分子印跡酶免疫分析方法原理

1. 簡述農葯殘留檢測前處理步驟及檢測方法

檢測前處理程序

經典的農葯殘留分析步驟通常是:水溶性溶劑提取- 非水溶性溶劑再分配- 固相吸附柱凈化- 氣相或液相色譜檢測。其中提取和凈化是前處理部分,樣品前處理不僅要求盡可能完全提取其中的待測組分,還要盡可能除去與目標物同時存在的雜質,避免對色譜柱和檢測器等的污染,減少對檢測結果的干擾,提高檢測的靈敏度和准確性。

農葯殘留檢測技術

農葯殘留量檢測是微量或痕量分析,必須採用高靈敏度的檢測技術才能實現。自20世紀50年代,各國科學家就開始研究農葯殘留的檢測方法。常規檢測的分析方法有光譜法、酶抑製法和色譜法。

1、光譜法

光譜法是根據有機磷農葯中的某些官能團或水解、還原產物與特殊的顯色劑在特定的環境下發生氧化、磺酸化、絡合等化學反應,產生特定波長的顏色反應來進行定性或定量測定。檢出限在微克級。它可直接檢測固體、液體及氣體樣品,對樣品前處理要求低、環境污染小,分析速度快。

但是,光譜法只能檢測一種或具有相同基團的一類有機磷農葯,靈敏度不高,一般只能作為定性方法。

2、酶抑製法

酶抑製法是根據有機磷和氨基甲酸酯類農葯能抑制昆蟲中樞和周圍神經系統中乙醯膽鹼的活性,造成神經傳導介質乙醯膽鹼的積累,影響正常神經傳導,使昆蟲中毒致死這一昆蟲毒理學原理進行檢測的。

3、色譜法

色譜法是農葯殘留分析的常用方法之一,它根據分析物質在固定相和流動相之間的分配系數的不同達到分離目的,並將分析物質的濃度轉換成易被測量的電信號(電壓、電流等) ,然後送到記錄儀記錄下來的方法。主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。

4、快速檢測技術

常見的有化學速測法、免疫分析法、酶抑製法和活體檢測法等。

化學速測法，主要根據氧化還原反應，水解產物與檢測液作用變色，用於有機磷農葯的快速檢測，但是靈敏度低，使用局限性，且易受還原性物質干擾。

免疫分析法，主要有放射免疫分析和酶免疫分析，最常用的是酶聯免疫分析（ELISA），基於抗原和抗體的特異性識別和結合反應，對於小分子量農葯需要制備人工抗原，才能進行免疫分析。

酶抑製法，是研究最成熟、應用最廣泛的快速農殘檢測技術，主要根據有機磷和氨基甲酸酯類農葯對乙醯膽鹼酶的特異性抑制反應。

活體檢測法，主要利用活體生物對農葯殘留的敏感反應，例如給家蠅餵食樣品，觀察死亡率來判定農殘量。該方法操作簡單，但定性粗糙、准確度低，對農葯的適用范圍窄。

2. 農葯殘留分析技術進展概況

農葯殘留分析技術進展概述

摘要:綜述了目前農葯殘留分析的前處理技術和檢測的幾種方法。樣品前處理中,固相萃取、超臨
界流體萃取、基質固相分散萃取得到了迅速發展和廣泛應用。超臨界流體色譜、液相色譜—質譜聯
用技術、免疫分析技術、直接光譜技術和生物感測器等檢測方法具有廣泛的應用前景。
關鍵詞:農葯殘留;分析;前處理
中圖分類號: S 481.8 文獻標識碼: A 文章編號: 1002-2767(2005)03-0027-03
Development Outline in Analytical Technique of Pesticide Resies
FENG Shi-de, WANG Bo, QU Hong-jie
(Heilongjiang August First Lond Reclamation University Daqing 163319)
Abstract:This article described the methods of sample pre-treatment and determination of pesti-
cide resies at present. Solid-phase extraction, supercritical fluid extraction, and matrix solid
-phase dispersion extraction were developed quickly and applied widely in sample pre-treat-
ment. The potentiality in the use of supercritical fluid chromatography, liquid chromatography-
mass spectrum , immunoassay, direct spectros technique and biosensor was great.
Key words:Pesticide resie; analysis; pre-treatment

