㈠ 簡述研究小分子與蛋白相互作用的方法有哪些
在生物化學中，涉及到蛋白質與配體（包括蛋白質結合小分子，酶催化底物和抑制劑結合等等）的相互作用時，有不少衡量相互作用的生化指標，其中包括 Ki值（抑制常數），Kd值（解離常數），Km值（米氏常數）
1） Kd值：dissociation constant
針對的是蛋白質與小分子（如LAC等），指的是解離常數，單位是M.該常數反映了與蛋白質結合的小分子的解離速率，也直接決定蛋白質與小分子的親和力（affinity）。是定量描述蛋白質與小分子結合的主要生化指標。
2） Ki 值：inhibitor constant 針對的是蛋白質與抑制劑，指的是抑制劑常數, 單位是M.
與Kd值的計算一樣，反映出抑制劑與蛋白質的結合緊密程度。
3） Km值：是針對酶與底物的催化反應，Km指的是米氏常數（為了紀念Michaelis和Meten），是由一些速率常數組成的復合常數，等於酶的反應速率達到反應速率的一半時的底物濃度,單位是M.
這幾個常數，Kd與Ki，按照我的理解來說差別不大，只是Ki代表的是抑制劑與蛋白質的Kd，本質上無差異。Km值的推導Km值的推導比Kd,Ki要復雜，主要在於酶的催化過程，不僅包括前面的結合，還有後續的催化得到新的底物，這與前面的單一可逆過程是有區別的。
㈡ 基因功能研究方法(細胞水平功能獲得、功能+缺失方法、蛋白質相互作用)
摘要 您好，很高興回答你的問題
㈢ 各種蛋白互作檢測方法有哪些優缺點
雙雜交技術 原理基於真核細胞轉錄因子的結構特殊性，這些轉錄因子通常需要兩個或以上相互獨立的結構域組成。分別使結合域和激活域同誘餌蛋白和獵物蛋白形成融合蛋白，在真核細胞中表達，如果兩種蛋白可以發生相互作用，則可使結合域和激活域在空間上充分接近，從而激活報告基因。 缺點：自身有轉錄功能的蛋白會造成假陽性。融合蛋白會影響蛋白的真實結構和功能。不利於核外蛋白研究，會導致假隱性。
熒光共振能量轉移技術 指兩個熒光法色基團在足夠近(<100埃)時，它們之間可發生能量轉移的現象。熒光共振能量轉移技術可以研究分子內部對某些刺激發生的構象變化，也能研究分子間的相互作用。它可以在活體中檢測，非常靈敏，分辯率高，能夠檢測大分子的構象變化，能夠定性定量的檢測相互作用的強度。 缺點 此項技術要求發色基團的距離小於100埃。另外設備昂貴，還需要融合GFP給蛋白標記。http://doc.bio1000.com/list-81.html 生化標記技術文檔，生化標記技術文檔下載，生物幫上面有介紹的。
㈣ 蛋白質相互作用如何研究要研究一種蛋白的功能要從何開始如何進行研究
確證蛋白質蛋白質相互作用可以用酵母雙雜交系統（Yeast two-Hybrid System），熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer）等；
研究與特定蛋白相互作用的有噬菌體展示（Phage Display），免疫共沉澱（co- Immuno precipitation），蛋白質晶元等；
研究蛋白質互作動力學的有等離子共振技術（Surface Plasmon Resonance）等；
研究蛋白質互作的結構則需要X射線，NMR等。
研究未知蛋白的功能可以用基因敲除或RNA干擾等使蛋白不表達，看對細胞功能有怎樣的影響。如果要研究蛋白質不同結構域的功能可以利用酶切或者用質粒構建等方法表達蛋白質的片段來看蛋白質不同結構域對功能的影響。
這個過程中也離不開Western，質譜（Mass Spectrum）這些技術的輔助。
這些技術原理都比較好理解，實際做還是比較復雜的，可以看看Wikipedia和相關書籍。具體策略制定還是看你的具體需要了。
㈤ 研究蛋白質相互作用的意義是什麼如何能夠分離到細胞內的多蛋白復合體。（需要很詳細或者直接指出出處）
蛋 白質與蛋白質之間相互作用構成了細胞生化反應網路的一個主要組成部分，蛋白-蛋白互作網路與轉錄調控網路對調控細胞及其信號有重要意義。把原來spaces空間上的一篇蛋白質與蛋白質間相互作用研究方法轉來，算是實驗技巧分類目錄的首篇。 一、酵母雙雜交系統 酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後，誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統的功能。此外，酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。 二、噬茵體展示技術 在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文庫，並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。 三、等離子共振技術 表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」，當待測蛋白與誘餌蛋白結合後，薄膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用於檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。 四、熒光能量轉移技術 熒光共振能量轉移（FRET ）廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白（GFP）的發展，FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用於基於GFP 的供體受體對。 