苯氨基乙氰含量分析方法

1. 氨基酸分析法的方法分類

本法系根據氨基酸與異硫氰酸苯酯（PITC）反應，生成有紫外響應的氨基酸衍生物苯氨基硫甲醯氨基酸（PTC-氨基酸），PTC-氨基酸經反相高效液相色譜分離後用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～1.25µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 0.1mol/L醋酸鈉溶液(取無水醋酸鈉8.2g，加水900ml溶解，用冰醋酸調pH至6.5，然後加水至1000 ml)-乙腈(93:7)。
（2）流動相B 乙腈－水（8：2）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為254nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 100 0 14 85 15 29 66 34 30 0 100 37 0 100 37.1 100 0 45 100 0 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液200μl，置一2ml塑料離心管中，精密加入1mol/L三乙胺乙腈溶液100μl，混勻，精密加入0.1mol/L異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混勻，室溫放置1小時，加0.8ml正己烷，劇烈振搖，放置10min，精密取下層溶液2μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液200μl，自「置一2ml塑料離心管中」起同法測定。 本法系根據氨基酸與6－氨基喹啉－N－羥基琥珀醯亞氨基氨基甲酸酯（AQC）反應，生成有紫外與熒光響應的不對稱尿素衍生物（AQC-氨基酸），AQC-氨基酸經反相高效液相色譜後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為2.5～200nmol/ml。
試劑 （1）流動相A 取醋酸銨10.8g或無水醋酸鈉11.5g，加水900ml溶解，用磷酸調pH至5.0，然後加水至1000 ml。
（2）流動相B 乙腈－水（3：2）。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 取硼酸12.36g，加水400ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至8.8，然後加水稀釋至500ml。
(4) AQC溶液 取AQC適量，加乙腈溶解並稀釋製成每1ml中含1mg的溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.4ml；柱溫為37℃；檢測波長為248nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 88 12 14 88 12 29 80 20 30 59 41 37 59 41 37.1 88 12 45 88 12 測定法 精密量取對照品溶液10μl，置一直徑為0.4cm、高度為5cm的小試管中，精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 8.8) 70μl，在渦旋混勻器上混勻，精密加入AQC溶液20μl，混勻，精密量取5μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液10μl，自「置一直徑為0.4cm」起同法測定。 本法系根據一級氨基酸，在巰基試劑存在下，首先與鄰苯二醛（OPA）反應，生成OPA-氨基酸；反應完畢後，加入9-芴甲基氯甲酸甲酯（FMOC），剩餘的二級氨基酸與FMOC繼續反應，生成FMOC-氨基酸，兩次反應生成的氨基酸衍生物經反相高效液相色譜分離後用紫外或熒光檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性濃度范圍為0.025～2.5µmol/ml。
試劑 （1）流動相A 稱取醋酸鈉7.5g，加水4000ml溶解，加三乙胺800μl，四氫呋喃24ml，混勻，用2%醋酸調pH至7.2。
（2）流動相B 稱取醋酸鈉10.88g，加水800ml溶解，用2%醋酸調pH至7.2，加乙腈1400ml，甲醇1800ml，混勻。
（3）0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 取硼酸24.73g，加水800ml溶解，用40%氫氧化鈉溶液調pH至10.4，然後加水稀釋至1000ml。
（4）OPA溶液 取 OPA 80mg，加0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.4) 7ml，加乙腈1ml， 3-巰基丙酸125μl ，混勻 。
