aoac法定分析方法好嗎

1. 軟骨藻酸的檢測方法

該法是根據美國公職化學家協會（AOAC）所標定的麻痹性貝中毒（PSP）的小鼠生物分析法加以變化的，是最早用於DA檢測的一種經典方法。其原理是將毒素注射入小白鼠體內，根據注射後小鼠的存活時間和中毒症狀來評價毒性，一般用半致死劑量表示。1987 年該方法首次應用於加拿大DA 中毒事件中DA 的測定，結果顯示該方法適於檢測貝類組織中高濃度的DA（高於30μg/g），DA 濃度較低時無法檢測（低於20μg/g）。
該法更加註重研究DA的毒性效應和毒理研究。這是一般其他方法無法取代的，而且採用小白鼠生物檢測法可以檢測一些未知的毒性物質，通過半數致死劑量來評價該物質的毒性效應，因此小白鼠生物檢測法在各個國家仍有很廣泛的應用。但是，該方法的檢出限較高，適用於檢測貝類組織中高濃度的DA（300-1000μg/g），不適用於DA含量低於20μg/g組織的檢測。
小白鼠生物檢測法方法檢測周期大於24h，特異性較差，干擾因素較多，樣品處理為粗略提取，樣品批次單一。小白鼠生物檢測法檢測DA是最早使用的一種方法，但是其試驗結果受外部影響因素較為復雜，試驗結果與小白鼠的品系和試驗者本身操作有很大關系，並且小白鼠生物檢測法一般要有至少1d的檢測周期，該方法的檢出限較低。此外，小白鼠生物法僅能測定毒性的大小，無法確定毒素的組成和各成分的含量。小白鼠生物檢測法最大的局限性是小鼠本身造成結果的高變異性和低敏感性，而且對鼠種的要求較高。 高效液相色譜法（HPLC）是檢測DA應用最廣的方法，已被多國列為國家標准方法，中國國家標准中規定使用反相高效液相色譜法檢測海產雙殼類貝肉、貝柱、外套膜及其製品（不包括鹽漬製品）中的DA含量，該方法檢測限為1μg。生物分析法注重的是樣品毒性的分析，其專一性和靈敏度低，而高效液相色譜法則能靈敏、快速、准確地確定各種毒素成分，被廣泛用於研究和確認實驗。HPLC檢測DA是利用其在242nm處具有最大吸收值的特徵使用紫外或二極體檢測器進行檢測，或者將DA衍生後通過熒光檢測器進行分析，或使用質譜進行檢測。高效液相色譜的檢測器有紫外檢測器、熒光檢測器和質譜檢測器，由於貝類提取液中干擾組分復雜，光度檢測往往不能提供化合物的充分結構信息，因此會引起假陽性的結果。高效液相色譜法檢出限低，方法成熟，但儀器昂貴、笨重，一次只能測定一個樣品，不適合快速現場檢測。對設備條件要求較高，也不能大量用於基層的日常監測工作。
軟骨藻酸HPLC曲線參考文獻。
DA-HPLC檢測DA的方法主要有兩大類，一種方法是貝類樣品被提取後，經濃縮純化後進行HPLC配紫外檢測器（HPLC-UVD）分析。由於DA在242nm的紫外光譜區有最大吸收峰，因此反相高效液相色譜（RP-HPLC）-UV可有效而快速地對樣品進行分離和檢測，其基本原理是使用酸性流動相以抑制羧基的電離作用，並選用C18鍵合硅膠柱分離DA及其衍生物。HPLC-UVD法特別適用於分析貝類組織內的DA含量，其檢測限在10-80ng/ml之間，且依提取和提純方法的不同而異，如粗提取物未經提純，其檢測限約為1μg/g，適用於毒素含量超過20μg/g的檢測。水中DA的檢測與樣品量及藻類的含量和種類等因素有關。另一種方法是針對海水和硅藻中DA進行的甲氧基芴甲酸（9-fluorenylmethyloxycarbonyl，FMOC）衍生化/HPLC配熒光檢測器（HPLC-FLD）法，該法在DA分子上引進了熒光基團而使FLD檢測的靈敏度提高，對海水中DA的檢測限為1.5pg/ml。