體內葯物分析常用血清處理方法

1. 阿司匹林的含量怎麼測定

阿司匹林含量測定綜述 08葯學1班：冉賢飛
阿司匹林片為常用的解熱、鎮痛葯，收載於(中國葯典2000年版)二部。原含量測定方法為酸、鹼中和滴定法。目前市場上流通的解熱、鎮痛葯物中，含阿司匹林或以阿司匹林為主葯的較多。除了中國葯典的原含量測定方法以外，針對各個劑型有多種含量測定的方法。如採用高效液相法測定其含量，可消除其他含有酸、鹼的物質對其測定的干擾，可更有效的控制制劑的質量。方法操作簡便，專一性強，結果准確。也有用數學模型進行計算的如近紅外漫反射技術，其原理是根據標樣集中樣品的近紅外光譜運用化學計量學方法建立光譜特徵值(如吸光度)與待測成分之間的數學關系(簡稱數學模型)

1．阿司匹林及阿司匹林制劑的含量測定
阿司匹林及阿司匹林制劑的含量測定有多種方法，其中包括葯典所載的酸、鹼中和滴定法
及紫外分光光度法，高效液相法等。
1．1阿司匹林酸鹼滴定法：
直接滴定：方法：取本品0。4g，精密稱定，加中性乙醇20ml，溶解，加酚酞指示液3d，用氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）滴定。每1ml滴定液相當於18。02mg 的C9H8O4
水解後剩餘滴定：方法：取本品1.5g，精密稱定加氫氧化鈉滴定液（0.5mol/l）50.0ml，混合，緩緩煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/l）滴定剩餘的氫氧化鈉。
兩步滴定法：取本品10片，精密稱定，研細，精密稱取片粉適量（約相當於阿司匹林），加中性乙醇20ml,振搖使阿司匹林溶解，加酚酞指示液3d，滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）至溶液顯粉紅色。加定量過量的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/l）40ml，置水浴上加熱15min並時時振搖，迅速放冷至室溫，用硫酸滴定液（0.05mol/l）滴定剩餘的鹼。根據消耗的滴定液體積及滴定度計算含量

1．2阿司匹林制劑的電極法測定
儀器與試劑：電極電位和溶液酸度測試均使用pHs—loC型數字式酸度離子計；參比電極為232型飽和甘汞電極；試劑均為分析純，實驗用水為去離子水經高錳酸鉀處理後蒸餾而得。
電極制備：將載體物質三苄基錫辛酸酯20mgl聚氯乙烯（PVC）0．33g和增塑劑鄰硝基苯基辛醚o．65g溶解於四氫呋喃（THF）3g中，攪拌澄清後將其傾倒於40 mm×40 mm的水平玻璃板上。待THF揮發完後(約需l 2h)即得到具有彈性的PVC膜。用打孔器切下直徑10 mm的圓片並用含5％PVC的THF溶液粘於PVC電極桿端,放置數小時,晾乾後電極桿內充以0.1mol／L的水楊酸鈉溶液作為內參比溶液並以Ag／AgCl絲作為內參比電極導出至離子計。電極使用前需於0.01mol／l水楊酸鈉溶液中浸泡2h進行活化處理。電極及備用膜長期不使用時可洗凈後．置於氮氣氛圍下保存。在此條件保存，電極的各項性能指標至少可於5個月內維持穩定。
阿司匹林制劑的分析：待測樣品的處理： 阿司匹林易水解得到水楊酸根離子，且反應定量。因此，通過對水楊酸根離子的測定即可得出樣品中的阿司匹林含量。阿司匹林片(A)和復方阿司匹林片（B）均處理如下：將適量葯品(10片)研製成粉狀，精密稱取1—1．5g．在0.5mol／L NaOH溶液25m1中加熱迴流1h後過濾，定容至250 ml。吸取lOm1濾液，用稀硫酸調至pH 5．5，再用PH 5．5的磷酸鹽緩沖液定容至100 mI作為待瀾液。使用所配電極通過標准溶液法和樣品加入法．分別測定葯品A和B經前述處理後所得試樣中的水楊酸根離子濃度，通過換算得出葯劑中阿司匹林的含量

1．3 HPLC法測定阿司匹林片的含量
儀器與試葯 儀器：高效液相色譜儀；CLASS—LC工作站。色譜柱：ODS C18色譜柱(150mm x 4．6mm，填料：Kromasil，粒度：5um)。 試葯 阿司匹林對照品，甲醇(色譜純試劑)，冰醋酸、鹽酸(分析純試劑)。
取本品20片，精密稱定，研細，精密稱取適量(約相當於阿司匹林10mg)，置100m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液適量，超聲使阿司匹林溶解，放冷至室溫，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5m1，置25m1量瓶中，加0．1mol/l鹽酸溶液稀釋至刻度，格勻，取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖。另取阿司匹林對照品適量，加0．1mol/l鹽酸溶液溶解並稀釋製成每l m1中約含阿司匹林20ul的溶液，取20ul同法測定。按外標法以峰面積計算，即得。