（5）FMOC溶液 取FMOC 40mg , 加乙腈8ml溶解。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×150mm， 5μm）；柱溫為40℃；檢測波長為338nm（一級氨基酸），262nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度及流速如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min） 0.0 100 0 1.0 17.0 50 50 1.0 45.0 0 100 1.0 45.1 0 100 1.5 50.0 0 100 1.5 50.1 100 0 1.0 53 100 0 1.0 測定法 精密量取對照品溶液50μl，置一1.5ml塑料離心管中， 精密加入0. 4 mol/L 硼酸鹽緩沖液(pH 10.2) 250μl，混勻，精密加OPA衍生劑50μl，混勻，放置30秒，精密加入FMOC衍生劑50μl，混勻，精密量取4μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液50μl，自「置一1.5ml塑料離心管中」起同法測定。
附註：1、由於OPA-氨基酸不穩定，因此衍生後應立即進行分離測定。
2、本方法的衍生過程也可由自動進樣器完成。 本法系根據氨基酸與2,4-二硝基氟苯（DNFB）反應，生成有紫外響應的二硝基苯-氨基酸（DNP-氨基酸），DNP-氨基酸經反相高效液相色譜分離後採用紫外檢測，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為30～140 pmol。本法所用的2，4－二硝基氟苯屬易爆、劇毒物質，有強致癌性，且該法對色譜柱要求較高，易損壞色譜柱，衍生試劑水解生成的2，4-二硝基苯易干擾絲氨酸的測定。除另有規定外，一般不宜採用本法。
試劑 （1）流動相A） 0.05mol/L醋酸鈉溶液(取 4.1g無水醋酸鈉，加水800ml溶解，加二甲基甲醯胺10ml，用稀醋酸調pH至6.4，用水稀釋至1000 ml)。
（2）流動相B 流動相A-乙腈（1：1）。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6×250mm， 5μm）；流速為每分鍾1.0ml；柱溫為40℃；檢測波長為360nm。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下： 時間(min) 流動相A（%） 流動相B（%） 0 75 25 6 75 25 6.1 65 35 11 59 41 14 59 41 14.1 50 50 22 45 55 32 10 90 37 10 90 39 75 25 50 75 25 測定法 精密量取氨基酸對照品溶液2ml，置一50ml量瓶中，加0.5mol/L碳酸氫鈉溶液2ml，2，4-二硝基氟苯衍生化試劑（量取2，4－二硝基氟苯1ml ，用乙腈稀釋至100ml）1ml，混勻，在60℃水浴中反應 1小時，取20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液2ml，自「置一50ml量瓶中」起同法測定。 本法系根據氨基酸經陽離子交換色譜柱分離後，與茚三酮反應，一級氨基酸生成在570nm處具有最大吸收的紫色化合物，二級氨基酸（如脯氨酸）生成在440nm具有最大吸收的黃色化合物，分別在570nm和440nm下檢測上述反應產物，在一定的范圍內其吸光值與氨基酸濃度成正比。本方法的線性響應范圍為20～500 pmol。
試劑 （1）流動相A 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸1.5ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至3.0。
（2）流動相B 取無水檸檬酸鈉1.7g，鹽酸0.7ml，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至4.3。
（3）流動相C 取氯化鈉5g，無水檸檬酸鈉1.9g，苯酚0.1g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至6.0。
（4） 色譜柱再生溶液 取氫氧化鈉0.8g，加水溶解並稀釋至100ml，用鹽酸調pH至13。
（5）柱後衍生試劑 取茚三酮18g，茚氮蘭0.7g，加76.7%二甲基亞碸－0.7二水合醋酸鋰－0.1%醋酸溶液900ml使溶解，在氮氣下混合至少3小時。
（6）樣品緩沖液 2%無水檸檬酸鈉-1%鹽酸-0.5%硫代二乙醇－0.1%苯甲酸溶液。
對照品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
供試品溶液 按各品種項下規定的方法制備。
色譜條件與系統適用新試驗 用磺化苯乙烯－二乙烯苯共聚物為填充劑（4.0×120mm， 7.5μm）；流動相流速為每小時14.0ml；柱後衍生試劑得流速為每分鍾7ml，反應器溫度為135℃；檢測波長為440nm(一級氨基酸)，570nm（二級氨基酸）。各氨基酸峰間的分離度均應大於1.0。洗脫梯度如下：開始時用流動相A平衡色譜柱，在25分鍾流動相的組成變為100%流動相B，在37分鍾，流動相組成變為100%流動相C，在75min，最後一個氨基酸被洗脫後，用色譜柱再生溶液再生色譜柱1分鍾。柱溫程序如下：開始時柱溫48℃，11.5分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至65℃，約35分鍾後，以每分鍾3℃的速率升至77℃，最後在約52分鍾後，以每分鍾3℃的速率降至77℃。
測定法 精密量取氨基酸對照品溶液適量，注入氨基酸分析儀，記錄色譜圖；另精密量取供試品溶液適量，同法測定。
附註：不同品牌的氨基酸分析儀，應根據儀器的要求，對流動相、色譜柱再生溶液、衍生試劑、緩沖液和洗脫梯度作適當調整。