五、抗體與蛋白質陣列技術 蛋白晶元技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體晶元就是一個非常好的研究工具，他也是晶元中發展最快的晶元，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展，比如腫瘤標志物抗體晶元等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。 六、免疫共沉澱技術 免疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用[/url]的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育後再加入與抗體特異結合的結合於Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：「目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPA\|Pansobin」，因為SPA\|Pansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，復合物四組分又被分開。然後經Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什麼，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；二是必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。 七、pull-down技術 蛋白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉澱（Co-IP） 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白（生物素-、PolyHis-或GST-），從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。
㈥ 如何探究兩個蛋白質之間的直接或間接相互作用
A蛋白調節B蛋白的轉錄 是指 DNA與蛋白質的相互作用A蛋白調節B蛋白的翻譯 才是蛋白質之間的相互作用現在來說 研究蛋白互作的方法很多 如果A與B是已確定的兩個蛋白 只需驗證的話 可以採用酵母雙雜交 細菌雙雜交 COIP 以及SPR表面等離子共振如果只知道A或者B 要找到與其有相互作用的蛋白 這樣的話 可以採用構建基因組文庫 然後雙雜交篩選 也可以在A或B蛋白加上tag 純化 得到的mixture 再過質譜鑒定成分 然後再回過頭來 採用雙雜交或者coip進一步驗證
㈦ 蛋白質之間相互作用的研究方法有哪些
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗。研究蛋白質/ 核酸相互作用近期採用的新技術有：核酸適體技術、生物信息學方法、蛋白質晶元技術以及納米技術等。
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.
㈧ 研究蛋白質和DNA的相互作用用什麼方法比較好
具體選用什麼方法還要看你用什麼實驗模型。以我所想到的，以體外做細胞培養比較合適。EMSA（即PRP提到的 gel mobility shift）是比較合適的方法。
但EMSA只是測定蛋白與DNA的BIND 能力強弱。樓主的題目和提問的主體似乎有些不相符合。意思是說要研究的這個蛋白作用在c-myc 基因的啟動子上嗎？如果是這樣，不用c-myc 基因就行，只把它的啟動子找出來，連到報告基因上，轉染細胞就行了。如果是這種情況，我們可以再討論。
除了BIND能力強弱，還要看最終對c-myc 基因表達的影響，所以測基因表達的一系列，RT-PCR了，WB了，都是不可少的。
㈨ DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些
研究蛋白質與DNA相互作用的主要方法
一、引言
在許多的細胞生命活動中,例如DNA復制、mRNA轉錄與修飾以及病毒的感染等都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用的問題.
重組DNA技術的發展,人們已分離到了許多重要的基因.現在的關鍵問題是需要揭示環境因子及發育信號究竟是如何控制基因的轉錄活性.為此需要：
a、鑒定分析參與基因表達調控的DNA元件；
b、分離並鑒定這些順式元件特異性結合的蛋白質因子；
這些問題的研究都涉及到DNA與蛋白質之間的相互作用.
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：
a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；
c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗.
二、凝膠阻滯實驗
1、概念：
凝膠阻滯實驗（Gel retardation assay）,要叫做DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay）或條帶阻滯實驗（Band retardation assay）是在八十年代初期出現的用於在體外研究DNA與蛋白質相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術.