1．4動力學光度法測定痕量乙醯水楊酸
原理：碘對Ce4+和As的氧化還原反應有明顯的催化作用，乙醯水楊酸和碘容易發生取代反應，使碘的濃度降低，導致碘的催化作用減弱，由此建立動力學光度法測定痕量乙配水楊酸的新方法。
儀器和試劑：721型分光光度計；PHS—3C酸度計；超級恆溫水浴。0．01mol/lCe(SO4)2 0．013mol/L AS2O3，5mol/l H2S04 , 5mg/l KI用時稀釋至0．25mg/l ;150mg/l乙醯水楊酸標准溶液用時稀釋至所需濃度；5％醋酸馬錢子鹼；實驗用水為二次蒸餾水。
實驗方法:於一系列25m1比色管中准確加入0．25mg/lKI溶液1．0m1，5mol/l H2S04溶液1．25m1，0．013mol/L AS2O3溶液1.0ml，乙酸水楊酸標准溶液(或樣品溶液)，加蒸餾水至25m1刻度線。搖勻並放人35土0．1度的水浴中，恆溫後加入0.01mol/l Ce〔S04)2 1.0ml，立即搖勻，迅速放回水浴中。反應10min後，加入0.5mol/l,0.5％的醋酸馬錢子鹼終止反應並與Ce4+—顯色，置於沸水浴中煮沸3min，取出冷卻至室溫。用1cm比色皿，在波長520nm處，以蒸餾水為參比，測定吸光度A。

2．以阿司匹林為主葯的含量測定
雖然其成分組成有差異，但大多仍是根據阿司匹林的化學或色譜性質加以分離並測定其含量。
2．1反相高效法相色譜法測定阿司匹林可待因片中阿司匹林含量
儀器和試劑：Hp-1050液相色譜儀及UV檢測器，HP3396積分儀。磷酸可待因對照品、阿司匹林對照品 。甲醇、醋酸鈉、冰醋酸均為分析純試劑，阿司匹林磷酸可待因復方制劑(試製品)。
液相色譜條件：色譜柱ODS C18(10mm，300mm×4mm) 流動相：甲醇—0．03mol/L—l醋酸鈉(冰醋酸調pH＝3．5)(1：2．5)；檢測波長：280nm；流速：1ml/min.
測定方法
混合對照品溶液配製 准確稱取在105℃乾燥至恆重的磷酸可待因對照品適量。用水溶解，配製成濃度為0.8mol/l的溶液。准確稱取阿司匹林對照品約40ml置10mL容量瓶中。加入甲醇2—3mL，溶解，精密加入上述磷酸可待因溶液1.0mL，用水定容至刻度，搖勻即得。
供試品溶液配製 精確稱取樣品細粉適量(約相當磷酸可待因8mg阿司匹林400mg)置100mL容量瓶中，加入25％甲醇溶液50mL，超聲溶解5min。用25％甲醇溶液稀釋至刻度，格勻。經0.45um微孔濾膜濾過，取續濾液為供試品溶液.
測定 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10uL，分別注入液相色譜儀中。記錄峰面積。根據混合對照品溶液中磷酸可待因和阿司匹林的峰面積，計算出供試品溶液中二者的含量.

2．2小兒退熱靈片紫外摺合光譜測定
原理：摺曲線分析法是一種數學變換方法(它的數學屬性是一種新的復合導數變換)。它根據諧波分析原理，將光譜吸收曲線看作是多個數學分量加權而成。由於它提供的信息量大，可以顯示吸收曲線的細微差異，以減少相似組分的數學相關性，所以在物質定性和混合物定量方面具有明顯的優點。
儀器與試葯：UV／VIS W型裙合光譜儀及裙合光譜軟體；阿司匹林(1)對照品(含量99．89％)、苯巴比妥(2)對照品(含量99．92％)和輔料(佳木斯化學制葯廠)；小兒退熱靈片
方法與結果：對照品溶液的配製：分別精密稱取1、2對照品適量，用0．1mol／LNaOH溶液(溶劑)溶解稀釋製成1mg／m1的儲備液。再用溶劑稀釋製成適當濃度的溶液(約120ug／m1，22．0ug／m1，使1和2的吸收度在0.2—0．8)，備用。模擬樣品的配製 按原黑龍江地方標准葯品處方比例稱取1、2與適量的輔料混勻後，精密稱取0．2g置小燒杯中，用溶劑溶解並定容至100m1，靜置10min，再取5m1稀釋至250m1。分別吸取16、17、18、19和20m1置各25m1量瓶中，用溶劑定容，得1濃度為20—25ug／m1、2濃度為2．0—2．5ug／m1的模擬樣品溶液(使1和2的吸收度在0．2—1．2)，共5份。
樣品測定：取本品12片，精密稱定，研細，精密稱取細粉適量(約相當於10．110g，20．011g)，用少量溶劑溶解後定容至50m1。按「2．3」項下方法選定的最佳摺合區間(245—295nm)，經摺合光譜自動採集該區間的光譜信息，以兩組分定量分析系統軟體進行裙合運算，並計算得含量

