四氫喹啉液相分析方法

『壹』 氨基酸分析法的方法分類

本法系根據氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲醯氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離後用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然後加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流動相B 乙腈－水（8：2）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自「置一2ml塑料離心管中」起同法測定。 本法系根據氨基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。
試劑 （1）流動相A 取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然後加水至1000 ml。
（2）流動相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然後加水稀釋至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC適量，加乙腈溶解並稀釋製成每1ml中含1mg的溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 測定法 精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 70μl，在渦旋混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自「置一直徑為0.4cm」起同法測定。 本法系根據一級氨基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-氨基酸；反應完畢後，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩餘的二級氨基酸與FMOC繼續反應，生成FMOC-氨基酸，兩次反應生成的氨基酸衍生物經反相高效液相色譜分離後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～2.5µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2%醋酸調pH至7.2。
（2）流動相B 稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然後加水稀釋至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度及流速如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 測定法 精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑料離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.2) 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自「置一1.5ml塑料離心管中」起同法測定。
附註：1、由於OPA-氨基酸不穩定，因此衍生後應立即進行分離測定。
2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。 本法系根據氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離後採用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規定外，一般不宜採用本法。
試劑 （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液(取 4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲醯胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml)。
（2）流動相B 流動相A-乙腈（1：1）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自「置一50ml量瓶中」起同法測定。 本法系根據氨基酸經陽離子交換色譜柱分離後，與茚三酮反應，一級氨基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為20～500 pmol。
試劑 （1）流動相A 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。
（2）流動相B 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。
（3）流動相C 取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。
（4） 色譜柱再生溶液 取氫氧化鈉0.8g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。
（5）柱後衍生試劑 取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7%二甲基亞碸－0.7二水合醋酸鋰－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。
（6）樣品緩沖液 2%無水檸檬酸鈉-1%鹽酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱後衍生試劑得流速為每分鍾7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm(一級氨基酸)，570nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鍾流動相的組成變為100%流動相B，在37分鍾，流動相組成變為100%流動相C，在75min，最後一個氨基酸被洗脫後，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鍾。柱溫程序如下：開始時柱溫48℃，11.5分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至65℃，約35分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至77℃，最後在約52分鍾後，以每分鍾3℃的速率降至77℃。
測定法 精密量取氨基酸對照品溶液適量，注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。
附註：不同品牌的氨基酸分析儀，應根據儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩沖液和洗脫梯度作適當調整。