農葯的使用無疑大大提高了農作物的產量,但由此而產生的環境污染問題,已引起人們的高度重視。世界上許多國家都規定了食品、糧食中各種農葯殘留的限定量。加強對農葯殘留的監測和環境毒理研究,對於合理開發和正確使用農葯,保護生態環境,保障人類健康,避免和減少不必要的農業損失等,具有重要的理論和實踐意義[1]。近年來隨著超高效農葯的開發應用和待檢樣品的增加,對農葯殘留分析技術的靈敏度、特異性和快速性提出了更苛刻的要求。因此出現了一些新型的、先進的農葯殘留分析技術。本文綜述了農葯殘留分析和檢測的一些方法。
1 樣品前處理技術
現代農葯殘留分析方法通常包括樣品前處理和測定兩部分,農葯殘留測定之前要有適合於各種樣品的理化性質的萃取、凈化、濃縮等預處理步驟,這些預處理過程往往在分析中起著主要作用。目前常用的提取、凈化方法有漂洗、勻漿、索氏提取、超聲波提取、液-液分配、柱層析、薄層層析等方法。90年代以來,一些新的樣品前處理技術不斷被引入農葯殘留分析中,這些新技術的共同特點是:節省時間,減輕勞動強度,節省溶劑,減少樣品用量,提高提取或凈化效率和提高自動化水平。目前,已報道或已取得廣泛應用的新技術主要有:固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)、超臨界流體提取(SFE)、分子印跡合成受體技術(MISR)等。
1.1 固相萃取技術(SPE)
固相萃取法是一種基於液相色譜分離機制的樣品制備方法,已廣泛應用於農葯殘留檢測工作。它根據液相分離、解析、濃縮等原理,使樣品溶液混合物通過柱子後,樣品中某一組份保留在柱中,通過再選擇合適的溶劑把保留在柱中的組分洗脫下來,從而達到分離、凈化的目的。SPE克服了液-液萃取技術(LLE)及一般柱層析的缺點,具有高效、簡便、快速、安全、重復性好、便於前處理自動化等特點。根據柱中填料大體可分為吸附型(如硅膠、大孔吸附樹脂等)、分配型(C8、C18、苯基柱等)和離子交換型。據待測農葯性質、樣品種類等選用合適的微型柱和淋洗劑及其它優化條件後,可使萃取、富集、凈化一步完成[2]。
1.2 超臨界流體提取(SFE)
超臨界流體提取(SFE)是近幾年發展起來的一種特殊分離技術[3]。SFE主要是以超臨界流體代替各種溶劑來萃取樣品中待測組分的萃取方法。目前最常用的超臨界流體為CO2,它兼有氣體的滲透能力和液態的分配作用,流出液中的CO2在常壓下揮發,待測物用溶劑溶解後進行分析。超臨界CO2無毒,分子極性比較小,可用於提取非極性或弱極性農葯殘留。也可以加入適量極性調節劑,如甲醇等來調節其極性,據此可最大限度地提取不同極性的農葯殘留而最低限度地減少雜質的提取。其特點是避免了使用大量的有機溶劑、提高萃取的選擇性、減少了分析時間、實現操作自動化。SFE技術是當前發展最快的分析技術之一。
1.3 基質固相分散萃取技術(MSPDE)
基質固相分散萃取是1989年美國Louisiana州立大學的Barke教授首次提出並給予理論解釋的一種嶄新的萃取技術。其基本操作是將試樣直接與適量反相填料(C1 4或C1 8)研磨、混勻得到半干狀態的混合物並將其作為填料裝柱,然後用不同的溶劑淋洗柱子,將各種待測物洗脫下來。MSPDE濃縮了傳統的樣品前處理中所需的樣品均化、組織細胞裂解、提取、凈化等過程,是簡單高效的提取凈化方法[3],適用於各種分子結構和極性農葯殘留的提取凈化,在蔬菜、水果的殘留農葯檢測中得到了廣泛應用。
1.4 分子印跡合成受體技術(MISR)