2．3近紅外漫反射技術測定精氨酸阿司匹林的含量
原理：近紅外定量分析需要一個待測成分已知的標准樣品集(簡稱標樣集)，根據標樣集中樣品的近紅外光譜運用化學計量學方法建立光譜特徵值(如吸光度)與待測成分之間的數學關系(簡稱數學模型)。當測定未知樣品時，只需測定該樣品的近紅外光譜，然後用已建好的數學模型預測出待測成分的含量。與常規的光譜定量分析不同之處是，近紅外光譜分析時所用樣品可以不經預處理，通過求解光譜矩陣與待測成分的濃度矩陣來建立數學模型，進行定量。檢測固體樣品一般採用漫反射技術，對於液體樣品的檢測用透射方法。建立數學模型的方法主要有：多元線性回歸、主成分法、偏最小二乘法等。貼演算法相對而言是一種較新的多元數據處理技術，它與逐步回歸、主成分回歸的顯著差異在於考慮全譜區各波長是光譜參數的同時，還兼顧了被分析樣品內部各成分之間的關系，因此在NIR分析中得到廣泛應用。
儀器：Bruker公司VECTOR22/N近紅外光譜儀,帶漫反射光纖探頭波長區間4000-11000cm-1
樣品: 精氨酸阿司匹林固體粉末含阿司匹林48．0％-53．0％, 蔗糖酯(片劑輔料，作為潤滑劑)
實驗方法：用1／1000扭力天平準確稱取不同比例的精氨酸阿司匹林與蔗糖酯，共10份，分別混合均勻，用壓片機壓片，得到精氨酸阿司匹林含量不同的片劑(以此含量做為精氨酸阿司匹林片的理論含量一真值)，每種各100片。從每種100片中隨機選取10片，用儀器的漫反射光纖探頭壓住葯片，每片正反面各測1次，取平均光譜做為樣品光譜。掃描區間為4000-11000cm-1，解析度為8cm-1。用Bruker公司Bruker公司quant/2軟體分析，光譜數據採用加性散射校正預處理，以消除葯片表面不同引起的誤差，即可得到測量值。

2．4阿司匹林精氨酸鹽注射液含量測定
儀器與試葯： 儀器 79—l電磁攪拌儀；紫外—可見分光光度計。精氨酸，阿司匹林，其餘試劑均為分析純。
標准曲線的繪制：精密稱取阿司匹林結晶250．0 mg，懸浮於250mL蒸餾水中，在40一50度水浴中不斷攪拌至溶解，冷卻後移入500 ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。精密吸取l，2，3，4，5mL分別置於50 mL量瓶中，加25mL蒸餾水，用o．1mol/LNaOH溶液調節pH至9一10，在沸水浴中加熱5min，冷卻後，用0.1mol/l鹽酸溶液調節pH至3.0一4.0，加5滴硫酸鐵銨指示液，再加蒸餾水至刻度，搖勻。在530 nm波長處測定吸收度A。線性回歸得方程.
測定含量：精密稱取阿司匹林精氨酸鹽400．0 mg置l00mL量瓶中，加蒸餾水溶解，稀釋至刻度，搖勻，過濾。取續濾液5mL，置50 mL量瓶中，在沸水浴中加熱數分鍾，冷卻，加25mL蒸餾水，以下同標准曲線項下處理，在530 nm波長處測定吸收度A，計算阿司匹林精氨酸鹽的含量。阿司匹林精氨酸鹽的含量＝(測定值／稱量值)×loo％，代入數據求得阿司匹林精氨酸鹽的含量.

3．阿司匹林體內葯物分析：
3．1反相高效波相色譜法測定阿司匹林血葯濃度
1 儀器與試葯：Waters2690高效液相色譜儀，配置有996二極體陣列檢測器及Millennium數據處理系統；旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；TGL—16高速離心機(上海醫用儀器廠)。 水楊酸、苯甲酸對照品(中國葯品生物製品檢定所)；磷酸為分析純，乙睛為色譜純；水為超純水。
色譜條件：色譜柱為Diamonsil C18柱(4．6mm×250mm，5um)，流動相為甲酵—乙睛—0．2％磷酸(18：32：50)，檢測波長為237nm，流速為1.0ml／min。
溶液配製： 精密稱取10．10mg水楊酸對照品，用甲酵溶解，並定容至10ml，得到1．010mg／L水楊酸的儲備液，並用甲醇稀釋成不同濃度的系列溶液。精密稱取10．44mg苯甲酸，用甲酵溶解，並定容至10ml，得到1．044mg/l苯甲酸的儲備液。取lml儲備液，用甲醇稀釋至loml，得到104．4ug／ml的內標工作液。
樣品處理與測定：精密量取血清樣品0．5nl，加入內標苯甲酸溶液(104．4ug／m1)50ul，乙睛2ml，旋渦振盪2min，15000r／min離心5min，取上清夜20ul，在上述色譜條件下進樣，分別記錄內標與樣品的色譜圖與峰面積。按外標法以峰面積計算，即得。

