hplc分析方法

Ⅰ 什麼叫HPLC分析法

這個是屬於色譜的入門基礎問題，建議你上「色譜世界」網站看看，這個網站在色譜方面很專業，高手非常多，估計對你會很有幫助的。

Ⅱ HPLC原理及基本操作是什麼

原理

高效液相色譜法儀根據各種各樣的相互作用力來分離混合物。這種相互作用力通常是分析物及分析管柱之間的一種非共價性質。

使用高效液相色譜時，液體待檢測物在不同的時間被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由於被測物中不同物質與固定相的相互作用不同，不同的物質順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，每個峰頂都代表一個另外化合物的種類，最後通過分析比對這些信號來判斷待測物所含有的物質。

以液體為流動相而設計的色譜分析儀器稱為液相色譜儀。採用高壓輸液泵，高效固定相和高壓靈敏檢測器等裝置的液相色譜儀成為高效液相色譜儀。高效液相色譜儀種類繁多，但不論何種類型的高效液相色譜儀，基本上都分為4個部分：高壓輸液裝置，進樣系統，分離系統和檢測系統。

操作

將要分離和分析的樣品混合物以不連續的小體積（通常為微升）引入滲透通過色譜柱的流動相流中。樣品的組分以不同的速度通過色譜柱，這是與吸附劑（也稱為固定相）的特定物理相互作用的函數。每個組分的速度取決於其化學性質，固定相（柱）的性質以及流動相的組成。

特定分析物洗脫（從色譜柱中出現）的時間稱為其保留時間。在特定條件下測得的保留時間是給定分析物的識別特徵。

可以使用許多不同類型的色譜柱，其中填充了粒徑，孔隙率和表面化學性質各異的吸附劑。使用較小的顆粒尺寸的包裝材料需要使用較高的操作壓力（「背壓」）的和通常改善的色譜解析度（連續的分析物從柱中出現的峰之間的分離度）。吸收劑顆粒本質上可以是疏水的或極性的。

常用的流動相包括水與各種有機溶劑的任何混溶性組合（最常見的是乙腈和甲醇）。一些HPLC技術使用無水流動相（請參見下面的正相色譜法）。

流動相的水性成分可能包含酸（例如甲酸，磷酸或三氟乙酸）或鹽以幫助分離樣品成分。在色譜分析過程中，流動相的組成可以保持恆定（「等度洗脫模式」）或變化（「梯度洗脫模式」）。等度洗脫通常在分離與固定相親和力非常不同的樣品成分時非常有效。

在梯度洗脫中，流動相的組成通常從低到高洗脫強度變化。流動相的洗脫強度由分析物的保留時間反映，高洗脫強度可產生快速洗脫（=較短的保留時間）。

反相色譜中的典型梯度曲線可能始於5％的乙腈（在水或水性緩沖液中），然後在5–25分鍾內線性增長至95％的乙腈。恆定流動相組成的周期可以是任何梯度曲線的一部分。例如，流動相的組成可以在5％的乙腈中保持1-3分鍾，然後線性變化直至95％的乙腈。

流動相的選定組成取決於各種樣品組分（「分析物」）和固定相之間的相互作用強度（例如，反相HPLC中的疏水相互作用）。根據它們對固定相和流動相的親和力，在色譜柱中進行分離過程中，分析物會在兩者之間分配。

此分配過程類似於液-液萃取過程中發生的分配過程，但該過程是連續的，而不是逐步進行的。在此示例中，使用水/乙腈梯度洗脫，一旦流動相在乙腈中的濃度更高（即，在洗脫強度更高的流動相中），則更多的疏水性組分將較晚洗脫（從色譜柱中洗脫）。

流動相組分，添加劑（例如鹽或酸）和梯度條件的選擇取決於色譜柱和樣品組分的性質。通常對樣品進行一系列的試驗，以便找到可以充分分離的HPLC方法。

用途

高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應用於化學和生化分析中，常用於醫葯品、化學、環保、生命科學、與食品工業的研究上。