2、原理：
在凝膠電泳中,由於電場的作用,裸露的DNA分子向正電極移動距離的大小是同其分子量的對數成反比.如果某種DNA分子結合上一種特殊的蛋白質,那麼由於分子量的加大它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯,於是朝正極移動的距離也就相應的縮短,因而在凝膠中出現滯後的條帶,這就是凝膠阻滯實驗的基本原理.
3、過程:
1)\x09首先制備細胞蛋白質提取物（理論上其中含有某種特殊的轉錄因子）
2)\x09用放射性同位素標記待檢測的DNA片段（含有轉錄因子的結合位點）
3)\x09這種被標記的探針DNA同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,於是產生DNA-蛋白質復合物
4)\x09在控制使DNA-蛋白質保持結合狀態的條件下,進行非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳
5)\x09最後進行放射自顯影,分析電泳結果
4、實驗結果的分析：
a、如果有放射性標記的條帶都集中於凝膠的底部,這就表明在細胞提取物中不存在可以同探針DNA相互結合的轉錄因子蛋白質；
b、如果在凝膠的頂部出現放射性標記的條帶,這就表明細胞提取物存在可與探針DNA結合的轉錄因子蛋白質.
5、DNA競爭實驗：
DNA競爭實驗（DNA competitive assay）的具體做法如下：
在DNA-蛋白質結合的反應體系中加入了超量的非標記的競爭DNA（competitor DNA）,如果它同探針DNA結合的是同一種轉錄因子蛋白質,那麼由於競爭DNA與探針DNA相比是極大超量的,這樣絕大部分轉錄因子蛋白質都會被競爭結合掉,而使探針DNA仍然處於自由的非結合狀態,可以在電泳凝膠的放射自顯影圖片上就不會出現阻滯的條帶；
如果反應體系中加入的競爭DNA並不能同探針DNA競爭結合同一種轉錄因子,結果在電泳凝膠中的放射自顯影圖片上就會出現阻滯的條帶.
6、應用：
a、凝膠阻滯實驗可以用於鑒定在特殊類型細胞蛋白質提取物中,是否存在能同某一特定的DNA（含有轉錄因子結合位點）結合的轉錄因子蛋白質；
b、DNA競爭實驗可以用來檢測轉錄因子蛋白質同DNA結合的精確序列部位；
c、通過競爭DNA中轉錄因子結合位點的鹼基突變可以研究此種突變競爭性能及其轉錄因子結合作用的影響；
d、也可以利用DNA同特定轉錄因子的結合作用通過親和層析來分離特定的轉錄因子.
三、足跡實驗
1、定義:
足跡實驗（foot-printing assay）,是一種用來檢測被特定轉錄因子蛋白質特異性結合的DNA序列的位置及其核苷酸序列結構的專門實驗方法.
2、原理：
當DNA分子中的某一區段同特異的轉錄因子結合之後便可以得到保護而免受DNaseI 酶的切割作用,而不會產生出相應的切割分子,結果在凝膠電泳放射性自顯影圖片上便出現了一個空白區,俗稱為「足跡」.
3過程：
將待檢測的雙鏈DNA分子在體外用32P作5『末端標記,並用適當的限制性內切酶切出其中的一個末端,於是便得到了一條單鏈末端標記的雙鏈DNA
在體外同細胞蛋白質提取物（細胞核提取物也可以）混合,形成DNA-蛋白質復合體
在反應混合物中加入少量的DNase I,並控制用量使之達到平均每條DNA鏈,只發生一次磷酸二酯鍵的斷裂：
a、如果蛋白質提取物中不存在與DNA結合的特定蛋白質,使DNase I消化之後,便會產生出距離放射性標記末端1個核苷酸,2個核苷酸,3個核苷酸------等等一系列前後長度均相差一個核苷酸的不間斷的連續的DNA片段梯度群體；
b、如果DNA分子同蛋白質提取物中的某種轉錄因子結合,被結合部位的DNA就可以得到保護免受DNase I酶的降解作用；
除去蛋白,加樣在20%序列膠上進行電泳分離,實驗分兩組:
a、實驗組：DNA+蛋白質混合物
b、對照組：只有DNA,未與蛋白質提取物進行溫育
最後進行放射性自顯影,分析實驗結果.