討論
阿司匹林及其制劑有多種分析方法，但有其共同點。HPLC分析中，檢測柱一般多採用C18柱，檢測波長為280左右。滴定法都是根據葯物中含游離羧酸的酸性進行滴定，或水解後用酸回滴。其他以數學模型等方法進行的測量，也都是基於阿司匹林的化學結構和性質。

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2. 體內葯物分析的樣品處理

體內樣品的預處理方法的選擇需要綜合考慮多種因素，包括體內樣品的種類、被測葯物的性質和濃度、以及所採用的測定方法等三方面。
如血漿或血清需除蛋白，使葯物從蛋白結合物中釋出；尿液樣品則常採用酸或酶水解使葯物從綴合物中釋出；唾液樣品主要採用離心去除黏蛋白沉澱。
被測定葯物的結構、性質、存在形式與濃度范圍等，均直接影響到樣品前處理方法的選擇與應用。例如，葯物的酸鹼性（pKa）與溶解性影響到葯物的萃取分離條件的選擇，葯物的極性、穩定性、官能團性質和光譜特性影響到其色譜測定條件的優化選擇。不同葯物在樣品中的濃度相差懸殊，濃度大的樣品對前處理要求稍低，濃度越低則樣品前處理要求越高。
體內樣品前處理的方法以及分離純化的程度，均取決於測定要求和所採用的測定方法。測定方法的耐受污染程度和抗干擾能力越強、專屬性越好、靈敏度越高，則對前處理的要求越低。通常，免疫測定法由於具有較高的靈敏度和抗干擾能力，體內樣品只需經離心分離即可直接用於測定。而高效液相色譜和色譜-質譜聯用等方法，為防止蛋白質等在色譜柱上沉積、內源性干擾、或基質效應影響，色譜分析前均需對體內樣品進行去除蛋白、溶劑萃取、甚至制備衍生物等前處理。
1.去除蛋白質法
在測定血樣及組織勻漿等樣品中的葯物時，首先應去除蛋白質。去除蛋白質既可使蛋白結合型的葯物釋放出來以便測定葯物的總濃度，又可避免進一步的溶劑萃取過程中乳化的形成，並可消除內源性干擾，同時保護儀器性能（如保護HPLC柱不被蛋白污染），延長使用壽命。去除蛋白質常用的方法包括蛋白沉澱法和蛋白分解法。
2.綴合物水解法
葯物在體內經二相代謝可以形成葡糖醛酸苷或硫酸酯綴合物，並經尿液或膽汁排泄。為了准確測定體內樣品中葯物的含量，首先需將綴合物水解釋放出綴合的葯物或其代謝物後，再進行進一步的處理測定。常用的綴合物水解方法包括酸水解和酶水解。
酸水解通常使用無機酸，如鹽酸或磷酸溶液等。酸的濃度、水解時間和溫度等條件，應根據具體葯物進行優化確定。酸水解的優點是簡便、快速，但是專屬性較差，並需注意避免葯物的進-步降解。對於遇酸及受熱不穩定的葯物，可採用酶水解法。
酶水解法常用葡糖醛酸苷酶或硫酸酯酶，或二者的混合物。酶解時應當注意控制反應的pH、酶試劑用量、孵育溫度、酶解時間，並在厭氧條件下進行。尿液樣本進行酶解時，需要首先隱蔽會抑制酶活力的陽離子。
雖然酶水解法存在水解時間長、酶試劑帶人的黏液蛋白可能導致乳化及色譜柱污染等缺點，但酶水解法具有較高的選擇性，很少使被測葯物或共存物發生降解，所以常被優先選用。
3.分離純化與濃集法
對於濃度較高的樣品，或檢測方法具有足夠靈敏度時，體內樣品在經去除蛋白質或綴合物水解等前處理步驟後即可直接用於測定。但當葯物濃度較低或分析方法的特異性或靈敏度不夠高時，體內樣品需進行分離、純化與濃集處理，或在去除蛋白質或綴合物水解的基礎上進一步進行處理。
萃取法是應用最多的分離、純化方法。萃取的目的是為了從大量共存的內源性物質中分離出所需要的微量組分一葯物及其代謝物，並通過溶劑的蒸發使樣品得到濃集，殘留物採用適宜的溶劑復溶後再進行分析測定。萃取法包括液-液萃取法和液-固萃取法。
4.化學衍生化法
治療葯物監測的體內樣品色譜分析時，可根據待測物的化學結構和檢測方法的要求，通過化學衍生化方法，特異性地引入功能基團後再進行分析。通常對葯物分子中含有活潑H的極性基團，如含-COOH、-0H、-NH2、-NH-和-SH等，進行化學衍生化。化學衍生化的目的包括：改變待測葯物的色譜行為；增強葯物的穩定性；改善（手性拆分）分離能力；提高檢測靈敏度等。
GC分析中常對待測物進行硅烷化（silylation）、醯化（acylation）、烷基化（alkylation）或酯化（esterification）等。硅烷化應用最廣泛。硅烷化試劑有：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙-三甲基硅烷乙醯胺（BSA）、雙-三甲基硅烷三氟乙醯胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（TMTS）等。醯化試劑有：乙酸酐、丙酸酐、五氟苯甲酸酐等。烷基化及酯化試劑有：五氟碘乙烷、重氮甲烷、對溴苄基溴、三氟化硼-甲醇等。
化學衍生化HPLC分析包括柱前和柱後衍生化兩種方法。柱前衍生化分析中，衍生化胺、氨基酸和氨基醇類化合物的試劑有：丹醯氯、熒光胺、9-芴甲氧羰醯氯、鄰苯二醛等；衍生化羰基化合物的試劑有：2，4-二硝基苯肼、丹醯肼等；衍生化羧酸常用的試劑為2，4'-二溴苯乙酮；衍生化醇類化合物常用的試劑為3，5-二硝基苯甲醯氯、五氟苯甲醯氯等。
由於柱前衍生化法是在分離前使葯物與衍生化試劑反應。故與葯物具有相同官能團的干擾物質也同樣會生成衍生物，並有可能妨礙葯物的檢測。如果幹擾物質含量高時，甚至會影響待測成分的衍生化效率。因此，應盡可能將樣品進行分離純化後再衍生化。
柱後衍生化是葯物經色譜分離後在流出液中進行衍生化，以形成對檢測器具有高靈敏度響應的衍生物，從而提高檢測靈敏度。如氨基酸分析儀中的柱後茚三酮衍生化。
具有光學異構體的葯物，由於R（-）與S（+）構型的不同，使之具有不同的葯效和葯動學特性。因此，異構體的分離檢測十分重要。光學異構體的分離可採用不對稱試劑衍生化，使其生成非對映異構體衍生物，再進行色譜分離測定。常用的不對稱衍生化試劑有：（-）-1-（9-芴基）乙基氧甲醯氯、（+）-樟腦磺醯氯、2，3，4，6-四-O-苯甲醯-β-D-葡萄吡喃糖基異硫氰酸酯、（R）-（+）-1-（1-萘基）乙胺等。