高效液相色譜從原理上與經典的液相色譜沒有本質的差別，它的特點是採用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，可將液體混合物中的成分分離、成分定性及定量分析。適於分析高沸點不易揮發、分子量大、不同極性的有機化合物。例如：可檢測分析食品中的三聚氰胺的含量。

Ⅲ 如何分析高效液相色譜圖

分析色譜圖的方法：

手動進樣步驟 配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣後的對照（含量已標定）。

打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥，一般隨六通閥關閉電腦自動采樣，等主峰跑完整後記錄其峰面積，一般跑兩個對照，每個對照跑兩針，共四針。

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

Ⅳ 高效液相色譜法有哪些特點

1、高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

2、高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，小於1小時。

3、高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

4、高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

5、應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

6、柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

7、樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

高效液相色譜分析的流程

由泵將儲液瓶中的溶劑吸入色譜系統，然後輸出，經流量與壓力測量之後，導入進樣器。被測物由進樣器注入，並隨流動相通過色譜柱，在柱上進行分離後進入檢測器，檢測信號由數據處理設備採集與處理，並記錄色譜圖。廢液流入廢液瓶。

遇到復雜的混合物分離（極性范圍比較寬）還可用梯度控制器作梯度洗脫。這和氣相色譜的程序升溫類似，不同的是氣相色譜改變溫度，

而HPLC改變的是流動相極性，使樣品各組分在最佳條件下得以分離。

以上內容參考：網路-高效液相色譜、網路-高效液相色譜分析法

Ⅳ 個液相色譜分析方法的步驟有哪些

考察方法：當物質達到定量限濃度以上時：在線性范圍內：通過回收率試驗來確定：測得結果與實際量間是否一致：信號噪音=10：查看方法多次測定是否能夠得到相同的結果。考察方法，方法仍然能夠保持測定的准確，包括流動相、輔料空白含量方法學認證主要考察以下幾個性質:1時： 1專屬性：當被測物峰高，方法精密度（多次測定同一樣品查看結果。考察方法，測定同一樣品，測得峰面積與被測物質的量是否能夠呈線性關系：查看被測物質與被測結果間是否正確且唯一對應：重復性試驗：將處被測成分外的其他物質均做空白乾擾對照：方法對實驗環境的耐受程度，最好試劑和實驗室也更換，當前濃度即為定量限，計算回收率和結果偏差，中間精密度（不同人員不同時間不同儀器、色譜柱批次、溶劑空白、其他成分（多組分產品）空白.9999以上才能算呈線性、流速。即當實驗條件發生細微變化時，即配製多個供試品溶液），繪制標准曲線，該方法可以對該物質進行定量檢測，色譜條件變化（應包括柱溫。考察方法，測定時應採取對照品（或原料）加輔料等其他干擾，應包括儀器精密度（對照多次進樣查看偏差）。RSD應小於2% 3准確度：線性試驗、檢測波長等條件的輕微變化），應包含3個濃度至少9個樣品的測定結果。 6耐用性、如果方法有衍生還應包括衍生空白等等。 2精密度。如果想做更加可靠的實驗，查看結果偏差）。 5定量限，應取至少5個濃度點。考察方法，液相色譜法中一般認為R=0：溶液穩定性（相同溶液在幾小時內多次進樣查看結果），RSD小於2% 4線性。視方法而定一般回收率應在95~105%。考察方法：通過幾項實驗來確定，計算線性相關系數，應在定量限處考察精密度和回收率，該測定應包含全部試驗過程

Ⅵ 簡述HPLC-UV,HPLC-Ms,HPLC-DAD的各分析方法

都有高效液相系統,後面的連用不一樣：UV指紫外檢測器,可以是固定波長的,也可以是全波長（DAD）的.Ms指質譜.DAD指全波長掃描紫外檢測.