4、結果判斷:
實驗組凝膠電泳顯示的序列,出現空白的區域表明是轉錄因子蛋白質結合部；與對照組序列比較,便可以得出蛋白質結合部位的DNA區段相應的核苷酸序列.
5、其他的足跡實驗方法：
除了DNase1足跡試驗之外,目前還發展出了若干種其他類型的足跡實驗,例如：
a、\x09自由羥基足跡實驗；b、菲咯啉銅足跡實驗；c、DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗
DMS(硫酸二甲酯)足跡實驗的原理
DMS能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割.如果DNA分子中某一區段同轉錄因子結合,就可以避免發生G殘基的甲基化而免受六氫吡啶的切割作用.
四、甲基化干擾實驗
1、概念：
甲基化干擾實驗（Methylation interference assay）是根據DMS（硫酸二甲酯）能夠使DNA分子中裸露的鳥嘌呤（G）殘基甲基化,而六氫吡啶又會對甲基化的G殘基作特異性的化學切割這一原理設計的另一種研究蛋白質同DNA相互作用的實驗方法.
應用這種技術可以檢測靶DNA中G殘基的優先甲基化,對爾後的蛋白質結合作用究竟會有什麼效應,從而更加詳細的揭示出DNA與蛋白質相互作用的模式.
2、實驗步驟：
用DMS處理靶DNA使之局部甲基化（平均每條DNA只發生一個G鹼基甲基化作用）
同細胞蛋白質提取物一起進行溫育,促進使DNA與蛋白質的結合
進行凝膠電泳形成兩種靶DNA條帶：
a、\x09其一沒有同蛋白質結合的DNA正常電泳條帶
b、其二同特異蛋白質結合而呈現滯後的DNA電泳條帶
將這兩種DNA電泳條帶分別從凝膠中切出,並用六氫吡啶進行切割,結果為：
a、甲基化的G殘基被切割:因為轉錄因子蛋白質只能夠同未發生甲基化的正常的結合位點結合,所以在轉錄因子DNA結合位點序列中的G殘基如果被DMS甲基化之後,轉錄因子就無法同其結合位點（順式元件）發生結合作用,從而使得結合位點中的G殘基同樣也要被六氫吡啶切割；
b、不具有甲基化G殘基的靶DNA 序列則不會被切割
將結合蛋白質的DNA條帶和不結合蛋白質的DNA條帶,經六氫吡啶切割作用之後,再進行凝膠電泳
作放射自顯影,讀片並分析結果
3、結果判斷：
a、同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割之後,電泳分離呈現兩條帶,有一個空白區
b、不同轉錄因子蛋白質結合的靶DNA序列,經六氫吡啶切割後,電泳分離呈現三條帶,沒有空白區域的出現.
4、應用：
a、甲基化干擾實驗可以用來研究轉錄因子與DNA結合位點中的G殘基之間的聯系；
b、是足跡實驗的一種有效的補充手段,可以鑒定足跡實驗中DNA與蛋白質相互作用的精確位置
5、缺點：
DMS只能使DNA序列中的G和A殘基甲基化,而不能使T和C殘基甲基化.
五、體內足跡實驗
上面討論的三種研究轉錄因子與DNA相互作用的方法,有一個共同的不足之處在於它們是在體外進行的實驗,因此人們就會考慮這些實驗結果是否能夠反映細胞內發生的真實生命過程,即細胞內發生的真實的DNA與蛋白質的相互作用情況.
為了解答這個問題,科學家就設計出了一種體內足跡試驗（in vivo foot-printing assay）,該方法可以看做是體外DMS足跡實驗的一個變種.
1、原理：
體內足跡試驗的原理原則上同體外DMS足跡實驗無本質差別,即
a、DMS能夠使G殘基甲基化；
b、六氫吡啶能特異的切割甲基化的G殘基；
c、同特異轉錄因子蛋白質結合的識別序列中的G殘基由於受到蛋白質的保護而不會被DMS甲基化,於是不會被六氫吡啶切割；
d、同對照的裸露的DNA形成的序列梯作比較,就會發現活細胞DNA形成的序列梯中缺少G殘基沒有被切割的相應條帶.