3. 體內葯物分析——測定前樣品的制備

除少數體液經簡單處理後直接測定外，通常在最後一步測定前要採取適當的樣品制備，即進行分離、凈化、濃集、必要時尚需對待測組分進行化學改性，為測定創造良好條件。

一、樣品的制備要考慮：

葯物的理化性質、待測物的濃度范圍、葯物測定的目的、選用的生物體液和組織的類型、樣品制備與分析技術的關系。

二、蛋白質的處理：

是測定血漿、血清、全血及組織勻漿等樣品中葯物時的最先處理步驟。

（一）加入沉澱劑和變性試劑：硫酸銨是經典的蛋白質沉澱劑，它與蛋白質分子競爭系統中水分子，而使蛋白質析出。陰離子型沉澱劑（三氯醋酸、高氯酸、鎢酸、焦磷酸）與帶電荷的蛋白質在氏於等電點的pH時形成不溶性鹽；反之，陽離子型沉澱劑（含鋅鹽、銅鹽）與蛋白質分子中帶陰電荷的羧基，在高於蛋白質等電點時，形成不溶性鹽。有關機制不十分清楚。

（二）加入可與水混合的有機溶劑：乙醇過量存在時，能使與蛋白結合狀態的葯物釋放可將混合物離心，取上清液（含葯），但這不能解決樣品的凈化問題。蛋白沉澱法對於與蛋白結合力強的葯物的回收率較差。也有採用酸消化法（Aciddigestion）使葯物自蛋白結合處釋出，但常導致葯物的分解。

