1. 生物有效性的評價方法
1.生物監測
評價生物有效性的最直接方法是採用生物富集實驗或毒性測試。生物富集作用受生物體代謝過程、食物構成、生物體型和毒性脅迫等因素的影響。雖然利用脂肪歸一化可在一定程度上減小這些影響,但無法消除污染物在生物體內分布的特異性和不同物種的吸收特異性。用靶位點濃度 (即能與靶位點相互作用並最終產生毒理學響應的污染物量)來評價生物有效性,能排除由毒代動力學所導致的影響,但靶位點濃度通常很難測定。通常,對於非特異性作用基本毒物 (Nonspecific Acting Baseline Toxicants,即能在各種生物體內產生毒理學效應的污染物)可以用臨界機體殘留濃度 (Critical Body Resies,CBRs)作為靶作用位點濃度的最近似估計。
CBRs法測定的是以致死或半數致死效應為評價終點時生物體靶標內的目標化學物濃度,因而能將有機化合物的毒性和生物富集作用結合在一起。在效應評價方法中,死亡率對於反映野外暴露中污染物生物有效性存在一定局限性。事實上,土壤、沉積物和天然水體中的污染物濃度通常在痕量或超痕量級,因而很少能對微生物或大型生物,尤其是脊椎動物,引發致死風險。此外,生物活體暴露實驗周期長,成本高,而且重復性差,樣品處理步驟繁瑣,給利用死亡率評價生物有效性的應用帶來了許多限制。除了活體生物標志物之外,離體生物標志物方法也得到了越來越廣泛的應用。離體測試方法相對於生物活體測試方法成本較低,可進行大量樣品的測定,還能為深入了解復雜混合物的總體效應和毒性作用機理提供幫助。
利用生物標志物 (如暴露標志物)方法比較有效,為環境中污染物的生物有效性提供更准確的估計。如對虹鱒幼魚利用加標沉積物進行暴露的活體實驗中,探究了接觸時間對魚肝CYP1A活性誘導程度的降低,以此評價PAHs的生物有效性。使用小鼠尿液中的代謝水平和肺中化合物DNA 加合物水平作為生物標志物,評價了攝食土壤PAHs的系統生物有效性。
2.化學模型方法
為了從污染物總濃度中獲得可被生物利用的部分,研究者結合了污染物的物理化學性質和生態系統的參數,將模型計算方法應用於生物有效性的評價中。利用有機污染物的平衡分配理論 (有機碳歸一化平衡常數,Koc )可以模擬得到土壤和沉積物中有機污染物進入生物體的潛勢。Koc和生物濃縮因子 (BCF)之間存在正相關關系,其數值可以通過實驗室或野外試驗測定,也常常通過辛醇-水分配系數 (Kow )估測得到。該方法已被用於從土壤或沉積物總濃度中估測生物體殘留濃度或從間隙水濃度測定生物體動態濃度。
目前,已經有多種模型可以應用於預測生物效應和毒性終點,如 QSAR (Quantitative Structure Active Relationship)模型、QSPR (Quantitative Structure Property Relationship )模型和MMM (Multimedia Mathematical Model)模型。QSAR 模型可以將有機化合物的結構特徵和測量所得的理化性質與生物評價終點如 BCF 及毒性聯系起來。QSPR模型是在 QSAR模型基礎之上發展的一個子模型,它根據有機化合物的結構來預測其理化性質、分配行為、歸趨和在生物體內的富集趨勢,可以用於校驗化合物實測理化參數值中的錯誤,提高了 QSAR 模型中所用數據的質量,還有一些 QSPR 模型可用於估算生物在受化合物暴露時的可能途徑。MMM模型則提供了一種整體研究手段,能夠用於同時估測污染物在多個環境介質中的遷移、分布、歸趨、生物濃縮和生物富集過程。
3.化學分析方法
用化學分析方法來評價有機污染物的生物有效性方法較多,如 Hatzinger 和 Alexander提出用溫和的有機溶劑作為萃取劑來反映土壤中生物對有機污染物的生物有效性;Hawthorne用超臨界流體萃取和加速溶劑提取儀作為工具來評價污染土壤中多環芳烴的生物有效性。在化學評價手段的發展中,一個重要的發現是污染物的自由溶解態濃度是生物有效性的主要部分。通過比較劑量效應關系,已經證明了自由溶解態濃度對於生物測試准確程度的重要性。同時還發現,污染物的自由溶解態濃度與以名義濃度表述的毒性終點濃度具有很好的一致性。因此,近年來,發展了多種采樣技術用於選擇性地測定自由溶解態化合物。相比於主動式采樣技術,被動式采樣技術的富集原理更接近污染物在生物有機體內的富集方式。被動式采樣裝置對污染物的獲取或濃縮過程完全基於化合物從化學勢或逸度高處 (即外界環境基質)向化學勢或逸度低處 (即采樣介質或吸附劑)的自動擴散。但應用被動式采樣裝置中目標化合物濃度來推斷外界暴露介質中的濃度需要滿足 3 個條件:①污染物在采樣器中的濃度與其在周圍暴露介質中的濃度成比例,而且化合物進入采樣器中的交換速率與擴散常數應與其外界濃度無關;②必須要具有能滿足現場監測所需的參數校準數據 (即采樣速率常數和分配速率常數);③不破壞化合物在各相中的原有平衡,一般要求所提取的目標化合物的量小於該化合物在體系中總量的 10%。