Hummert等提出了柱切換系統，它能有效降低提取物中的干擾，直接分析粗提的樣品，省去了復雜的樣品預處理過程。流動相的配比影響DA的保留時間，隨著流動相中乙腈比例的減小，DA保留時間增加，DA色譜峰對稱性增強，DA與DAC′5非對映異構體分離度增大。中國報道用RP-HPLC-UVD測定貝類中DA，經甲醇:水（1：1）溶液提取，強陰離子（stronganion exchange，SAX）固相萃取柱凈化，C18反相色譜柱分離，流動相為乙腈:水（13：87），242nm波長下檢測，最低檢出限為0.2μg/g，在1.0-25.0μg/ml范圍內有良好的線性關系，平均回收率為（97.23±2.43）%。流動相採用甲醇:水（22：78，pH2），最低檢出限為10ng（1.0μg/ml），檢測范圍50-250ng（5-25μg/ml），DA的回收率可達（99.9±2.4）%。另有報道流動相為甲醇:乙腈:三氟乙酸（80：20：0.1），最低檢出限為10ng（1.0μg/ml），在1-40μg/ml范圍內線性關系良好。
高效液相色譜-紫外檢測法（HPLC-UV）特別適用於貝類組織中DA含量的測定，尤其適用於毒素含量超過20μg/g的情況。Lawrence等人建立[以及Quilliam等改進的HPLC-UV法採用了反相C18柱在242nm處檢測DA，該方法已被英國、愛爾蘭等國定為標准方法。後來，又有一些研究人員對此方法進行了改進。López-Rivera等建立了一種不需要固相萃取預處理檢測DA的HPLC-UV法，通過等梯度淋洗以及控制流動相pH來分離化合物，結果表明，最佳pH為2.5，方法檢測限為25ng/mL。該方法快速、靈敏，能成功檢測大批量貝類樣品。HPLC-UV法已經被很多研究人員用來檢測貝類等動物組織中的DA含量。Costa等用HPLC-UV法檢測了葡萄牙海岸的兩種章魚E.cirrhosa和E.moschata體內DA的含量，結果表明，DA含量超過了100μg/g，其中，E.moschata體內毒素含量更高，表明DA可能通過食物鏈由這種章魚體內進入更高級消費者如人類體內，潛在危險性更大。中國對DA的檢測大多採用HPLC-UV法，張一兵等在借鑒國外方法的基礎上應用高效液相色譜-紫外可見檢測法（HPLC-UVD）進一步優化了DA的高效液相色譜-紫外檢測法，選定pH2的甲醇/水=22∶78（V/V）為流動相，LC-SAX作為濃縮純化柱，檢出限為10ng，回收率達到92%-94%。陳西平等採用該方法檢測了部分水及水生動物中DA的含量，回收率達到70%-93%，檢出限為10ng。結果表明，雖然在海水及地面淡水中未檢出DA，但部分海洋貝殼動物體內有檢出。因此，隨著海洋污染的加劇，現階段中國的DA污染問題不容忽視，應加強對其污染狀況的監測。
高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）聯用技術可以不使用衍生試劑和毒素標准品，相比其他檢測器，具有很大的優勢。然而本方法對設備條件要求較高。Lawrence等建立的高效液相色譜-電噴霧離子阱質譜法（HPLC/ESI-MS）法是一種高靈敏度、高選擇性的方法，被應用到了環境中各種介質的檢測中，並被後人不斷改進，但是這種方法對樣品預處理的要求較高。宋琍琍等參考了這種方法來測定DA殘留。樣品經50%甲醇提取，LC-SAX 柱凈化，然後選用電噴霧離子源進行測定分析，該方法的定量限為0.02μg/g。