2. 氣相色譜法可以測定蔬菜水果中的什麼含量

氣相色譜法同時測定蔬菜及水果中多種農葯殘留量

【摘要】建立了蔬菜中乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、環氟菌胺、氟蟲腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威殘留量氣相色譜同時分析方法。採用分散固相萃取技術，在提取液中加入C18、石墨炭黑、PSA等吸附劑粉末進行凈化，根據檢測器選擇溶劑置換，採用DB1701毛細管柱分離，μECD檢測。13種農葯的濃度范圍在0.002～0.05mg/kg時，回收率在80%～100%之間、RSD為1%～6%。各農葯的檢出限為：氟蟲腈、環氟菌胺0.002mg/kg；苯氧菊酯、甲草胺、乙草胺0.004mg/kg；多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威0.01mg/kg。該方法步驟簡單，凈化效果好，具有良好的靈敏度、回收率和重現性。

1、引言

農葯殘留和食品安全問題在國際社會受到廣泛關注，食品農產品的農葯殘留檢測項目日益增多、限量要求日益嚴格。在分析儀器高度發展的今天，樣品的處理技術在農葯殘留分析中占據越來越重要的位置。現在的前處理技術多採用自製填充柱、SPE小柱或基質固相分散技術[1,2]。採用填充柱凈化法和基質固相分散技術費時並消耗大量的有機試劑；採用SPE小柱凈化，經常多種結合使用，導致成本較高。2003年美國農業部提出了分散型固相萃取技術[3]，關於此凈化方法，現有文獻[4～6]中大部分只採用PSA凈化，PSA吸附劑具有弱的陰離子交換能力，有利於吸附樣品基質中的有機酸、糖以及色素，但對於基質復雜的蔬菜凈化效果並不太理想。本方法在實驗的基礎上創新性的增加了C18、石墨炭黑等吸附劑粉末同時凈化，根據氣相色譜μECD檢測器進行溶劑轉溶，實現了對基質復雜的蔬菜中乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、環氟菌胺、氟蟲腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺及茚蟲威等多種農葯殘留的快速檢測。

2、實驗部分

2.1儀器和試劑

Agilent6890N氣相色譜儀，配μECD檢測器、自動進樣器；渦流混勻器（IKA公司）；研磨機（德國GM公司）；離心機（中國安亭公司）；電子天平（梅特勒公司）；均質器（IKA公司）。乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、環氟菌胺、氟蟲腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威等農葯標准品（Dr.公司的有證標准物質）；正己烷、丙酮、乙腈均為色譜純；冰醋酸：優級純；無水乙酸鈉：分析純；無水硫酸鎂：分析純（500℃馬弗爐內烘5h，冷卻取出裝瓶備用）；PSA粉；C18粉；氨基粉（NH2）；石墨碳黑粉；0.1%冰醋酸/乙腈溶液（移取1mL冰醋酸加入1000mL乙腈混勻）。

2.2實驗方法

2.2.1標准工作液的配製

稱取乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯、多效唑、環氟菌胺、氟蟲腈、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威標准品各10.0mg,用丙酮溶解後，置於13個100mL棕色容量瓶中，並用丙酮定容至刻度，混勻，濃度分別為100mg/L，分別移取以上標准液氟蟲腈、環氟菌胺（A組）各1.0mL,甲草胺、乙草胺、苯氧菊酯（B組）各2.0mL,多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威（C組）各5.0mL置於100mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋至刻度，A組、B組和C組標准溶液濃度分別為1．0、2．0和5．0mg/L。

2.2.2樣品制備及提取、凈化

稱取樣品適量，置於100mL塑料離心管中，加入0.1%醋酸/乙腈溶液10mL，正己烷5mL，無水硫酸鎂5.0g,無水乙酸鈉2.0g，用玻璃棒充分攪拌均勻，於均質機上高速均質2min，5000r/min高速離心8min，移取全部上清液於15mL塑料離心管中，氮氣吹乾，准確加入0.1%醋酸/乙腈 正己烷溶液（1 1）2mL溶解殘渣,1400r/min渦漩混合2min，溶解液轉移入盛有適量PSA、C18粉、石墨碳黑粉的離心管中。以1400r/min渦漩混合2min離心。取上清液1mL，置於離心管中氮吹至近干，用正己烷溶解，定容至1mL，過0.22μm濾膜，供GC測定。若樣品為含硫醚類化合物蔬菜[7,8]如蔥、蒜苔等，根據樣品情況切塊或切段，採用格蘭仕微波爐中火加熱30s，樣品再打碎稱取適量進行提取及凈化。