目前,應用較廣泛的被動式采樣裝置包括三油酸甘油酯半滲透膜被動式采樣器(SPMD)、固相微萃取技術 (SPME)以及液相微萃取技術 (LPME )。SPME 作為一種平衡采樣器,被廣泛用於模擬水體和土壤環境中的無脊椎動物的富集行為,並以此預測環境介質中有機污染物的生物有效性。通過 SPME 能測定化學物質在孔隙水中真實的自由溶解態濃度和內暴露濃度。而LPME 結合了液液萃取和 SPME 的優點,可以靈活地選擇萃取溶劑從而實現對極性有機污染物的萃取。
另一種新型被動式采樣裝置為三油酸甘油酯-醋酸纖維素復合膜 (TECAM ),采樣原理則與SPMD 類似,即目標分析物從周圍環境介質中通過擴散滲透作用透過外層膜,累積在脂相中直至達到分配平衡。但TECAM 的構造與 SPMD不同,三油酸甘油酯以脂滴的形式嵌於醋酸纖維素聚合物構造中,並與之緊密結合。這種鑲嵌結構與 SPMD 的簡單層疊結構相比,彼此結合更緊密,接觸面積更大。TECAM的制備過程簡單,而且提取目標化合物的前處理過程也比較簡單,一般不需凈化步驟,因此,有很好的應用前景。被動式采樣技術與預測污染物富集勢和基線毒性的傳統方法相比,具有很多優點。
關於污染物對生物內在毒性或生物體內濃度的數據,仍然很難對復合污染物的生物有效性和它們之間的協同或拮抗關系有一個准確的認識。由於這一原因,為了確定毒性終點和自由溶解態濃度間的關系,生物測試數據就必不可少。雖然化學方法不能完全替代生物方法,但由於化學方法操作簡單,結果重現性好,最重要的是比較容易進行標准化,便於建立相應嚴格的標准化實驗方法和提出科學評價體系,使各個實驗室得到的結果之間可以進行相互比較,而這正是環境中污染物生物有效性研究所急需解決的問題,所以用化學方法來模擬生物富集進行污染物生物有效性評價的研究具有廣闊的發展潛力。表8-9 列出了不同研究機構對人體攝入的POPs的危害等級以及可能產生危害的攝入量限制標准。
表8-9 特定 POPs 的風險與健康評價
注:ADI 每天可攝入量;JMPR殺蟲劑殘留聯合會議;WHO 世界衛生組織;IARC 國際癌症研究機構。
2. 分析方法確認指導原則
分析方法確認指導原則
分析方法確認（ analytical method verification ）是指首次使用法定分析方法時， 由現有的分析人員對分析方法中關鍵的驗證指標進行有選擇性的考察，以證明方 法對所分析樣品的適用性，同時證明分析人員有能力使用該法定分析方法。《分 析方法驗證指導原則》中提供了建立分析方法需要驗證的指標，分析方法的確認 並不是重復驗證過程。本指導原則不涉及微生物分析方法的確認。
一、確認過程（verification process）
分析方法的確認過程，是指應用法定方法對葯物及其制劑進行測定時，評 價該方法能否達到預期的分析目的。
分析人員應具備一定的葯物分析經驗和知識，經培訓後能夠理解和執行法 定方法。分析方法確認應當由上述分析人員開展，以確保法定方法能夠按預期 順利實施。
如果法定方法確認失敗，並且相關工作人員（或起草人員）未能協助解決 失敗的問題，也可能是該方法不適用於在該實驗室測定待分析的樣品。
二、確認要求（verification requirements ）
1.確認原則
分析方法確認無需對法定方法進行完整的再驗證，但是需要將《分析方法驗 證指導原則》表 1 中列出的分析方法驗證的指標用於方法的確認。分析方法確認 的范圍和需驗證的指標取決於實驗人員的培訓和經驗水平、分析方法種類、相關 設備或儀器、具體的操作步驟和分析對象等。分析方法確認需驗證的指標和檢驗 項目(鑒別、雜質分析、含量測定等)有關，不同的檢驗項目，方法確認所需驗證 的指標也不同。
2.考察指標
分析方法確認應包含對影響方法的必要因素的評估。對於化學葯，方法確認 應考慮原料葯的合成路線和制劑的生產工藝等因素；對於中葯，方法確認應考慮 中葯材種類、來源、飲片製法和制劑的生產工藝等因素，從而評價法定方法是否 適用於原料葯和制劑基質。
在原料葯和制劑含量測定時，方法專屬性是確認法定分析方法是否適用的關鍵驗證指標
3. 如何對一種分析方法做驗證試驗
任何一種分析測定方法，根據其使用的對象和要求，都應有相應的效能指標。一般，常用的分析效能評價指標包括：精密度、准確度、檢測限、定量限、選擇性、線性與范圍、重現性、耐用性等；對於生物樣品中葯物分析方法評價的標准與上述的評價指標相比較，有共同之點也有特殊的要求。測定方法的效能指標可以作為對分析測定方法的評價尺度，也可以作為建立新的測定方法的實驗研究依據。准確度（Accuracy）是指測得結果與真實值接近的程度，表示分析方法測量的正確性。由於逗其實值地無法准確知道，因此，通常採用回收率試驗來裴示