2、過程：
用有限數量的化學試劑DMS處理完整的游離細胞,使滲透到胞內的DMS濃度恰好導致天然染色體DNA的G殘基發生甲基化
對這些經過DMS處理的細胞提取DNA,並在體外加入六氫吡啶作消化反應
PCR擴增後作凝膠電泳分析,因為在體外實驗中用的是克隆的DNA片段其數量足夠,而在體內足跡實驗中用的是從染色體DNA中分離獲得的任何一種特異的DNA,其數量是微不足道的,所以需要經PCR擴增以獲得足夠數量的特異DNA
放射自顯影,讀片並記錄讀片的結果
3、結果判斷：
a、能夠同轉錄因子蛋白質結合的DNA區段其中G殘基受到保護因而不會被DMS甲基化避免了六氫吡啶的切割作用；
b、體外裸露的DNA分子上,G殘基被DMS甲基化而被六氫吡啶切割.
六、拉下實驗（Pull-down assay）
拉下實驗又叫做蛋白質體外結合實驗（binding assay in vitro）,是一種在試管中檢測蛋白質之間相互作用的方法.其基本原理是將某種小肽（例如生物素、6-His標簽以及谷胱甘肽轉移酶等）的編碼基因與誘餌蛋白的編碼基因重組,表達為融合蛋白.分離純化融合蛋白並與磁珠結合,使之固相化之後,再與表達目的蛋白的細胞提取物混合保溫適當時間,例如在4℃下保溫過夜,使目標蛋白同已經固定在磁珠表面的融合蛋白中的誘餌蛋白充分的結合.離心收集與固定化的融合蛋白（即與磁珠相互結合的融合蛋白）中的誘餌蛋白相結合的目的蛋白,經過煮沸處理使目的蛋白與誘餌蛋白相脫離從而從固相支持物（例如磁珠）上脫離下來,收集樣品,再與目標蛋白的抗體作Western blotting分析,以檢測出與誘餌蛋白的目標的目標蛋白.
染色質免疫共沉澱技術（ChIP） 真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在.因此,研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑.染色質免疫沉澱技術（chromatin immunoprecipitation assay, CHIP）是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法.它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質－DNA復合物,並將其隨機切斷為一定長度范圍內的染色質小片段,然後通過免疫學方法沉澱此復合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息.CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用范圍：CHIP與基因晶元相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選；CHIP與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點；RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用.由此可見,隨著CHIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用. 染色體免疫共沉澱（Chromatin Immunoprecipitation,ChIP）是基於體內分析發展起來的方法,也稱結合位點分析法,在過去十年已經成為表觀遺傳信息研究的主要方法.這項技術幫助研究者判斷在細胞核中基因組的某一特定位置會出現何種組蛋白修飾.ChIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關系.近年來,這種技術得到不斷的發展和完善.採用結合微陣列技術在染色體基因表達調控區域檢查染色體活性,是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神經系統紊亂等疾病的主要代謝通路的一種非常有效的工具. 它的原理是在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來.IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法.目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的.實驗最需要注意點就是抗體的性質.抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應.建議仔細檢查抗體的說明書.特別是多抗的特異性是問題.其次,要注意溶解抗原的緩沖液的性質.多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩沖液必須要使其溶解.為此,必須使用含有強界面活性劑的緩沖液,盡管它有可能影響一部分抗原抗體的結合.另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白.即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果.再次,為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩沖液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗.每次實驗之前,首先考慮抗體/緩沖液的比例.抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清.緩沖劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋. ChIP的一般流程： 甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA復合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA復合物,並沉澱---對沉澱下來的復合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA復合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析. 在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR.但是現在隨著熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向於Q-PCR了.此外還有一些由ChIP衍生出來的方法.例如RIP（其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA）；還有ChIP-chip（其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做晶元分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來准備樣品）.