2.2.3色譜條件

DB1701毛細管柱（30m×0.32mm，0.25μm）；載氣：高純氮，純度＞99.999%；柱溫：60℃（1.25min）20℃/min180℃（7min）（10℃/min）230℃（7min）（10℃/min）270℃（15min）；柱流速：1.4mL/min，恆流；進樣口溫度：250℃;檢測器：μECD；檢測器溫度：300℃；進樣量：1μL。

3、結果與討論

3.1吸附劑粉末的優化選擇

在相同混標溶液中分別加入PSA、石墨碳黑、C18、氨基粉等不同的吸附劑粉末處理，每組6個平行樣，所得的回收率數據見表1，石墨炭黑粉等去除色素等雜質的效果好，但是對茚蟲威吸附較強、用量要適量，氨基粉與PSA凈化效果相同，但氨基粉對多種農葯的吸附性均較強，C18和PSA對上述13種農葯回收率影響較小。所以本實驗選擇PSA、石墨碳黑、C18為吸附劑加強凈化效果。表113種農葯的混合標准品分別經4種吸附劑處理後的回收率（略）

3.213種農葯在不同基質中的回收率

吸附劑粉末的用量也是影響前處理效果的重要因素，應根據樣品情況和目標物性質通過實驗選擇合適的吸附劑用量。對於蔬菜樣品吸附劑粉末用量范圍一般為：PSA粉100～200mg、C18粉100～200mg、石墨碳黑50mg。方法中樣品為菠菜、黃桃、胡蘿卜，樣品色素重，如果僅採用PSA，色素及干擾物去除效果不理想，凈化液顏色較深、干擾峰多、基線高，結果難判斷及定量（圖1a）。所以實驗採用150mgPSA、150mgC18、石墨碳黑粉50mg，凈化效果較好，凈化液呈淺色或無色，目標峰附近無大幹擾峰（圖1b），添加回收率見表2（濃度為0.01mg/kg）。表213種農葯（濃度均為0.01mg/kg）在胡蘿卜、黃桃、菠菜樣品中的回收率。

3.313種農葯的保留時間、線性范圍、相關系數及檢出限

取系列濃度的混合標准工作液，依次進樣，以色譜峰面積對濃度作標准曲線，得13種農葯的線性方程及相關系數，在0.05～10mg/L之間線性關系良好。表313種農葯保留時間、線性范圍、相關系數和檢出限。

3.4方法回收率、精密度

在已知不含農葯殘留的菠菜樣品中分別加入不同濃度的混合標准工作液（A、B、C3組的混標溶液），按本方法進行提取、凈化和檢測，以峰面積計算各種農葯在0.002～0.05mg/kg添加水平的回收率（同一水平樣品組n=6），計算各農葯的平均回收率及相對標准偏差（見表4），標准品譜圖見圖2（0.1mg/L）、添加回收譜圖見圖4（0.01mg/kg）,氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯在本實驗中所採用的DB1701的色譜柱上不能完全分離，但在DB5色譜柱上可完全分離。方法檢出限為：氟蟲腈、環氟菌胺均為0.002mg/kg;苯氧菊酯、甲草胺、乙草胺均為0.004mg/kg；多效唑、咪唑菌酮、氯菊酯、氟氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、高效氰戊菊酯、丙炔氟草胺、茚蟲威均為0.01mg/kg，完全滿足蔬菜中農葯殘留量的檢測要求。表413種農葯的回收率實驗結果。

3.5小結

本方法用分散型固相萃取氣相色譜法對蔬菜中的乙草胺、甲草胺、苯氧菊酯等13種殘留進行檢測。根據蔬菜樣品情況及目標物性質選擇多種吸附劑粉搭配使用，並對其用量進行實驗確定。此凈化方法減少了雜質干擾，色譜峰分離度好，具有良好的精密度及較低的方法檢測低限。通過對100批樣品的檢測和協作實驗室驗證了本方法的實用性。
文章鏈接：中國化工儀器網 http://www.chem17.com/News/Detail/21574.html