Pardo等採用加壓濕法萃取（PLE）來提取DA，然後用液相色譜-電噴霧電離雙質譜（HPLC-ESI-MS-MS）法來檢測DA，電離源採用電噴霧可以提高分析信號，方法經過優化後回收率在81%至95%之間，他們用此方法成功檢測了46個西班牙超市裡的貝類樣品，表明該方法能進行大批量檢測。Wang 等採用LC-MS 對水樣和浮游植物中的DA 進行了定性和定量分析，樣品預處理採用C18柱進行固相萃取，結果表明，酸性條件有利於在C18 柱上保留親水性的DA，加標水樣的回收率超過了90%，浮游植物樣品的回收率則接近98%，方法檢測限為0.03ng/mL。Iglesia等也採用LC-MS法檢測了海水中的DA及它的異構體，但樣品預處理採用的是固相萃取盤，該方法的檢測限為0.02ng/mL，回收率為92.1%-110.6%，用此方法能檢測海水中的痕量DA。Vale等利用HPLC-MS的方法，以1+1的甲醇溶液作為洗脫液，對葡萄牙魚類和貝類體內的軟骨藻酸含量進行測定，結果表明在春季樣品中DA含量最高；在分析的眾多樣品中，蛤仔和鳥蛤被軟骨藻酸污染最為嚴重，紫貽貝和牡蠣等物種受污染較輕。陳燕青等利用HPLC-MS法測定蝦夷扇貝和長牡蠣中軟骨藻酸的殘留，樣品經濃度50%甲醇提取，LC-SAX柱凈化，3ml0.1mol/L甲酸溶液洗脫，電噴霧離子源（ESI），在正離子、多反應監測方式（MRM）模式下進行定性與定量，該方法的檢出限達0.01μg/g，線性范圍為0.02-10.00μg/g。
高效液相色譜-熒光檢測法是使用衍生劑將DA衍生成含熒光基團的物質，用熒光檢測器進行檢測，在DA分子上引入熒光基團可使方法的靈敏度提高。檢出限可達到pg/ml。Maroulisb等利用柱後衍生法測定DA，加入4-氯-7-硝基-2，1，3-苯並氧雜惡二唑（NBD-Cl）與DA上的氨基反應生成熒光基團，提高了熒光檢測檢測器（FLD）的靈敏度，熒光檢測器激發波長設為469和529nm，檢出限低至25μg/kg。James等使用NBD-F來衍生化DA，用等梯度淋洗程序分離化合物，激發波長為470nm，發射波長為530nm，方法檢測限高於1ng/mL，貝類組織中DA的回收率>95%，當用強陰離子交換SPE柱萃取DA時，檢測限達到6ngDA/g貝類組織。Chan等參考了這種方法來檢測DA，但他們改進了樣品預處理方法，即在SPE柱中加入TiO2，可以更好地吸附DA，並探討了最佳pH，結果表明，吸附的最佳pH為4，解吸時pH則為11，吸附平衡時間為2小時，最佳吸附劑裝載量為0.67mgTiO2/ngDA。Maroulis等採用NBD-Cl柱後衍生DA進行檢測，成功測得了貝類組織中DA含量為75μg/kg的樣品，該方法檢測限低至25ppb，能實現全自動化分析，對樣品預處理要求低，干擾少。由於大多數衍生試劑價格昂貴、不穩定，且其分解產物可能出現在色譜圖中，同時衍生試劑的變質也可能導致毒素的不完全衍生化，因此熒光檢測法的實際應用很少。 免疫分析法（ELISA）是基於抗體與抗原或半抗原之間的高選擇性反應而建立起來的一種生物化學分析法，即根據抗原-抗體反應，採用特異性貝類毒素的抗體來檢測DA。免疫分析法主要包括酶聯免疫法、放射性免疫法、熒光免疫法等，具有方便、快速的特點，但缺點是費用較高，而且各毒素之間的交叉反應低，不能全面體現出樣品的毒性。檢測DA所採用的免疫分析方法主要是酶聯免疫吸附法（ELISA）。