分子印跡合成受體技術(MISR)原理是:首先使擬被印跡的分子或聚合物單體鍵合,然後將聚合物單體交聯體再將印跡分子從聚合物中提取出來,聚合物內部就留下了被印跡分子的印跡。由於需要合成被印跡分子衍生物,使該項技術受到限制,因為有些化合物的分子無法進行衍生化。分子印跡技術可以用於葯物、激素、蛋白質、農葯、氨基酸、多肽、碳水化合物、輔酶、核酸鹼基、甾醇、塗料、金屬離子等各種化合物的分離工作。
2 檢測方法
2.1 氣相色譜法(GC)
氣相色譜法是一種經典的分析方法。利用試樣中各組份在氣相和固定液液相間的分配系數不同,當汽化後的試樣被載氣帶入色譜柱中運行時,組份就在其中的兩相間進行反復多次分配,經過一定的柱長後,便彼此分離,按順序離開色譜柱進入檢測器,產生的離子流訊號經放大後,在記錄器上描繪出各組份的色譜峰。由於其具有操作簡便、分析速度快、分離效能高、靈敏度高以及應用范圍廣等特點,目前農葯殘留物檢測70%採用氣相色譜法來進行。使用氣相色譜法,多種農葯可一次進樣,得到完全的分離、定性和定量,再配置高性能的檢測器,使分析速度更快,結果更可靠。目前氣相色譜法多採用填充毛細管。
2.2 高效液相色譜法(HPLC)
高效液相色譜法也是一種傳統的檢測方法。它可以分離檢測極性強、分子量大的離子型農葯,尤其適用於對不易氣化或受熱易分解農葯的檢測。近年來,採用高效色譜柱、高壓泵和高靈敏度的檢測器、柱前或柱後衍生化技術以及計算機聯用等,大大提高了液相色譜的檢測效率、靈敏度、速度和操作自動化程度,現已成為農葯殘留檢測不可缺少的重要方法。
2.3 超臨界流體色譜(SFC)技術
超臨界流體色譜(SFC)是以超臨界流體作為色譜流動相的分離檢測技術[1]。可以使用各種類型的較長色譜柱,可以在較低溫度下分析分子量較大、對熱不穩定的化合物和極性較強的化合物,它綜合利用了氣象色譜和高效液相色譜的優點,克服了各自的缺點,可以與大部分GC和HPLC的檢測器相連接,如FID、FPD、NPD以及MS等連用[4]。這樣就極大地拓寬了其應用范圍,許多在GC或HPLC上需經過衍生化才能分析的農葯,都可以用SFC直接測定。
2.4 直接光譜分析技術
近紅外衰減全反射光譜(NearIS-ATR)和表面增強拉曼光譜(SERS)使光譜分析的靈敏度提高102~107倍。這些快速直接的光譜技術,只需要極少量的樣品,具有很大的應用潛力。一系列激光光譜技術,如激光拉曼光譜等使光譜分析的靈敏度幾乎達到極限-一個分子或原子的水平。這將為開發高靈敏度的檢測器提供可能的技術基礎。目前,這些靈敏度極高的光譜技術還需要進一步研究開發才能進入廣泛應用階段。
2.5 毛細管電泳(CE)
毛細管電泳技術是在電泳技術的基礎上發展的一種分離技術。其工作原理是使毛細管內的不同帶電粒子(離子、分子或衍生物)在高壓場作用下以不同的速度在背景緩沖液中定向遷移,從而進行分離。根據樣品組分的背景緩沖液中所受作用的不同,CE又被分為毛細管區帶電泳(CZE)、毛細管凝膠電泳(CGE)、等電聚焦(IEF)、膠束電動色譜(MEKC)、等速電泳(ITP)等幾大類。自80年代Jorgenson把E應用於分析化學以來,這一技術已發展成為分離科學中最活躍的領域之一。它具有靈敏度高、耗資少、樣品消耗量很小(每次進樣只是納升級)、分離柱效高、使用方便等優點,非常適用於那些難以用傳統的液相色譜法分離的離子化樣品的分離與分析,其分離效率可達數百萬理論塔板數。目前,毛細管電泳尚缺乏靈敏度很高的檢測器。因此,只有研究開發靈敏度更高的檢測系統,該技術的優勢才能充分發揮出來。
2.6 液相色譜-質譜聯用技術(LC/MS)
