體。

(9) 正常人血清和陽性對照血清。

2. 器材:

(1) 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

(2) 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

(3) 4℃冰箱，37℃孵育箱。

(四) 注意事項

1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的准確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

(1) 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

（2) 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多採用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。

(3) 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然後再固定其它條件或採取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里准確地滴定其工作濃度。

(4) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鍾為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。