什麼方法可以檢測植物細胞自噬

A. 通過什麼技術可以驗證植物細胞具有全能性

植物細胞全能性原因是植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息,從而具備發育成完整植株的遺傳能力.在適宜條件下,任何一個細胞都可以發育成一個新個體.植物細胞全能性是植物組織培養的理論基礎.

B. 檢測自噬的方法有哪些

正常培養的細胞自噬活性很低，不適於觀察，因此，必須對自噬進行人工干預和調節，經報道的工具葯有：
（一）自噬誘導劑
1）bredeldin
a
/
thapsigargin
/
tunicamycin
：模擬內質網應激
2）carbamazepine/
l-690，330/
lithium
chloride（氯化鋰）：impase
抑制劑（即inositol
monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
3）earle's平衡鹽溶液：製造飢餓
4）n-acetyl-d-sphingosine（c2-ceramide）：class
i
pi3k
pathway抑制劑
5）rapamycin：mtor抑制劑
(最常用)
6）xestospongin
b/c：ip3r阻滯劑
（二）自噬抑制劑
1）3-methyladenine（3-ma）：（class
iii
pi3k）
hvps34
抑制劑
2）bafilomycin
a1：質子泵抑制劑
3）hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具葯外，一般還需結合遺傳學技術對自噬相關基因進行干預：包括反義rna干擾技術（knockdown）、突變株篩選、外源基因導入等。
（三）自噬檢測方法：
細胞經誘導或抑制後，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術有：
1）western
blot檢測lc3的切割
利用western
blot檢測lc3-ii/i比值的變化以評價自噬形成。自噬形成時，胞漿型lc3會酶解掉一小段多肽形成lc3-i，lc3-i跟pe結合轉變為（自噬體）膜型（即lc3-ii），因此，lc3-ii/i比值的大小可估計自噬水平的高低。
2）在熒光顯微鏡下採用gfp-lc3單熒光體系/mrfp-gfp-lc3雙熒光體系等融合蛋白來示蹤自噬形成：
gfp-lc3
單熒光自噬指示體系：
利用lc3在自噬形成過程中發生聚集的原理，開發出gfp-lc3指示技術：無自噬時，gfp-lc3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，gfp-lc3融合蛋白轉位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當於一個自噬體，可以通過計數來評價自噬活性的高低。但是綠色斑點增多並不一定代表自噬活性增強，也有可能是自噬溶酶體降解途徑受阻，可以通過western
blot
檢測游離的gfp、p62來驗證。
另一種方法是利用mrfp-gfp-lc3
。
mrfp-gfp-lc3
雙熒光自噬指示體系：
由於分子生物學的發展，現在已經誕生了mrfp-gfp-lc3
雙熒光自噬指示體系，用於標記及追蹤lc3以及自噬流的變化。其中gfp是酸敏感型gfp蛋白，而mrfp是穩定的熒光表達基團，不受外界影響。由於自噬小體進入第二階段後，與溶酶體進行融合，形成自噬溶酶體。自噬溶酶體由於溶酶體內部的酸性環境，可以導致ph下降，gfp淬滅，因此，gfp的減弱可指示自噬溶酶體形成的順利程度，gfp越少，則從自噬小體到自噬溶酶體階段流通得越順暢。反之，自噬小體和溶酶體融合被抑制，自噬溶酶體進程受阻。mrfp是一直穩定表達的，因而可以通過gfp與mrfp的亮點比例來評價自噬流進程。
mrfp-gfp-lc3
雙熒光自噬指示體系的出現，把自噬研究帶入了一個新的階段，自噬不再只是指標，而是一種機制，自噬流的順暢與否，對於細胞生理功能的穩定非常關鍵。
3）透射電鏡下觀察自噬體的形成：
自噬經歷了：吞噬泡(phagophore)--自噬小體(autophagosome)--自噬溶酶體(autolysosome)
透射電鏡下吞噬泡(phagophore)的特徵為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬小體(autophagosome)的特徵為：雙層或多層膜的液泡狀結構，內含胞漿成分，如線粒體、內質網、核糖體等。自噬溶酶體(autolysosome)的特徵為：單層膜，胞漿成分已降解。

C. 哪些因素可以誘導細胞自噬的發生

很多因素能誘導細胞發生自噬，如飢餓、生長因子缺乏、微生物感染、細胞器損傷、蛋白質折疊錯誤或聚集、DNA損傷、放療、化療等等。
細胞正常情況下很少發生自噬，除非有誘發因素的存在。這些誘發因素很多，也是研究的熱門。既有來自於細胞外的（如外界中的營養成分、缺血缺氧、生長因子的濃度等），也有細胞內的（代謝壓力、衰老或破損的細胞器、折疊錯誤或聚集的蛋白質等）。由於這些因素的經常性存在，因此，細胞保持了一種很低的、基礎的自噬活性以維持自穩。

D. 什麼方法可鑒別細胞死活

如果是植物細胞的話可以用質壁分離的方法。如果是動物細胞的話可以觀察它與外界是否有物質交換。

E. 什麼是細胞自噬

自噬是指細胞分解細胞質等自身構成成分的現象。自噬作用是細胞加速新陳代謝，或者在飢餓時獲得能量的一個重要手段。自噬在各種生命活動中發揮著重要作用，比如它可以加速細胞內的新陳代謝，或者在細胞處於飢餓狀態時從分解產物中獲得能量。自噬過程中，細胞需要一個特殊的「口袋」將有待分解的物質包圍並隔離起來，這個叫做自噬體的「口袋」由雙層脂質膜構成，但它的形成機制一直是個謎。日本科學家最近研究發現，原來是一種名為「Atg8」的蛋白質在自噬體形成過程中發揮著作用。研究人員發現，「Atg8」和一種磷脂分子結合後，就可以黏合脂質膜，進而形成自噬體。在使用酵母進行的實驗中，如果徹底破壞「Atg8」的功能，酵母細胞內就不能形成自噬體，而如果「Atg8」的部分功能受損，酵母細胞形成的自噬體明顯比正常細胞的自噬體小。

