可用什麼方法使酶蛋白沉澱

㈠ 沉澱蛋白質的幾種方法及應用實例

1.鹽析法——多用於各種蛋白質和酶的分離純化
在蛋白質溶液中加入大量的中性鹽以破壞蛋白質的膠體穩定性而使其析出,這種方法稱為鹽析.常用的中性鹽有硫酸銨、硫酸鈉、氯化鈉等.各種蛋白質鹽析時所需的鹽濃度及pH不同,故可用於對混和蛋白質組分的分離.例如用半飽和的硫酸銨來沉澱出血清中的球蛋白,飽和硫酸銨可以使血清中的白蛋白、球蛋白都沉澱出來,鹽析沉澱的蛋白質,經透析除鹽,仍保證蛋白質的活性.調節蛋白質溶液的pH至等電點後,再用鹽析法則蛋白質沉澱的效果更好.鹽析法分為兩類,第一類叫Ks分段鹽析法,在一定PH和溫度下通過改變離子強度實現,用於早期的粗提液；第二種叫b分段鹽析法,在一定離子強度下通過改變PH和溫度來實現,用於後期進一步分離純化和結晶.影響鹽析的因素包括：蛋白質濃度、離子強度和類型、PH值、溫度等.針對溫度這一條,需要強調：在低離子強度或純水中,蛋白質溶解度在一定范圍內隨溫度增加而增加.但在高濃度下,蛋白質、酶和多肽類物質的溶解度隨溫度上升而下降.在一般情況下,蛋白質對鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進行,只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4℃進行.
使用硫酸銨沉澱蛋白需要注意：硫酸銨中常含有少量的重金屬離子,對蛋白質巰基有敏感作用,使用前必須用H2S處理：將硫酸銨配成濃溶液,通入H2S飽和,放置過夜,用濾紙除去重金屬離子,濃縮結晶,100℃烘乾後使用.另外,高濃度的硫酸銨溶液一般呈酸性(PH=5.0左右),使用前也需要用氨水或硫酸調節至所需PH.
2.有機溶劑沉澱法——多用於生物小分子、多糖及核酸產品的分離純化；
有機溶劑的沉澱機理是降低水的介電常數,導致具有表面水層的生物大分子脫水,相互聚集,最後析出.該法優點在於：1)分辨能力比鹽析法高,即蛋白質或其它溶劑只在一個比較窄的有機溶劑濃度下沉澱；2)沉澱不用脫鹽,過濾較為容易；3)在生化制備中應用比鹽析法廣泛.但是,在常溫下,有機溶劑沉澱蛋白質往往引起變性.例如酒精消毒滅菌就是如此.因此,操作要求在低溫下進行.有機溶劑的選擇首先是能和水混溶,使用較多的有機溶劑是乙醇、甲醇、丙酮,還有二甲基甲醯胺、二甲基亞碸、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等.
3.等電點沉澱法——此法單獨應用較少,多與其它方法結合使用；
兩性電解質分子上的凈電荷為零時溶解度最低,不同的兩性電解質具有不同的等電點,以此為基礎可進行分離.如工業上生產胰島素時,在粗提液中先調PH8.0去除鹼性蛋白質,再調PH3.0去除酸性蛋白質.利用等電點除雜蛋白時必須了解制備物對酸鹼的穩定性,不然盲目使用十分危險.不少蛋白質與金屬離子結合後,等電點會發生偏移,故溶液中含有金屬離子時,必須注意調整PH值.等電點法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱方法聯合使用,以提高其沉澱能力.
很全面實用的答案,

㈡ 蛋白質沉澱法原理

原理：蛋白質通過鹽析的辦法沉澱的原理是降低蛋白質的溶解度，使蛋白質凝聚而從溶液中析出。

蛋白質分子聚集而從溶液中析出的現象，稱為蛋白質的沉澱。由於水化層和雙電層的存在，蛋白質溶液是一種穩定的膠體溶液。如果向蛋白質溶液中加入某種電解質，以破壞其顆粒表面的雙電層或調節溶液的pH，使其達到等電點，蛋白質顆粒因失去電荷變得不穩定而將沉澱析出。

蛋白沉澱法是毒物分析過程中對生物樣品進行前處理的一種常用方式。對於富 含蛋白質的檢材，在進行分離、提取時要將 大量干擾測定的蛋白質沉澱除去，使待測毒 物仍留存於溶液中。

操作時一般要先將檢材組織磨碎，然後再加入蛋白沉澱劑進行蛋白質沉澱，組織中的蛋白質與沉澱劑形成疏鬆的絮狀沉澱物，而毒物則留在溶液中。

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有機溶劑易使蛋白質或酶變性，常採用降低溫度的方法進行有效控制， 而且有機溶劑使用量大，溶劑的使用及回收；儲存都比較困難或 麻煩。 鹽析法：鹽析法簡單方便，可用於蛋白質抗原的粗提、丙種 球蛋白的提取、蛋白質的濃縮等。