GST沉澱實驗（GST-pull down實驗）（細胞外蛋白質相互作用）5-11
上面提到,用酵母雙雜交方法篩選到的蛋白需要作進一步的鑒定.鑒定方法之一就是 GST
沉澱實驗.GST 沉澱實驗主要是用來證明蛋白質胞外的相互作用.蛋白質在胞外的相互作用排除了酵母細胞內復雜體系的干擾,比較直接地檢驗蛋白質分子之間存在的物理的相互作用.同酵母雙雜交實驗一樣,運用此法也可以證明相互作用的蛋白分子中是否有參與調節作用的結構域或 motif.GST\x09沉澱實驗原理就是,把你要研究的蛋白基因亞克隆到帶有GST（谷胱甘肽轉移酶）基因的原核表達載體中,並在細菌中表達 GST 融合蛋白（GST-X）.把 GST 融合蛋白掛到帶有 GST 地物的 Sepharose beads 上,然後把另一種蛋（Y）白加入其中.由於蛋白質之間的結合作用,形成了這樣的復合物：GST-X----Y.這一復合物與固體支持物（Sepharose beads）又
結合在一起,可以被沉澱下來.此法又有在不同情況下的具體應用,以下一一作介紹.
（1）\x09GST 融合蛋白與重組蛋白的相互作用
GST 融合蛋白是在原核表達的,所以沒有經過過多的象真核細胞內具有的蛋白修飾作用.
所以另一種用來檢驗相互作用的蛋白也可以用原核表達出來,也就是所謂的重組蛋白.當 GST融合蛋白把重組蛋白沉澱下來,然後用重組蛋白的抗體作 Western blotting 檢測.
（2） GST 融合蛋白與體外 TNT 系統合成的多肽或蛋白的相互作用
用來檢驗與GST融合蛋白相互作用的蛋白或多肽也可以用TNT體外蛋白合成體系進行合
成,並且還可以在要合成的蛋白或多肽N端或C端加上便於檢測的標簽.GST融合蛋白沉澱下來的蛋白或多肽可以用該蛋白或多肽的抗體或標簽抗體進行Western blotting檢測.如果蛋白之間結合力非常弱,用Western blotting檢測方法難以檢測到,你可以在TNT體外合成時給蛋白進行同位素（S32）標記.這樣沉澱下來的蛋白進行放射自顯影,檢測靈敏度將極大提高.
（3） GST 融合蛋白與細胞內源性蛋白質的相互作用
GST融合蛋白還可以把細胞提取物中有相互作用的內源性蛋白質沉澱下來.如果內源性蛋
白含量低或結合力弱,可以採用脈沖法使細胞在某一段時間內合成的所有蛋白質都標記上放射性同位素（S32）,然後提取細胞總蛋白與GST融合蛋白溫育.GST融合蛋白沉澱下的帶有放射性標記的蛋白跑電泳,進行放射自顯影.
（4） GST 融合蛋白與細胞內瞬時表達的蛋白質的相互作用
當內源性蛋白質含量低,並且有可能影響蛋白質的相互作用,也可以把該蛋白的基因轉染
到靶細胞內進行過表達,然後檢驗蛋白質相互作用.
（5） GST 融合蛋白與待測蛋白的相互作用有可能與待測蛋白的磷酸化狀態有關在進行 GST 沉澱實驗時,有時也會遇到比較復雜的情況,具體情況具體分析,分別對待.比如,兩個蛋白質之間發生相互作用時有可能與蛋白磷酸化狀態有關.或者蛋白首先被磷酸化後方能產生相互作用,或者磷酸化的蛋白必需脫磷酸化後才能產生相互作用.如果你確實在你
的實驗中發現了其中一種情況,這將是一個非常有意義的結果.
3,\x09免疫共沉澱（co-immunoprecipitation ）（細胞內蛋白質相互作用）9-16
免疫共沉澱技術用來證明蛋白質在胞內是否有相互作用.一般來說,兩種蛋白在細胞內發
生相互作用時會形成兩種蛋白的復合物,這樣就可以先用一種蛋白的抗體把免疫復合物沉澱下來,然後用另一種蛋白的抗體進行 Western blotting 檢測,看兩種蛋白之間是否確實形成免疫復合物,並能與 protein A/G agarose 一起沉澱下來.免疫共沉澱原理簡單,但技術極為復雜.因為細胞內蛋白種類繁多,制約因素多.如果兩種蛋白之間可以發生相互作用,並不是這兩種蛋白所有分子都參與結合作用,也可能只有極少部分蛋白分子結合在一起（足以滿足細胞功能需要）.在提取細胞蛋白時,如果條件不當就會破壞兩種相互作用蛋白形成的復合物的穩定性,使得免疫共沉澱實驗失敗.如果兩種蛋白在細胞內的結合力確實非常弱,那麼免疫共沉澱也難以成功.如果知道發生相互作用的兩個蛋白都是胞核蛋白,那麼可以通過提取核蛋白,再進行免疫共沉澱實驗,這樣會大大減低背景的干擾.關於兩種蛋白質之間胞內的相互作用,有時確實無法用免疫共沉澱實驗證明.
