① Nature子刊:手把手教你入手蛋白乙醯化修飾研究
蛋白翻譯後修飾作為生命科學領域長盛不衰的研究熱點,對理解生命活動的復雜性至關重要。其中,蛋白乙醯化修飾不僅在細胞核內參與調控基因轉錄,還廣泛出現在非組蛋白上,覆蓋代謝、免疫、細胞周期、DNA損傷修復、凋亡、自噬等生命過程,展現出其多維的生物學功能。
對於初涉蛋白乙醯化修飾研究的科研新手,如何快速入門?以一篇2019年發表在Nature Communications上的自噬領域研究論文為例,可以提供一個簡明的研究思路。
首先,確定目標蛋白是否存在乙醯化修飾。研究者通過使用去乙醯化酶抑制劑,如TSA和NAM,觀察內源及外源p62在細胞中的乙醯化水平,發現只有TSA處理能顯著提高,提示p62的去乙醯化過程由HDACs而非Sirtuins介導。
接著,探究乙醯化水平的調控機制。作者採用飢餓及蛋白酶體抑制劑等刺激處理,發現飢餓條件能夠顯著提高p62的乙醯化水平,說明蛋白的乙醯化受到特定條件的調控。
確定乙醯化轉移酶。在哺乳動物細胞中,p300、CBP、PCAF、GCN5和TIP60等乙醯化轉移酶在蛋白乙醯化修飾中扮演關鍵角色。通過細胞內篩選,發現TIP60的高表達能顯著提高p62的乙醯化水平。
隨後,研究去乙醯化酶。鑒於p62的去乙醯化過程被HDACs調控,作者通過細胞內篩選,發現HDAC6的高表達能顯著降低p62的乙醯化水平,表明HDAC6是p62的去乙醯化酶。體外實驗證實HDAC6可以直接去乙醯化p62。
確定乙醯化位點。通過質譜鑒定或體外乙醯化反應結合質譜鑒定,確定乙醯化位點。賴氨酸(K)是乙醯化的主要位置,通過構建突變體驗證乙醯化或去乙醯化狀態。
解析乙醯化對目標蛋白的影響。構建模擬乙醯化/去乙醯化突變體,研究乙醯化如何影響目標蛋白的功能,比如結合泛素的能力、形成二聚體的穩定性等。
探討乙醯化修飾的生物學功能。在細胞水平或動物模型中研究目標蛋白乙醯化的生物學效應,例如在自噬過程中p62與泛素化蛋白降解的關聯性及其對細胞活力的影響。
綜上所述,蛋白乙醯化修飾的研究框架包括確定存在性、調控機制、酶的識別、影響解析及生物學功能探究,為深入理解蛋白乙醯化在生命過程中的作用提供了路徑。