鹽析法提純的抗原濃度不高，只用於抗原的初步純化。 金屬離子沉澱法純度高,太耗電，沉澱效果很好，容易使生物分 子變性，復合物難分解。

選澤性變性沉澱法：溶解度下降、粘度 增加、紫外線吸收增加、側鏈反應增強、對酶的作用敏感，易被 水解 （這就是為何蛋白類食品在被加熱至變性後人體對其中氨基 酸的吸收。能力增強） 等電點沉澱法無機酸會引起較大的蛋白質不可逆變性的危險等電點裝置復雜,也比較純。

蛋白質變性指在某些物理和化學因素如熱、有機溶劑、重金屬離子、生物鹼試劑等作用下，蛋白質特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。

㈢ 酶的分離和純化方法是什麼

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質，然後再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質，然後製成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞「目的酶」的限度內，使用各種手段;酶與底物和抑制劑的結合常使其理化性質和穩定性發生改變，這種特性已被用於酶的分離純化。

由於酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質的復雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用於一切酶的純化。為了使一種酶達到高度純化，往往需要多種方法協同作用，通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

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酶的本性是蛋白質，凡可用於蛋白質分離純化的方法都同樣適用於酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫(4℃)、溫和pH(4<pH>10)等條件下進行。

與蛋白質類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養物。得到純培養的過程稱是分離純化。

㈣ 常用蛋白質沉澱方法有哪些有哪些應用實例

沉澱可以是由蛋白質變性從而產生沉澱，也可以是由於鹽析。
蛋白質變性是指光照，熱，有機溶濟以及一些變性劑（如重金屬鹽）的作用時蛋白質的空間結構被破壞，使得蛋白質喪失活性，該過程不可逆。
鹽析是指向蛋白質的溶液中加入輕金屬鹽，使得蛋白質沉澱析出，這是由於加入鹽降低了蛋白質得溶解度而析出，該過程可逆，加水蛋白質又會溶解。
（一）材料的預處理及細胞破碎

分離提純某昌緩鄭一種蛋白質時，首先要把蛋白質從組織或細胞中釋放出來並保持原來的天然狀態，不喪失活性。所以要採用適當的方法將組織和細胞破碎。常用的破碎組織細胞的方法有：

1. 機械破碎法

這種方法是利用機械力的剪切作用，使細胞破碎。常用設備有，高速組織搗碎機、勻漿器、研缽等。

2. 滲透破碎法

這種方法是在低滲條件使細胞溶脹而破碎。

3. 反復凍融法

生物組織經凍結後，細胞內液結冰膨脹而使細胞脹破。這種方法簡單方便，但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質不宜採用此法。

4. 超聲波法

使用超聲波震盪器使細胞膜上所受張力不均而使細胞破碎。

5. 酶法

如用溶菌酶破壞微生物細胞等。

(二) 蛋白質的抽提

通常選擇適當的緩沖液溶劑把蛋白質提取耐頌出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強度、組成成分等條件的選擇應根據欲制備的蛋白質的性質而定。如膜蛋白的抽提，抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑（十二烷基磺酸鈉、tritonX-100等），使膜結構破壞，利於蛋白質與膜分離。在抽提過程中，應注意溫度，避免劇烈攪拌等，以防止蛋白質的變性。

（三）蛋白質粗製品的獲得

選用適當的方法將所要的蛋白質與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據蛋白質溶解度的差異進行的分離。常用的有下列幾種方法：

1. 等電點沉澱法

不同蛋白質的等電點不同，可用等電點沉澱法使它們相互分離。

2. 鹽析法

不同蛋白質鹽析所需要的鹽飽和度不同，所以可通過調節鹽濃度將目的蛋白沉澱析出。被鹽析沉澱下來的蛋白質仍保持其天然性質，並能再度溶解哪皮而不變性。

3. 有機溶劑沉澱法

中性有機溶劑如乙醇、丙酮，它們的介電常數比水低。能使大多數球狀蛋白質在水溶液中的溶解度降低，進而從溶液中沉澱出來，因此可用來沉澱蛋白質。此外，有機溶劑會破壞蛋白質表面的水化層，促使蛋白質分子變得不穩定而析出。由於有機溶劑會使蛋白質變性，使用該法時，要注意在低溫下操作，選擇合適的有機溶劑濃度。

（四）樣品的進一步分離純化

用等電點沉澱法、鹽析法所得到的蛋白質一般含有其他蛋白質雜質，須進一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有：凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。有時還需要這幾種方法聯合使用才能得到較高純度的蛋白質樣品。