ELISA是利用抗原-抗體反應的特異性與酶催化作用的高效性相結合，通過酶作用於底物後的顯色反應判定結果，是應用最廣泛的免疫學檢測技術，由於其實驗結果可用目測，也可用酶標儀測定光密度值以反映抗原含量，所以有易定性定量的雙重優點。Engvall和Perlmann於1971年最先應用該法進行IgG定量測定，並命名為Enzyme linked immunosor-bentassay（ELISA）。由於ELISA方法靈敏，特異性強不需要特殊設備，被廣泛應用於各種抗原和抗體測定。將ELISA應用於DA的檢測中，利用原-抗體反應，採用特異性貝類毒素的抗體來檢測DA。
Yu等採用匙孔血藍蛋白（KLH）和小牛血清蛋白（BSA）為載體，進行直接酶聯免疫測定，結果表明，藍貽貝樣品的檢測限<25ng/g，回收率為81.1%，Yu等還將實驗結果用HPLC方法進行了驗證，最終發現15種被污染的貝類樣品中有10種樣品的DA含量<50ng/g。Maucher等結合ELISA技術使用血液採集卡來提取小鼠血液中的DA，這種方法可以避免DA在血液中被清除。一般說來，在4小時內，99%的DA會從血液中被清除，但使用該方法後，DA在24小時內仍然能被檢測到。該方法靈敏度高，用血液採集卡提取樣品方便，因此可用此方法來監測海洋哺乳動物體內的DA含量。Tsao等採用單克隆抗體ELISA檢測法檢測DA，並建立了基於單克隆抗體的膠體金免疫條檢測法，免疫條檢測法的檢測限為5ng/mL，在十分鍾內就可完成檢測。Tsao等的實驗結果表明，用免疫條檢測得到的結果與用ELISA方法得到的結果有很好的吻合性，可以用來快速檢測貝類樣品中的DA。另外，Shaw等建立了基於基因工程單鏈抗體（scFv）競爭ELISA檢測方法，相比傳統方法，這種方法具有很多優勢，基因工程單鏈抗體（scFv）可以在大腸桿菌中快速、大量地得到表達，且容易和其他小分子融合，形成融合蛋白以用於檢測或其它用途。用該方法檢測天然扇貝組織得到的數據與標准HPLC方法檢測的結果基本相符。大多數ELISA法採用的都是直接法，而許道艷等則以DA-OVA為包被抗原，利用抗原抗體反應，建立了間接競爭酶聯免疫吸附技術分析檢測海水樣品和海洋貝類中DA的方法。結果表明，該方法最低檢出限為10μg/L，海水樣品平均回收率為102.2%，貝類樣品平均回收率為111.5%。ELISA方法能夠進行批量檢測，但特異性較差，因而主要用於DA的初步篩選。由於DA標准品昂貴，且DA分子量太小，因此制備免疫抗原較困難，從而限制了免疫方法在DA分析中的應用。 液質聯用（LC-MS/MS）技術幾乎可以分析所有的貝毒。液質聯用依賴於高效液相色譜把貝毒成分通過離子化帶到質譜中。電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI），這兩種技術都已經應用於貝毒分析。由於食品（動物組織）的背景非常復雜，樣品間差異又相當大，採用LC-MS（MS/MS）技術測定食品中貝類毒素的關鍵是樣品的前處理。國外文獻方法多採用甲醇-水溶液提取，然後固相萃取法進行凈化與濃縮，最常用的固相萃取柱有Cl8烷基鍵合硅膠柱，CN柱和離子交換柱，最常用的是陰離子交換柱，非鍵合硅膠柱也有很好的純化和萃取效果。此外還有溶劑提取方法、液相色譜制備法和超臨界流體萃取法等。食品（水產品）中的貝類毒素殘留量甚微，一般為μg/kg水平。2005年方曉明等利用液相色譜四極桿-飛行時間質譜（LC/Q-TOFMS）聯用技術對貝類樣品的失憶性貝毒進行了研究。