液相色譜分析方法

Ⅰ 高效液相色譜法研究分析方法學有哪些

方法驗證有很多了,論述如下,來源CDE黃曉龍部長的文章
在進行質量研究的過程中,一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制.為規范對各種分析方法的驗證要求,我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則.該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述.但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求.另一方面,大多數葯品研發單位在進行質量研究時,已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性,大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證,但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准,而難以判斷該分析方法是否符合要求.本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求,提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准,供國內的葯品研發單位在進行研究時參考.
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映.驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份,分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率.
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間,9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%.
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示.具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液,分別測定其主峰的面積,計算相應的含量.以含量為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）,進行線性回歸分析.
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998,Y軸截距應在100％響應值的2％以內,響應因子的相對標准差應不大於2.0%.
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液,由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試,所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%.
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液,分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試,所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%.
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾,主成分與各有關物質應能完全分離,分離度不得小於2.0.以二極體陣列檢測器進行純度分析時,主峰的純度因子應大於980.
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3.
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10.另外,配製6份最低定量限濃度的溶液,所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%.
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時,儀器色譜行為的變化,每個條件下各測試兩次.可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%.
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析,主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%,主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離,主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定.

Ⅱ 如何分析液相色譜

液相色譜法的分離機理是基於混合物中各組分對兩相親和力的差別。根據固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質的鍵合相色譜。根據固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來，在液相柱色譜系統中加上高壓液流系統，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果，因此出現了高效（又稱高壓）液相色譜法。

Ⅲ 液相色譜法的分析對象

液相色譜分析是很廣泛的 我之前就用過在化工方面，用於中間體的檢測。後來又用過液相檢測啤酒，葯品，食品等 應用很多

Ⅳ 液相色譜法的原理和分類

液相色譜法的分離機理是基於混合物中各組分對兩相親和力的差別。根據固定相的不同，液相色譜分為液固色譜、液液色譜和鍵合相色譜。應用最廣的是以硅膠為填料的液固色譜和以微硅膠為基質的鍵合相色譜。根據固定相的形式，液相色譜法可以分為柱色譜法、紙色譜法及薄層色譜法。按吸附力可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜和凝膠滲透色譜。近年來，在液相柱色譜系統中加上高壓液流系統，使流動相在高壓下快速流動，以提高分離效果，因此出現了高效（又稱高壓）液相色譜法。 採用柱色譜技術的一種高效液相色譜法，樣品展開方式採用洗脫法。根據不同的分離方式，離子色譜可以分為高效離子色譜 、離子排斥色譜和流動相離子色譜3類。高效離子色譜法使用低容量的離子交換樹脂，分離機理主要是離子交換。離子排斥色譜法用高容量的樹脂，分離機理主要是利用離子排斥原理。流動相離子色譜用不含離子交換基團的多孔樹脂，分離機理主要是基於吸附和離子對的形成。
離子色譜儀由淋洗液貯存器 、泵 、進樣閥 、分離柱 、抑制柱、電導檢導器和數據處理單元等組成。離子色譜儀最重要的部件是分離柱，裝有離子交換樹脂。抑制柱是抑制型離子色譜儀的關鍵部件，其作用是將淋洗液轉變成低電導部分，以降低來自淋洗液的背景電導，同時將樣品離子轉變成其相應的酸或鹼，以增加其電導。分離陰離子，抑制柱填充強酸性陽離子交換樹脂；分離陽離子，抑制柱填充強鹼性陰離子交換樹脂。檢測器分通用型檢測器與專用型檢測器。前者如電導檢測器，對檢測池中所有離子都有響應；後者如紫外-可見分光光度計，對離子具有選擇性響應。 離子對色譜法是將一種（或數種）與樣品離子電荷（A+）相反的離子（B-，稱為對離子或反離子，Counterion）加入到色譜系統的流動相（或固定相）中，使其與樣品離子結合生成弱極性的離子對（呈中性締合物）。此離子對不易在水中離解而迅速進入有機相中，從而控制溶質離子的保留行為。