（三）組織的酶消化法：蛋白水解酶（Proteolyticenzyme）中的枯草菌溶素（SubtilisinCarlsberg）不僅可使組織酶解，且可使葯物析出。

優點：1、因是在平穩條件下進行的，可避免某些葯物在酸中水解及較高溫度時降解；

2、可顯著改善對蛋白結合率強的葯物的回收率；

3、可用有機溶劑直接提取消化液而無乳化生成的危險；

4、在用HPLC時，無需再進行過多的凈化操作。缺點是不適用於一些在高pH時易水解的葯物。

4. 體內葯物分析中為何要處理理生物樣品中的蛋白質又該如何處理生物樣品中的蛋白質

生物樣品的前處理涉及很多方面，但主要應考慮生物樣品的種類，被測定葯物的性質和測定方法三個方面的問題。
樣品於測定前一般說來，放射免疫測定法由於具有較高的靈敏度和選擇性，因此當初步除去主要干擾物質之後即可直接測定微量樣品；而對靈敏度和專屬性較差的紫外分光光度法，分離要求就要相應高一些；至於常用的高效液相色譜法，為防止蛋白質等雜質沉積在色譜柱上，上柱前需對生物樣品進行去蛋白，有時對被測組分進行提取、制備衍生物等前處理。
樣品處理步驟與分析方法的選擇—(一）去除蛋白質
在測定血樣時，首先應去除蛋白質。去除蛋白質可使結合型的葯物均出來，以便測定葯物的總濃度；去除蛋白質也可預防提取過程中蛋白質發泡，減少乳化的形成，以及可以保護儀器性能（如保護HPLC柱不被沾污），延長使用期限。去除蛋白法有以下幾種。
1.加入與水相混溶的有機溶劑加入水溶性的有機溶劑；可使蛋白質的分子內及分子間的氫鍵發生變化而使蛋白質凝聚，使與蛋白質結合的葯物釋放出來。
2.加入中性鹽加入中性鹽，使溶液的離子強度發生變化。中性鹽能將與蛋白質水合的水置換出來，從而使蛋白質脫水而沉澱。
3.加入強酸當pH低於蛋白質的等電點時，蛋白質以陽離子形式存在。此時加入強酸，可與蛋白質陽離子形成不溶住鹽而沉澱。
5.酶解法在測定一些酸不穩定及蛋白結合牢的葯物時，常需用酶解法。最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。它不僅可使組織酶，並可使葯物析出。
酶解法的優點是：可避兔某些葯物在酸及高溫下降解：對與蛋白質結合牢的葯物（如保泰松、苯妥英納），可顯著改善回收率；可用有機溶劑直接提取酶解液而無乳化現象生成，當採用HPLC法檢測時，無需再進行過多的凈化操作。酶解法的主要問題是不適用於在鹼性下易水解的葯物。
（二）綴合物的水解
尿中葯物多數呈綴合狀態。由於綴合物較原型葯物具有較大的極性，不易被有機溶劑提取。有些葯物僅需較溫和條件即可使葯物游離，有些則需較劇烈的方法，常用酸水解或酶水解的方法。
（三）分離、純化與濃集
對於大多數葯物而言，生物樣品的分析通常由兩步組成：樣品的前處理（分離、純化、濃集）和對最終提取物的儀器分析。
提取法是應用最多的分離、純化方法。提取的目的是為了從大量共存物中分離出所需要的微量組分----葯物及其代謝物，並通過溶劑的蒸發使樣品得到濃集。提取法包括液-液提取法和液-固提取法。
1.液-液提取法（liquid-liquidextraction，LLE）
多數葯物是親脂性的，在適當的溶劑中的溶解度大於水相中的溶解度，而血樣或尿樣中含有的大多數內源性雜質是強極性的水溶性物質。因而用有機溶劑提取一次即可除去大部分雜質，從大量的樣品中提取葯物經濃集後作為分析用樣品。
2.液-固提取法（liquid-solidextration，LES）
液－固提取法是近十幾年來在純化生物樣品時被廣泛採用的方法。也可以認為是規模縮小的柱色譜法。這種方法是應用液相色譜法原理處理樣品。將具有吸附、分配及離子交換性質的、表面積大的擔體作為萃取劑填入小柱，以溶劑淋洗後，將生物樣品通過，使其葯物或雜質保留在擔體上，用適當溶劑洗去雜質，再用適當溶劑將葯物洗脫下來。
（四）化學衍生化
分離前將葯物進行化學衍生化的目的是：（1）使葯物變成具有能被分離的性質；（2）提高檢測靈敏度；（3）增強葯物的穩定性；（4）提高對光學異構體分離的能力等。
葯物分子中含有活潑H者均可被化學衍生化，如含有－COOH、－OH、NH2、、－NH－、－SH等官能團的葯物都可被衍生化。