樣品經甲醇/水（體積比為1：1）提取，經SAX固相萃取柱凈化後，用Zorbax Eclipse XDB-18柱（250mm×2.1mm，3.5μm）色譜分離，以乙腈/水含0.05%甲酸水溶液作流動相，梯度淋洗，流速為0.20mL/min。Q-TOFMS選擇電噴霧正離子模式，以[M+H]+作為前體離子進行TOFMS掃描。結果表明：樣品加標的平均回收率為87.8%-94.6%，相對標准偏差為8.4%-11.9%，檢測低限（LOQ）為0.1μg/g。由於Q-TOFMS具有高解析度，能進行精確測定而不降低靈敏度，因此本方法作為對貝類樣品中失憶性貝毒的確證分析方法具有高靈敏度和選擇性。2003年HollandPT等用LC-MS/MS的方法測定了貝類中軟骨藻酸和其異構體的含量，以甲醇/水（體積比為1：1）作為提取劑，以乙腈/水（體積比為1：1）作為稀釋劑，經SPE固相萃取後，用C18柱色譜分離。選用了4種不同的貝類，當軟骨藻酸在樣品中的含量為1μg/g貝-2μg/g貝時，軟骨藻酸的回收率為93%（RSD大於7%）。2007年PardoO等用甲醇/乙腈（體積比為9：1）作為提取劑，經PLE萃取後，通過電噴霧電離（ESI）界面與質譜聯用（ESI-MS-MS）分析測定軟骨藻酸。使軟骨藻酸在0.05-5μg/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數r=0.999；當方法檢出限為0.2μg/g，回收率為81%；當方法檢出限為0.5μg/g，回收率為95%。此方法成功應用於46個貝類樣品的檢測中。2007年WangZH採用離子碎片的方式，使用多反應器，以甲醇/水（體積比為1：1）作為提取劑，以乙腈/水（體積比為1：1）作為稀釋劑，用4mL0.15%甲酸洗脫，經SPE固相萃取後，用C18柱色譜分離，當檢測濃度為30pg/mL，使得回收率從90%提高到98%，建立了一種定量和定性的方法。

2. 微生物分析法特點是什麼

微生物分析法特點
1.准確度高 近50年來，微生物法被廣泛地納入各類標准方法中，如AOAC，AACC，GB以及其他國家的標准方法。以AOAC為例，每種微生物方法的建立，都需要經過全球20家以上的實驗室進行方法驗證，因此微生物法准確性是被廣泛公認的。
2.先期投入少，見效快 該方法的先期投入少，當實驗室具備超凈台、培養箱、分光光度計、醫用滅菌器和一些實驗室常用玻璃器皿即可開展微生物法，不需要大量額外的人力和物力，適於在任何水平的實驗室快速建立。
3.微生物法的測定結果反映了樣品中具有生物活性的被測物含量。 由於微生物法是通過觀察微生物的生長繁殖速度來間接測定維生素的含量，並且微生物本身就是一種生物體，所以採用微生物法測定出的維生素均是能夠被生物體所利用的。例如，在測定螺旋藻中的維生素B12時，微生物法的測定結果遠小於其它方法的測定結果，Herbert 等人的研究證明，雖然螺旋藻含有豐富的維生素B12，但不具有生物活性，在人體內不能發揮其應有的生理作用。 可見，微生物法的測定結果反映了具有生物活性的維生素含量。
通常來說，當實驗室目前尚沒有準確可靠的其他方法，如維生素B12、葉酸、生物素、泛酸等；或者為了大量降低分析實驗的費用；或者為了快速建立分析方法，獲得數據；或者為了最大限度的利用實驗室有限的空間。

存在問題
雖然微生物具有以上優勢，但它仍舊逐漸被其他方法所取代，這是由於它固有的一些致命的缺點，主要包括以下幾點：
1.分析周期長 一般在4-6天，而其它方法（HPLC法）一般在1-2天內即可完成。