Ⅶ 高效液相色譜怎麼分析

計算含量的方法很多：
面積歸一化法，外標法，內標法
常用的：
面積歸一化法那很簡單，配製一個供試品，進樣分析。一個色譜峰代表一個物質，最大的那個通常是你的主峰，其餘的基本都是雜質。
雜質（%）=雜質的峰面積/主峰峰面積*100%（這個數值在你的分析報告中應該可以看到）

如果是外標法或者內標法，你需要有對照品。
計算方法比較復雜，我就說個外標法，不需要校正因子的計算方法：
將對照品和樣品配製相同濃度，分別進樣分析。
含量（%）=樣品峰面積/對照品峰面積*對照品濃度/樣品濃度*100%

計算時你就記住，樣品的峰面積和濃度呈正比。寫完公式上下單位一致就完了。

Ⅷ 阿那格雷hplc分析方法

【摘要】研究目的：為測出十二名健康志願者單次口服鹽酸阿那格雷膠囊和多次口服給葯後，不同時刻血漿樣品中阿那格雷的濃度。本次研究建立了一種靈敏度高、分析時間短、重現性好、樣品處理簡便，適於樣品高通量分析的LC-MS/MS（液相色譜-質譜法）定量方法。通過試驗數據對口服鹽酸阿那格雷膠囊後的體內葯動學進行分析，為阿那格雷後期臨床安全性、合理用葯提供了可靠的依據。研究方法：使用乙醚-二氯甲烷（2:1，v/v）作為提取試劑，對阿那格雷血漿樣品採用液-液萃取法進行前處理，柱溫調節到35C，流速選擇1.0mL/mi（n分流體積比1:1），吸清液層30μL進行LC-MS/MS檢測分析。阿那格雷與內標格列吡嗪經AscetnisC18柱（4.6×150mmI.D.，5μm粒徑），在流動相為甲醇-0.1%甲酸水（80:20，v/v）的色譜系統中予以分離之後，再通過高效液相質譜進行分析檢測。選用MRM模式，即多重反應監測技術，選擇ESI(電噴霧離子化源)作為離子源，正離子模式掃描阿那格雷和內標格列吡嗪，分別以m/z256.3m/z199.0和m/z446.1m/z321.0為定量分析的離子反應。為了確保建立的阿那格雷定量分析方法有效可靠，試驗對如下指標進行了全面的方法學確證：包括其特異性、線性范圍、最低定量下限、准確度、精密度、基質效應、提取回收率和穩定性等。對招募的十二名健康志願者，口服給予鹽酸阿那格雷膠囊各1mg以及多次口服1mg劑量後，為測出不同時刻採集的血漿中阿那格雷的濃度，使用已經建立好的HPLC-MS/MS定量方法來進行分析。為了了解阿那格雷在人體內的葯代動力學所具備的特點，我們使用DAS3.0和SPSS17.0軟體算出相應的葯代動力學參變數並用統計學方法闡明其葯代動力學參變數的特徵。研究結果：為了測出人體血漿中阿那格雷的濃度，此次實驗創建了快速靈敏、准確可靠、重現性極好且穩定的HPLC-MS/MS測定方法。結果表明：在待測物和內標格列吡嗪出峰時間處均沒有外源性和內源性物質影響的情況下，阿那格雷血漿樣品的定量線性范圍是0.1-100ng/mL，LLOQ是0.1ng/mL，本方法線性良好(r=0.9971)，且定量范圍較寬。日內精密度(日內RSD)<5.92，日間精密度(日間RSD)<10.4，准確度為3.11%-4.04%，以上值均<±15%。阿那格雷低、中、高三個濃度回收率分別是96.1±3.6%、99.5±1.2%、104±0.91%。內標格列吡嗪回收率也穩定，結果精密可重現。阿那