（1） 細胞內過表達蛋白的免疫共沉澱
證明蛋白質胞內相互作用時,可以選擇一個高效瞬時過表達系統（至於這一系統是否有內
源性靶蛋白無關緊要）.一般採取 COS 細胞作為真核表達株.把兩種蛋白基因共轉染到 COS 細胞內進行表達.由於人為進行大量表達,所以在胞內兩種蛋白形成相互作用的復合物的量也相應增多.如果你手頭沒有這兩種蛋白的抗體,可以把這兩種蛋白的一端分別加上標簽以融合蛋白形式表達,然後用商業化的抗標簽抗體進行免疫共沉澱和 Western blotting 檢測.
（2） 細胞內源性蛋白的免疫共沉澱
把兩種蛋白共轉染到 COS 細胞內進行過表達,進行免疫共沉澱實驗,相對容易成功,但是
這一結果畢竟具有人工性,不能代表生理條件下真實的蛋白質相互作用.要想克服這一弱點,
可以做內源性的免疫共沉澱實驗.這一技術要求極高,難度極大,但也最有說服力.因為細胞內內源性蛋白含量低,結合在一起形成復合物的量更低,難以檢測.首先要證明所選擇的細胞系是否具有這兩種內源性的蛋白.另外,用於免疫沉澱和 Western blotting 檢測的抗體要好.細胞裂解、收集以及免疫沉澱時時條件要溫和,以保持蛋白復合物的天然結構.
（3） 組織內蛋白的免疫共沉澱
在體外可以大量培養細胞,然後制備細胞提取物,做內源性免疫共沉澱.由此可以推廣到做
組織內免疫共沉澱.取動物組織（腦、肝、脾等）,切碎,勻漿,提取組織蛋白,進行免疫共沉澱實驗.這一結果代表活體中蛋白質相互作用.
4,\x09蛋白質細胞內定位實驗17-22
另一種經常用來檢驗蛋白質相互作用的方法是蛋白質細胞內定位技術.此法較為直觀,可
以看到兩種有相互作用的蛋白質在細胞內的分布（膜上、胞漿、胞核或其它細胞器等等）以及共定位的部位（在膜上共定位、在胞漿中某一部位或核內共定位等等）.有時相互作用的蛋白由於細胞內某種功能的需要結合在一起時,使得兩種蛋白的分布發生變化.比如,某種蛋白也許在核內,當它與另一種具有穿梭功能的蛋白結合時,有可能被轉運到胞漿中.這種情況的共定位則較為典型.在進行蛋白質共定位
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位.把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白,實際上是兩個融合蛋白.融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致,有待於進一步確定.而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點.
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是,首先把細胞進行固定,然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應,再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應.這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗）,結果靶蛋白被標上顏色,然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果.
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用.當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白,然後標記目的蛋白進行觀測.免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高,結果受到干擾,所以這項技術不好掌握.為了結果的可靠性,要求嚴格設計陽性對照與陰性對照.
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下,有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開,沒有共定位現象發生.
但是在某一個特定情況下,如細胞受到外界刺激時,細胞本身會產生應急反應,這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用,並產生共定位現象.所以在進行共定位研究時,可根據具體情況具體分析,必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果.
【TSD、M】
㈩ 研究葯物與蛋白質相互作用的方法有哪些
方法主要包括：a、凝膠阻滯實驗；
b、DNase
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足跡實驗；c、甲基化干擾實驗；
d、體內足跡實驗；
f、拉下實驗。研究蛋白質/
核酸相互作用近期採用的新技術有：核酸適體技術、生物信息學方法、蛋白質晶元技術以及納米技術等。