甘油三酯什麼方法測定

1. 甘油三酯的測定方法

血清甘油三酯/三醯甘油（TG）是一項重要的臨床血脂常規測定指標，特別是隨著對其致動脈粥樣硬化（AS）作用研究的深入，TG作為冠心病的一項獨立的危險因素日益受到重視。但是血清TG測定及其臨床應用尚存在很多問題，如生物學變異、游離甘油對測定的影響、測定的標准化系統不完善等等。本文僅對TG的生物化學、測定方法與標准化、臨床意義等方面的近況作一簡述。 血清TG測定方法一般可分為化學法、酶法和色譜法3大類。早期測定方法是以總脂質與膽固醇和磷脂之差估算。化學法用有機溶劑抽提標本中的TG，去除抽提液中磷脂等干擾物後，用鹼水解（皂化）TG，以過碘酸氧化甘油生成甲醛，然後用顯色反應測甲醛。比較准確的是二氯甲烷-硅酸-變色酸法（Van Handel-Caslson法），此法抽提完全、能去除磷脂及甘油干擾、變色酸顯色靈敏度高、顯色穩定，至今還是美國疾病控制與預防中心（CDC）的內部參考方法。但因操作步驟繁多、技術要求高而不適於常規工作應用。核素稀釋/氣相色譜/質譜技術（ID/GC/MS）主要用作參考系統中決定性方法的建立及參考物質的制備與定值，此法費用昂貴，樣品處理復雜，難以推廣應用。
所有的臨床實驗室都用酶法檢測血清TG水平，雖然方法各異，但一般都包括3個基本步驟[3,5～7]：用最合適的LPL水解TG生成甘油和FFA；接著是轉化，該步驟一般只用一種酶，例如甘油激酶，將甘油磷酸化以進行下一步反應，或者生成中間待測物；最後是有色染料（常為醌亞胺等）或者紫外吸收物質的形成，再通過分光光度法計算相應的TG濃度。如脂蛋白脂肪酶-甘油磷酸氧化酶- 過氧化物酶-4-氨基安替比林和酚法（GPO-PAP 法）等。此法具有簡便快速、微量、精密度高的優點，且特異性強，易於達到終點，線性范圍寬。用一步法測定的是血清總甘油酯（定義為TG和FG及少量甘油二酯、甘油一酯之和，習慣統稱為TG）。為了消除FG的干擾，中華醫學會檢驗分會曾推薦GPO-PAP 法的兩步酶法作為血清TG常規測定方法[7]，該法不增加試劑成本和工作量，適合自動化分析，由於試劑分成兩部分加入，對正確設置分析測定參數有較高要求。對此法能否去凈游離甘油方面有人提出質疑。針對這一情況，中華醫學會檢驗分會在《關於臨床血脂測定的建議》文件中建議酶法如GPO-PAP 法作為臨床實驗室測定血清TG的常規方法。普通臨床常規實驗室可採用一步GPO-PAP法，有條件的實驗室（如三級以上醫院）應考慮開展游離甘油的測定。
血清FG對TG測定結果的影響一直是臨床十分關注的問題。國外資料顯示，正常人體血清FG含量為0.06～0.22mmol/L，約占總TG的6%～14%[3]。國內的研究結果與此相近，中國正常人血清FG 水平平均約為0.08mmol/L（0.02～ 0.33mmol/L），約占總TG7.19%（0.81% ～21.64%）。雖然臨床標本中FG顯著升高者很少見，但有些異常或病理情況下如應激反應（腎上腺素激活LPL促進體內脂肪水解），劇烈運動，服用含甘油的葯物如硝酸甘油，靜脈輸入含甘油的營養液，肝素治療，某些嚴重的糖尿病、肝病與腎病，取血器材或試管塞上帶有甘油等時，可見血清FG顯著升高，並給臨床決策帶來誤導[3]。因此，可採取測定「真」TG的方法減少其影響：一種是同時測定總甘油和FG，兩個結果的差值反應了真TG濃度（外空白法），另一種是用上文所述的兩步酶法直接測定TG（內空白法）。前者國內外應用較少，後者國外（如日本）使用較多，已有許多臨床實驗室開展。
對於FG空白的設置建議採取如下措施：
⑴臨床實驗室應備有可以做FG空白的檢測系統，在任何情況下都可以做FG空白；
⑵TG報告單中應標明是否為FG空白結果，實驗室應告知臨床醫生FG空白的意義；
⑶臨床及基礎研究、參加CDC脂質標准化計劃的實驗室都要做FG空白；
⑷住院病人中內源性甘油過高群體的標本都應做FG空白；
⑸體檢及門診患者可以不做FG空白，但糖尿病或其他特殊門診例外；
⑹FG>2.3mmol/L者最好做FG空白；
⑺對某些可疑情況，如TG高而血清不混濁應排除高FG的可能。
此外，一些物質如抗氧化物質（維生素C等）、黃疸、溶血、脂血等對酶法測定TG有干擾，可採用設置血清空白予以消除。