液—質聯用技術(LC-MS)是將液相色譜與質譜串聯成為一個整機使用的檢測技術。用來分析低濃度、難揮發、熱不穩定和強極性農葯。LC/MS先後產生四種介面技術:熱噴霧(TSP)、粒子束(PB)、電噴霧電離(ESI)、大氣壓化學電離(APCI)。現在,一種內噴射式和粒子流式介面技術將液相色譜與質譜聯接起來,已成功地用於分析對熱不穩定,分子量較大,難以用氣相色譜分析的化合物。具有檢測靈敏度高、選擇性好、定性定量同時進行、結果可靠等優點。LC-MS對簡單樣品可進行分析前凈化並具有幾乎通用的多殘留分析能力,用於對初級監測呈陽性反應的樣品進行在線確證,其優勢明顯。盡管LC/MS儀器價格昂貴,液相色譜和質譜的介面技術尚不十分成熟,但它仍是一種很有利用價值的高效率、高可靠性分析技術。
2.7 免疫分析法(IA)
免疫分析法是基於抗原抗體的特異性識別和結合反應為基礎的分析方法[5]。分子量大的農葯可以直接作為抗原進入脊椎動物的體內產生免疫應答,從而得到可以和該農葯分子特異性結合的抗體;分子量小的農葯(分子量<2500)一般不具備免疫抗性,不能刺激動物產生免疫反應。將農葯小分子以半抗原的形式通過一定碳鏈長度的分子量大的載體蛋白質(通常使用牛血清白蛋白、人血清白蛋白、兔血清白蛋白、鑰孔血藍蛋白、卵清蛋白)用共價鍵偶聯製成人工抗原,使動物產生免疫反應,產生識別該農葯並與之特異性相結合的抗體。通過對半抗原或抗體進行標記,利用標記物的生物、物理、化學放大作用,對樣品中特定的農葯殘留物進行定性、定量檢測。免疫分析法被列為90年代優先研究、開發和利用的農葯殘留分析技術,美國化學會將免疫分析與氣象色譜、液相色譜共同列為農葯殘留分析的支柱技術[6]。免疫分析法具有快速、簡單、靈敏和選擇性高等優點,目前已廣泛應用於糧食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中農葯殘留的檢測。根據採用的檢測手段不同,可分為放射免疫法、熒光免疫法、酶免疫法、流動注射免疫分析法等,其中以酶免疫法應用最為廣泛[7]。
2.8 生物感測器(Biosensorand)
生物感測器(Biosensorand)是由一種生物敏感膜和電化學轉換器兩部分緊密配合,對特定種類的化學物質或生物活性物質具有選擇性和可逆響應的分析裝置。它由識別元件、信號轉移和信號傳遞電路組成,其特點是集生物化學、生物工程、電化學、材料科學和微型製造技術於一體,是一個典型的多學科交叉產物。按其生物功能,可分為酶感測器(En-zyme Biosensor,包括電位型和電流型)、免疫感測器(Immunosensors)、微生物感測器(Microbial sen-sor)[8]。具有微型化、響應速度快、樣品用量少並可以插入生物組織或細胞內的特點,可實現超微量在線快速跟蹤分析,在農葯殘留分析上得到了廣泛的應用。
2.9 實驗室機器人
實驗室機器人現已商品化,但在農葯殘留量分析和環境監測方面的應用還處於起步階段,主要是因為機器人工作程序的變更缺乏靈活性和實驗室檢測方法缺乏標准化所造成,另外機器人系統動作緩慢,一般要求寬闊的空間。當實驗室機器人變得更方便、靈活,實驗方法也更加標准化時,它的使用將會增加。
3 結語
農葯殘留分析是一門綜合性強、涉及面廣的分析科學。檢測方法應具備簡便、快捷、靈敏度高的特點,根據檢測目的、待測農葯性質和樣本的種類等採用符合要求的方法。新的分析技術將要求有細胞化學、發酵化學、免疫化學和多肽排列結構等方面學科知識的支持。隨著科學技術的不斷發展,殘留分析技術也正在不斷更新、完善和迅速發展

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