Ⅸ 高效液相色譜法研究分析方法學有哪些

方法驗證有很多了,論述如下,來源CDE黃曉龍部長的文章
在進行質量研究的過程中,一項重要的工作就是要對質量標准中所涉及到的分析方法進行方法學驗證,以保證所用的分析方法確實能夠用於在研葯品的質量控制.為規范對各種分析方法的驗證要求,我國已於2005年頒布了分析方法驗證的指導原則.該指導原則對需要驗證的分析方法及驗證的具體指標做了比較詳細的闡述.但是文中未涉及各具體指標在驗證時的可接受標准,國際上已頒布的指導原則中也未發現相關的要求.另一方面,大多數葯品研發單位在進行質量研究時,已逐步認識到分析方法驗證的必要性與重要性,大都也在按照指導原則的要求進行分析方法驗證,但驗證完後卻因沒有一個明確的可接受標准,而難以判斷該分析方法是否符合要求.本文結合國外一些大型葯品研發企業在此方面的要求,提出了在對含量測定方法進行驗證時的可接受標准,供國內的葯品研發單位在進行研究時參考.
1．准確度
該指標主要是通過回收率來反映.驗證時一般要求分別配製濃度為80％、100％和120％的供試品溶液各三份,分別測定其含量,將實測值與理論值比較,計算回收率.
可接受的標准為：各濃度下的平均回收率均應在98.0%-102.0%之間,9個回收率數據的相對標准差（RSD）應不大於2.0%.
2．線性
線性一般通過線性回歸方程的形式來表示.具體的驗證方法為：
在80％至120％的濃度范圍內配製6份濃度不同的供試液,分別測定其主峰的面積,計算相應的含量.以含量為橫坐標（X）,峰面積為縱坐標（Y）,進行線性回歸分析.
可接受的標准為：回歸線的相關系數（R）不得小於0.998,Y軸截距應在100％響應值的2％以內,響應因子的相對標准差應不大於2.0%.
3．精密度
1）重復性
配製6份相同濃度的供試品溶液,由一個分析人員在盡可能相同的條件下進行測試,所得6份供試液含量的相對標准差應不大於2.0%.
2）中間精密度
配製6份相同濃度的供試品溶液,分別由兩個分析人員使用不同的儀器與試劑進行測試,所得12個含量數據的相對標准差應不大於2.0%.
4．專屬性
可接受的標准為：空白對照應無干擾,主成分與各有關物質應能完全分離,分離度不得小於2.0.以二極體陣列檢測器進行純度分析時,主峰的純度因子應大於980.
5．檢測限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於3.
6．定量限
主峰與噪音峰信號的強度比應不得小於10.另外,配製6份最低定量限濃度的溶液,所測6份溶液主峰的保留時間的相對標准差應不大於2.0%.
7．耐用性
分別考察流動相比例變化±5％、流動相pH值變化±0.2、柱溫變化±5℃、流速相對值變化±20％時,儀器色譜行為的變化,每個條件下各測試兩次.可接受的標准為：主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離；各條件下的含量數據（n=6）的相對標准差應不大於2.0%.
8、系統適應性
配製6份相同濃度的供試品溶液進行分析,主峰峰面積的相對標准差應不大於2.0%,主峰保留時間的相對標准差應不大於1.0%.另外,主峰的拖尾因子不得大於2.0,主峰與雜質峰必須達到基線分離,主峰的理論塔板數應符合質量標準的規定.

Ⅹ 請問HPLC是做什麼的原理操作方法

HPLC是高效液相色譜，英文全稱是High Performance Liquid Chromatography。該方法在化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中被用來做重要的分離分析技術。

用途：高效液相色譜更適宜於分離、分析高沸點、熱穩定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用於核酸、肽類、內酯、稠環芳烴、高聚物、葯物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。

原理：高效液相色譜以液體為流動相，採用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析和分離。

操作方法：如下圖所示，溶劑貯器中的流動相被泵吸入，經梯度控制器按一定的梯度進行混合然後輸出，經測其壓力和流量，導入進樣閥（器）經保護柱、分離柱後到檢測器檢測，由數據處理設備處理數據或記錄儀記錄色譜圖，餾分收集器收集餾分，廢液瓶收集廢液。

(10)hplc分析方法擴展閱讀：

液相色譜法開始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動相，稱為經典液相色譜法，此方法柱效低、時間長（常有幾個小時）。高效液相色譜法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在經典液相色譜法的基礎上，於60年代後期引入了氣相色譜理論而迅速發展起來的。

HPLC根據固定相和流動相的成分分為正相色譜和反向色譜。

正相色譜法

採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。

反相色譜法

一般用非極性固定相（如C18、C8)；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。

參考資料：網路-高效液相色譜