F. 植物細胞膜透性的測定方法有哪些

1、可以用電導法，電導法的原理就是細胞內外電位變化。
2、可以用植物細胞的質壁分離法，動物細胞可以用細胞失水發，以及主動運輸時營養物質運輸原理法。

植物細胞是植物生命活動的結構與功能的基本單位，由原生質體和細胞壁兩部分組成。原生質體是細胞壁內一切物質的總稱，主要由細胞質和細胞核組成，在細胞質或細胞核中還有若干不同的細胞器，此外還有細胞液和後含物等。植物細胞一般很小，高等植物中，其直徑通常為10-100μm。植物細胞的形態多種多樣，常見的有圓形、橢圓形、多面體、圓柱狀和紡錘狀。它們的基本結構是由原生質體和細胞壁組成。

G. 如何用簡單的方法判斷植物細胞的死活

將細胞放到染色劑中，觀察細胞是否被染色。如果被染色了，則說明該細胞已經死亡。因為細胞膜控制物質進出細胞，而像染色劑，對細胞有害，正常情況下進不入細胞中。呵呵，希望對你有所幫助！

H. 怎樣才能更清晰的看到植物細胞的液泡 用什麼方法

1.可觀察洋蔥表皮細胞
2.可用紅墨水染色
3.可讓視野變暗，用平面鏡、小光圈
4.可用相差顯微鏡

I. 除了改良苯酚品紅染色,還有哪些染色方法可以檢測植物細胞程序性死亡,其原理是

用台盼藍染色，死細胞會被染成藍色，而活細胞不著色，從而判斷細胞死活

死細胞的鑒別一般通過DNA結合染料排除，利用死細胞膜通透性增大、不破膜的情況下DNA染料即可進入的特點區分出死細胞，但所用染料濃度、時間遠遠低於細胞周期所用的濃度，並且不需要固定。

常用的核酸結合死活鑒別染料包括：

碘化丙啶（propidium iodide，PI）

4'，6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽（4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride，DAPI）

7-氨基 - 放線菌素D（7-amino-actinomycin D ，7-AAD）

DRAQ7

SYTOX

不過對於一些胞內抗原（細胞因子、轉錄因子），由於需要固定、破膜，所以上述染料中，除了一些胺類染料（如Live/Dead、Ghost等）和新型蒽醌類染料CyTRAK Orange外，其它染料不再適合此類標本的細胞死活鑒別。

這里，只向大家講解一下用PI、7-AAD、DAPI的染色方法，其它商品化死活染料請按照說明書操作：

1. 用0.5ml 1×PBS重懸細胞。

2. 加入PI或DAPI或7-AAD，終濃度分別為PI（5 µg/ml）、DAPI（500-1000 ng/ml）、7-AAD（2.5 µM）

3. 加入上述染料後，盡快上機，一般不要超過5分鍾（有些廠家說明書寫著10分鍾，可能與濃度有關，可按照說明書操作）。

PI檢測通道：使用488 nm激發，用610/20 BP收集

DAPI檢測通道：最好用355nm激發，用440/40BP收集；也可以用405nm激發，450/50BP收集

7-AAD檢測通道：用488nm激發，用670/14BP收集

下圖是用PI檢測細胞死活的結果圖：

1、細胞死亡：細胞死亡作為生物體的一種常見現象，在動物細胞中有三種方式：凋亡（apoptosis），自噬（autophagy）和壞死（necrosis）。前兩種類型屬於細胞程序性死亡（programmedcelldeath，PCD）。細胞壞死是細胞在遭受極度刺激時引起的細胞死亡，以細胞質膜的破裂為特徵，造成內含物的炎性泄露，是一種非正常死亡。細胞的PCD是細胞的一種「主動性」死亡行為，從形態上和功能上都與細胞壞死有很大的不同。

2、植物中細胞程序性死亡（PCD）：目前可依據液泡膜破裂後，是否在細胞質中發生快速降解將PCD分為兩個大類。第一類為自溶性（autolytic）PCD，與液泡中的水解酶的釋放有關，在液泡破裂後，導致細胞質的快速清除。第二種為非自溶PCD，（non-autolytic），即液泡膜破裂但是沒有出現快速的細胞質的清除。目前鑒定細胞的PCD類型，還是以細胞形態學為主。

3、動植物細胞凋亡標准：動物：凋亡：凋亡小體，或者在細胞表面的水泡，感染病原體後在其他細胞中的降解。自噬：自噬小體，自溶酶體，和小的促進細胞溶解的液泡數目的增加壞死：沒有上面的定義的標准。植物：自溶：植物膜破裂之後對細胞質的快速清理。非自溶：沒有對細胞質的快速清理。其他：染色質濃縮細胞核破裂自我標記信號自食信號細胞膨脹，細胞器膨脹，質膜破裂染色質濃縮。液泡體積增加（細胞質體積減小）需要Ca2+的內流，細胞質皺縮，細胞器膨脹，小泡增多但體積不增加。