Ⅳ 高效液相色譜的原理及分析方法

原理主要有這幾種：
液—液分配色譜法
(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化學鍵合相色譜(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。達到平衡時，服從於高效液相色譜計算公式： 高效液相色譜計算公式
式中，cs—溶質在固定相中濃度；cm--溶質在流動相中的濃度； Vs—固定相的體積；Vm—流動相的體積。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決於K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。 a. 正相液 — 液分配色譜法(Normal Phase liquid Chromatography): 流動相的極性小於固定液的極性。 b. 反相液 — 液分配色譜法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流動相的極性大於固定液的極性。 c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求完全不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見後），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
液—固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 (X) 和溶劑分子(S)對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：Xm nSa ====== Xa nSm 式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。 當吸附競爭反應達平衡時： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
離子交換色譜法
(Ion-exchange Chromatography) IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基於離子交換樹脂上可電離的離子與流 離子交換色譜柱
動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下： X-(溶劑中) (樹脂-R4N Cl-)=== (樹脂-R4N X-) Cl- (溶劑中) 當交換達平衡時： KX=[-R4N X-][ Cl-]/[-R4N Cl-][ X-] 分配系數為： DX=[-R4N X-]/[X-]= KX [-R4N Cl-]/[Cl-] [討論：DX與保留值的關系] 凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。
離子對色譜法
(Ion Pair Chromatography) 離子對色譜法是將一種 ( 或多種 ) 與溶質分子電荷相反的離子 ( 稱為對離子或反離子 ) 加到流動相或固定相中，使其與溶質離子結合形成疏水型離子對化合物，從而控制溶質離子的保留行為。其原 離子色譜儀流程示意
理可用下式表示：X 水相 Y-水相 === X Y-有機相 式中：X 水相--流動相中待分離的有機離子（也可是陽離子）；Y-水相--流動相中帶相反電荷的離子對（如氫氧化四丁基銨、氫氧化十六烷基三甲銨等）；X Y---形成的離子對化合物。 當達平衡時： KXY = [X Y-]有機相/[ X ]水相[Y-]水相 根據定義，分配系數為： DX= [X Y-]有機相/[ X ]水相= KXY [Y-]水相 [討論：DX與保留值的關系] 離子對色譜法(特別是反相)發解決了以往難以分離的混合物的分離問題，諸如酸、鹼和離子、非離子混合物，特別是一些生化試樣如核酸、核苷、生物鹼以及葯物等分離。
離子色譜法
(Ion Chromatography) 用離子交換樹脂為固定相，電解質溶液為流動相。以電導檢測器為通用檢測器，為消除流動相中強電解質背景離子對電導檢測器的干擾，設置了抑制柱。試樣組分在分離柱和抑制柱上的反應原理與離子交換色譜法相同。 以陰離子交換樹脂（R-OH）作固定相，分離陰離子（如Br-）為例。當待測陰離子Br-隨流動相（NaOH）進入色譜柱時，發生如下交換反應（洗脫反應為交換反應的逆過程）： 擔體圖示
抑制柱上發生的反應： R-H Na OH- === R-Na H2O R-H Na Br- === R-Na H Br- 可見，通過抑制柱將洗脫液轉變成了電導值很小的水，消除了本底電導的影響；試樣陰離子Br-則被轉化成了相應的酸H Br-，可用電導法靈敏的檢測。 離子色譜法是溶液中陰離子分析的最佳方法。也可用於陽離子分析。
空間排阻色譜法
(Steric Exclusion Chromatography) 空間排阻色譜法以凝膠 (gel) 為固定相。它類似於分子篩的作用，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多，一般為數納米到數百納米。溶質在兩相之間不是靠其相互作用力的不同來進行分離，而是按分子大小進行分離。分離只與凝膠的孔徑分布和溶質的流動力學體積或分子大小有關。試樣進入色譜柱後，隨流動相在凝膠外部間隙以及孔穴旁流過。在試樣中一些太大的分子不能進入膠孔而受到排阻，因此就直接通過柱子，首先在色譜圖上出現，一些很小的分子可以進入所有膠孔並滲透到顆粒中，這些組分在柱上的保留值最大，在色譜圖上最後出現。
分析方法：
綜述
色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。後者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用於離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用於分子排阻色譜等。注樣量一般為數微升。除另有規定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其餘如色譜柱內徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進化學鍵合固定相反應
樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種並達到系統適用性試驗的要求。一般色譜圖約於20分鍾內記錄完畢。 2.系統適用性試驗 按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規定的對照品對儀器進行試驗和調整,應達到規定的要求；或規定分析狀態下色譜柱的最小理論板數、分離度和拖尾因子.
色譜柱的理論板數
在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規定的內標物質溶液，記錄色譜圖化學鍵合固定相應用
，量出供試品主成分或內標物質峰的保留時間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n＝5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計算色譜柱的理論板數，如果測得理論板數低於各品種項下規定的最小理論板數，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優劣等），使理論板數達到要求。
分離度
定量分析時，為便於准確測量，要求定量峰與其他峰或內標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2[t(R2)-t(R1)] ，R＝ -W1＋W2 式中 t(R2)為相鄰兩峰中後一峰的保留時間； t(R1)為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規定外，分離度應大於1.5。
拖尾因子
為保證測量精度，特別當採用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子(T)是否符合各品種項下的規定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W(0.05h) T＝-2d1 式中 W(0.05h)為0.05峰高處的峰寬； d1為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配製相當於80％、100％和120％的對照品溶液，加入規定量的內標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標准偏差應不大於2.0％。