2.實驗步驟煩瑣 通常來說，微生物法要包括樣品前處理、菌種液的制備、測試管的制備、接種、測定、計算等步驟，與儀器分析方法相比，步驟繁多。
以上兩點與目前分析方法簡便、快速、高效的發展方向不符，這也正是微生物逐漸被其他方法替代的主要原因。

3. 貝類毒素的檢驗方法

1 小鼠生物檢測法
小鼠檢測法是應用最多的貝類毒素檢測方法，可用於所有貝類毒素的檢測。該方法的優點是技術容易掌握，不需要使用專門儀器。小鼠生物檢驗法是將貝類毒素的提取物進行適當的稀釋後，對小白鼠進行腹腔注射，並計算平均致死時間。根據Sommer表，查出相應的MU(給小白鼠腹腔注射毒素的系列稀釋液，然後計算每隻20g小白鼠的劑量作為1個死亡時間，以15min內殺死1隻鼠單位<Mouse unit，MU>來表示毒性的大小，換算成MU/100g貝肉)。
小鼠生物測定法已被AOAC(美國公職分析家協會)作為國際海產品貿易中貝類麻痹性毒素的測定方法。但該方法的缺點是由於小鼠的大小以及小鼠個體情況的不同，因此造成靈敏度不高，偏差較大。而且存在實驗小鼠用量大以及哺乳動物費用增加的缺陷。同時操作繁瑣，以及用該法測定高毒性貝類樣品時的變異性較高的缺陷[13]。因此需要一種新的測定方法來彌補小鼠檢測法的不足。
2 高效液相色譜法
採用高效液相色譜(HPLC)等化學檢測法測定貝類毒素發展很快。HPLC法主要應用於PSP， DSP和ASP的檢驗上[6]。與其它方法相比，HPLC法有著明顯的優越性：(1)靈敏度高，專一性強，檢出限低；(2)在酸性條件下不穩定的基團如氨甲醯基N)磺基在分析的過程中不會解離；(3)縮短了分析時間，通過自動注射技術，能處理更多的樣品，便於進行毒素監控；(4)能提供關於毒素的更多信息，能測出每1個組分的具體含量及毒性的大小，從而有助於比較或了解毒素種類的差異。
HPLC法是唯一能定性、定量檢測出各種毒素組分的技術，HPLC法發展非常迅速並極有可能代替小鼠檢測法成為主要的檢測方法。該法也存在一些如測定時需要昂貴的儀器、專業知識和費時等缺點。
3 免疫學測定方法
免疫學測定方法以抗原一抗體特異性反應為基礎，其中包括凝集反應、沉澱反應、補體反應等。可用於PSP，DSP和NSP的檢測，其原理是將兔子等實驗動物暴露在毒素中，以功能性抗原刺激兔子產生抗體，然後從兔子的血清中提取抗體。抗體可用放射性或熒光物質標記。提取的貝類毒素或勻漿後的貝類組織(如貽貝)暴露於標記物中，然後檢測抗血清一抗原混合物中放射性或熒光強度以測定樣品中的毒素的含量。
4 細胞檢驗法
細胞檢測法是建立在貝類毒素對生物細胞影響的基礎上。許多實驗已證明麻痹性貝類毒素的致病機理是通過對細胞鈉通道的阻斷，造成神經系統傳輸障礙而產生麻痹作用。
其實驗原理如下：當加入烏本苷這種物質時，可增加鈉的流入，此時小鼠的成神經細胞瘤擴張並最後溶解暴露在藜蘆丁中。但在麻痹性貝類毒素存在時，這兩種物質的作用可得到抑制，麻痹性貝類毒素通過對細胞鈉通道的阻斷，可使細胞形態保持完整。與麻痹性類毒素不同，腹瀉性貝類毒素的細胞檢驗法是建立在肝細胞形態的變化基礎上的。
5 其它檢測方法
其它檢測方法包括分光光度法，電泳法(最常用的是毛細管電泳，主要用於分離測定PSP毒素中的非衍生毒素)，薄層色譜法和氣相色譜法(用來檢驗軟海綿酸)等化學檢驗法，此外，還包括家蠅生物檢驗法，蝗蟲生物檢驗法，神經細胞生物檢驗法(又稱組織培養分析法，可用於PSP，ASP和DSP的分析的新方法)等生物檢驗法。