化學衍生化對GC和HPLC尤為重要。
1.GC中化學衍生化法葯物的化學衍生化前處理對GC十分必要，衍生化可使葯物分子中的極性基團，如羥基、氨基、羧基等變成無極性的、易於揮發的葯物，從而使GC的溫度不必很高即可適合GC的分析要求。主要的衍生化反應有烷基化（alkylations）、醯化（acrylations）、硅烷化（silylations）等。其中已硅烷化用得最廣泛。
常用的烷基化試劑有碘甲烷（CHI）、疊氮甲烷（CHN2）、氫氧化三甲基苯胺（TMAH）等；常用得醯化試劑有：乙酸酐、丙酸酐等；硅烷化試劑有：三甲基氯硅烷（TMCS）、雙－三甲基硅烷乙醯胺（BSA）、雙－三甲基硅烷三氟乙醯胺（BSTFA）、三甲基硅烷咪唑（IMTS）等。
具有光學異構體的葯物，由於R（-）與S（＋）構型不同，使之具有不同的葯效和葯動學特性，因此，異構體的分離也是十分重要的。分離光學異構體的方法之一，就是採用不對稱試劑，使其生成非對映異構體衍生物，然後用GC法或HPLC法進行分析測定。常用的稱試劑有：（S）－N－三氟乙醯脯胺醯氯、（S）－N－五氟乙醯脯胺醯氯等。 #\?xJxT\?
2.HPLC中化學衍生化法當採用HPLC法時，其衍生化的目的是為了提高葯物的檢測靈敏度。一些在紫外、可見光區沒有吸收或者摩爾吸收系數小的葯物，可以使其與衍生成對可見－紫外檢測器、熒光檢測器及電化學檢測器等具有高靈敏度的衍生物。
化學衍生化包括柱前衍生化和柱後衍生化兩種方法。由於柱前衍生化法是在分離前使葯物與衍生化試劑反應，故與葯物具有相同官能團的雜質也會同樣生成衍生，這樣就有可能妨礙葯物的檢測。同時，如果雜質含量多時，葯物與衍生化試劑的反應率降低，因此，應盡可能將葯物進行精製後再衍生化。柱後衍生化是葯物經色譜柱分離之後進行的，所以可形成對檢測器具有高靈敏度的衍生物，從而提高了選擇性。HPLC常用的衍生化試劑有鄰苯二醛、丹醯氯、熒胺等。
在測定生物樣品中葯物及其代謝物時，樣品的前處理是十分重要的。除了少數情況，將體液經簡單處理後進行直接測定外，一般要在測定之前進行樣品的前處理，即進行分離、純化、濃集，必要時還需對待測組分進行化學衍生化，從而為測定創造良好的條件。生物樣品進行前處理的目的在於：①葯物進入體內後，經吸收、分布、代謝，然後排出體外。在體液、組織和排泄物中除了游離型（原型）葯物之外，還有葯物的代謝物、葯物與蛋白質形成的結合物、以及葯物或其代謝物與內源性物質，如葡萄糖醛酸、硫酸形成的葡萄糖醛酸甙（gl uronides）、硫酸酯（sulphates）綴合物等多種形式存在，需要分離後測定葯物及代謝物；②生物樣品的介質組成比較復雜。如在血清中既含有高分子的蛋白質和低分子的糖、脂肪、尿素等有機化合物，也含有Na＋、K＋、X-等無機化合物］。其中影響最大的是蛋白質，若用HPLC法測定葯物濃度時，蛋白質會沉積在色譜柱上發生堵塞，嚴重影響分離效果。因此，為了保護儀器，提高測定的靈敏度，必須進行除蛋白等前處理。
一、常用樣品的種類、採集和貯藏
生物樣品包括各種體液和組織，但實際上最常用的是比較容易得到的血液（血漿、血清、金血）、尿液、唾液。在一些特定的情況下選用乳汁、脊髓液、精液等。下面僅介紹常用的血樣、尿樣及唾液。
（一）血樣 G\­(9M^6@y!
血漿（plasma）和血清（serum）是最常用的生物樣品。測定血中葯物濃度通常是指測定血漿或血清中的葯物濃度，而不是指含有血細胞的全血中的葯物濃度。一般認為，當葯物在體內達到穩定狀態時，血漿中葯物濃度與葯物在作用點的濃度緊密相關，即血漿中的葯物濃度反映了葯物在體內（靶器官）的狀況，因而血漿濃度可作為作用部位葯物濃度的可靠指標。
供測定的血樣應能代表整個血葯濃度，因而應待葯物在血液中分布均勻後取樣。動物實驗時，可直接從動脈或心臟取血。對於病人，通常採取靜脈血，有時根據血葯濃度和分析方法靈敏度，也可用毛細管采血。由採集的血液製取血漿或血清。
血漿的制備 將採取的血液置含有抗凝劑（如：肝縈、草酸鹽、拘橡酸鹽、EDTA、氟化鈉等）的試管中，混合後，以2500～3000rpm離心5min使與血細胞分離，分取上清液即為血漿。