Ⅵ 色譜分析有幾種定量方法

色譜分析 按物質在固定相與流動相間分配系數的差別而進行分離、分析的方法稱為色譜分析法。按流動相的分子聚集狀態分為液相色譜、氣相色譜及超臨界流體色譜法等。按分離原理可分為吸附、分配、空間排斥、離子交換、親合及手性色譜法等諸多類別。按操作原理可分為柱色譜法及平板色譜法等。液相色譜法按固定相的性能、流動相輸送壓力及是否具有在線檢測裝置等，分為經典與高效液相色譜法兩大類。

Ⅶ 高效液相色譜的原理及分析方法

分析色譜圖
手動進樣步驟 配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣後的對照（含量已標定），打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥，一般隨六通閥關閉電腦自動采樣，等主峰跑完整後記錄其峰面積，一般跑兩個對照，每個對照跑兩針，共四針。然後開始注稱好溶配脫氣後的樣，以對照主峰的保留時間來判斷樣品中目標峰的位置，外標法以峰面積計算供試品中某物質的含量。
X=[S樣*K /m樣（1-水分）]*對照品含量% *100
X:供試品的含量(%);
S樣:供試品的主峰面積;
K:單位面積對照品的質量
m樣(1-水分):稱取供試品折干後的質量(mg);
X對:對照品的含量(%);

（我是用儀器的，不是做廣告的，推薦你去海川論壇的化工分析版塊兒上去深入的學習，知識是積累起來的，不是一個問題一個答案這么簡單，海川里介紹還算比較豐富的，儀器信息網針對儀器本身有一些。）

儀器自身的原理請看參考資料URL （隨手找的）

Ⅷ 高效液相色譜分析法和氣相色譜法的區別

液相色譜儀與氣相色譜儀的區別：

1．分析對象的區別

GC：適於能氣化、熱穩定性好、且沸點較

低的樣品；但對高沸點、揮發性差、

熱穩定性差、離子型及高聚物的樣

品，尤其對大多數生化樣品不可檢測

佔有機物的20%

HPLC：適於溶解後能製成溶液的樣品(包括

有機介質溶液)，不受樣品揮發性和

熱穩定性的限制，對分子量大、難

氣化、熱穩定性差的生化樣品及高分

子和離子型樣品均可檢測

用途廣泛，佔有機物的80%

2．流動相差別的區別

GC：流動相為惰性，氣體組分與流動相無親合作用

力，只與固定相有相互作用。

HPLC：流動相為液體，流動相與組分間有親合作用

力，能提高柱的選擇性、改善分離度，對分離起

正向作用。且流動相種類較多，選擇餘地廣，改

變流動相極性和pH值也對分離起到調控作用，當

選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相

也可以增大分離選擇性。

3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓(液體粘度大，峰展寬小)

Ⅸ 高效液相色譜怎麼分析

計算含量的方法很多：
面積歸一化法，外標法，內標法
常用的：
面積歸一化法那很簡單，配製一個供試品，進樣分析。一個色譜峰代表一個物質，最大的那個通常是你的主峰，其餘的基本都是雜質。
雜質（%）=雜質的峰面積/主峰峰面積*100%（這個數值在你的分析報告中應該可以看到）

如果是外標法或者內標法，你需要有對照品。
計算方法比較復雜，我就說個外標法，不需要校正因子的計算方法：
將對照品和樣品配製相同濃度，分別進樣分析。
含量（%）=樣品峰面積/對照品峰面積*對照品濃度/樣品濃度*100%

計算時你就記住，樣品的峰面積和濃度呈正比。寫完公式上下單位一致就完了。