在應用自動生化分析儀進行臨床常規TG測定時，還要特別注意交叉污染和基質效應。最易對TG測定產生交叉污染的是總蛋白和鐵試劑，因其還原物質濃度可影響Trinder反應。如果接著TG測定直接膽紅素，也會因表面活性劑的導入產生誤差。鐵測定對TG的影響與亞鐵氰化鉀的量有關。此外，還要注意常規酶法測定TG對制備物的基質效應。Halani等用24份新鮮血清為對照，對5份CAP制備的凍干血清及9份CDC冰凍混合血清進行了評價。以3種商品TG酶試劑測定，以CDC參考方法為對比方法，校正游離甘油後，2種商品試劑對CAP及CDC血清均無基質效應，另一種商品試劑對4份CAP血清有基質效應。也有資料表明，各種質控血清中FG佔TG的12%～85%。我們的研究也發現，臨床使用的各種TG檢測試劑盒、不同的測定/校準系統、質控血清之間存在明顯的基質效應，因此對於不同方法/試劑的選擇，如選用兩步酶法試劑和質控物時要注意其反應的通用性與適用性。 TG測定的結果受取樣時個體生物學變異（CVb）和分析不精密度（CVa）的影響[3]。一般情況下，CVa相對較小（約為3%），而CVb占總變異的90%多[6]。即使嚴格按美國膽固醇教育計劃（NCEP）要求控制的個體，在2周內2次所測的TG結果差異百分比約為膽固醇的5倍，75%以上的個體在兩周內的變異大於10%。李健齋等[9]研究發現，中國人群血清TG個體間變異為28%，居所有血脂項目之首。國外資料表明，空腹2.5月的人群TG變異約25%，非空腹狀態的變異更大，日間約為6.3%～65%，月內為12.9%～34.8%，一年為12.9% ～39.9%，以上數據均為正常個體穩定飲食狀態的結果，某些病理狀態下的波動會更大。
為減少上述變異對TG測定的影響，NCEP建議受試者在兩月內分次測定，兩次間至少間隔一周，測定結果取均值。但當血脂水平遠離醫學決定水平時，則無需多次取樣。標本採集要求受檢者在前三周內不改變飲食習慣，采血前至少12h不進食，72h不飲酒。抽血後應盡快檢測，某些含有高活性LPL的標本，如用肝素治療的病人標本，TG常會過度水解。標本最好放在冰浴中，2h內分離血清。室溫放置1天TG下降達34%。Eberly等研究發現非空腹高TG血症的發生明顯多於空腹，而兩種狀態高TG血症所致冠心病的危險基本相同，因此測非空腹TG更有利於冠心病危險預測。
臨床上常見到肉眼脂血標本，這常與一些潛在的錯誤有關。其中之一是LPL水解TG時產生的「清除效應」。在用血清而非試劑作空白時，大顆粒TRL散射引起假性高基線吸收。隨著反應的進行，TG被水解，脂蛋白顆粒變小，濁度也減小，總的效應是在吸光度上升（產生NADH）的反應中，結果輕微偏低。這種誤差所佔比率較小，且只發生於高濃度TG標本中，其誤差通常是可接受的。另外，肉眼脂血標本特別是CM含量過高者，由於CM漂到樣品杯上層使標本成為多相。因此對於肉眼脂血標本，應充分混勻且盡快檢測。TG水解產生大量脂肪酸，特別是脂血標本，由於其濁度和產物的抑製作用，對分析也有影響。在反應的緩沖液中加入牛血清白蛋白或α-環式糊精可以避免上述情況。 美國的TG測定的參考系統較為完善，其推薦的決定性方法是由美國國家標准與技術研究所（NIST）建立的ID/GC/MS法，以13C3甘油三軟脂酸酯為內標，可測總甘油酯和「凈」TG，一級參考物質為NIST的SRM1595（三軟脂酸甘油酯）；參考方法為CDC的二氯甲烷-硅酸-變色酸法，一直被用作美國CDC-NHLBI血脂標准化計劃中的參考方法，該法用Supelco的三油酸酯和NIST的三軟脂酸甘油酯標准物質SRM 1595的2：1混合物作標准，測定值不僅是TG，還包括（或部分包括）甘油二酯和甘油一酯。二級參考物質有NIST的SRM1951a、CAP RM026及CDC的多種冰凍血清。此法此參考方法步驟繁瑣，實驗室間進行方法學轉移比較困難，CDC擬對其進行改進，以期在膽固醇參考方法實驗室網路（CRMLN）建立一個結合提取、水解步驟的酶法作為「指定參考方法」。
國內陳文祥等建立了高效液相色譜（HPLC）測定總甘油和游離甘油的方法，測定總甘油酯的相對不精密度小於2%，游離甘油小於4%，總甘油平均回收率100.0%，游離甘油99.7%，與ID/GC/MS法相對偏差不大於±2%。此法擬推薦為中國TG測定的參考方法。
血脂測定標准化並非要求統一測定方法，而是要求實驗室測定結果達到所制定的技術目標。對於TG測定，國內外要求不精密度（用CV表示）應不大於5%，不準確度（用偏差表示）應不大於±5%，總誤差應不大於15%。總誤差=偏差%+1.96CV（與參考血清的靶值比較）。特別值得一提的是衛生部北京老年醫學研究所血脂實驗室已於2002年3月被接納CDC的CRMLN成員（全球共12家），在血脂測定的標准化方面積累了豐富的經驗，中國TG測定的參考系統正在建立之中。