血清的制備 將採取的血樣在室溫下至少放置30min到1h，待凝結出血餅後，用細竹捧或玻璃棒輕輕地剝去血餅，然後以2000～3000rpm離心分離5～10min，分取上清液．即為血清。
血漿比血清分離快，而且製取的量多，其量約為全血的一半。但由於所用抗凝劑的種類不同，用血漿測定葯物濃度有時不一致；血清的獲取量小，但血清成分更接近於組織液的化學成分，測定血清中有關物質的含量，比全血更能反映機體的具體情況；同時，葯物與纖維蛋白幾乎不結合，因此，血漿及血清中的葯物濃度測定值通常是相同的。基於上述原因，現在國外多採用「專用血清」來測定葯物的濃度。
對大多數葯物來說，血漿濃度與紅細胞中的濃度成正比，所以測定全血也不能提供更多的數據，而全血的凈化較血漿和血清更為麻煩，尤其是溶血後，血色素會給測定帶來干擾。但在個別情況下也有採用全血測定葯物濃度的。例如氯噻酮可與紅細胞結合，其動力學行為與在血漿中不同，在血細胞的葯物濃度比血漿葯物濃度大50～100倍；又如一些三環降壓葯物，對個別患者來說，在血漿和紅細胞的分配比率不是一個常數，因此宜採用全血進行測定。
全血（Whole blood）也應加入抗凝劑混合，防止凝血後影響測定。血樣的採取量受到一定限制，特別是間隔比較短的多次取樣，患者不易配合。過去一般取1～2ml。隨著高靈敏度測定方法的建立，取量可減少到1ml以下。採取靜脈血時，目前通行的方法是用注射器直接從靜脈抽取，然後置試管中：採取毛細管取血時，應用毛細管或特殊的微量采血管採取。採取血樣時，應由從事醫療工作的醫生、護士或者臨床檢查技師實施，葯劑師等不能進行采血工作。
血樣的采血時間間隔應隨測定目的的不同而異。例如：進行葯物動力學參數的測定時，需給出葯物在體內的葯物濃度．時間曲線。應根據動力學曲線模型〈單室還是雙室）、給葯方式來確定取樣間隔和次數，主要應在曲線首尾及峰值附近或濃度變化較大處取祥。采樣次數示意圖見
如進行治療葯物濃度監測（therapeuticdrug monitoring，TDM）時，則應在血中葯物濃度達到穩態後才有意義。但每種葯物的半衰期不同，因此達到穩態的時間也不間，取樣時間也隨之不同。葯物進入體內後，大多數很快與血漿中的蛋白質（白蛋白、球蛋白）結合成結合型，並與未結合的游離型葯物處於平衡狀態而存在。結合型葯物（bound型）不能通過血管壁，而游離型葯物（free型）能夠到達葯物作用部位，因此可以說葯物療效與游離型葯物濃度有著比較密切的關系，當然最理想的是測定游離型葯物。由於測定游離型葯物必須經過「超速離心」或「超濾法」等復雜的分離操作，又因葯物的蛋白結合率沒有很大的個體差異，通常血葯總濃度（結合型與游離的總和）可以有效表示游離葯物的濃度，因此，大多數的檢驗室不測定游離型葯物，而是測定葯物的總濃度。
但某些疾病可改變葯物與血漿蛋白的結合率，如肝硬化病人奎尼丁的游離型葯物分數幾乎增加三倍；腎病時，苯妥英、水楊酸、安妥明等的血漿蛋白結合卒明顯下降。有些葯物血漿蛋白結合率存在著很大的個體差異，如奎尼丁的血漿蛋白結合率的范圍為50％～90％，不同個體問游離葯物濃度差達10倍。也就是說在肝硬化、腎功能不全、腎病變、低營養等狀態下，血中白蛋白濃度顯著減少，葯物的蛋白結合率下降，游離型葯物濃度上升，此時應測定游離型葯物濃度。
採取血樣後，應及時分離血漿或血清，並最好立即進行分析。如不能立即測定時，應妥善儲存。血漿或血清樣品不經蒸發、濃縮，必須置硬質玻璃試管中完全密塞後保存。短期保存時置冰箱（4℃）中，長期保存時要在冷凍櫥（庫）（－20℃）中冷凍保存。
要注意采血後及時分離出血漿或血清再進行儲存。若不預先分離，血凝後冰凍保存，則因冰凍有時引起細胞溶解從而妨礙血漿或血清的分離或因溶血影響葯物濃度變化。
（二）唾液
唾液由腮腺、頜下腺、舌下腺和口腔粘膜內許多散在的小腺體分泌液混合組成的，平時所說的唾液就是指此混合液。一般成人每天分泌1～1.5ml，但個體差異大，即使是同－個人每日之內、每日之間也有變動；各腺體分泌的唾液組成也會有很大差別。對口腔粘膜給予機械的或化學的剌激時，會影響各唾液腺的分泌；視覺、聽覺、嗅覺等剌激所產生的條件反射以及思維、情緒也會影響唾液腺的分泌；隨年齡不同，唾液的分泌量也不同：小兒的唾液分泌量多，老年人的分泌量減少。
唾液的相對密度為1.003～1.008；pH值在6.2～7.6之間變動，分泌量增加時趨向鹼性而接近血液的pH值；通常得到的唾液含有粘蛋白，其粘度是水的1.9倍。
唾液的採集應盡可能在剌激少的安靜狀態下進行。一般在漱口後15min收集。分泌量多的，可以將自然貯存於口腔內的唾液吐入試管中，1min內約可取1ml的唾液。必要時也可轉動舌尖，以促進唾液的分泌。採集的時間至少要10min。採集後立即測量其除去泡沫部分的體積。放置後分為泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉澱部分三層。分層後，以3000rpm離心分離10min，取上清液作為葯物濃度測定的樣品。也可以採用物理的（如嚼石蠟塊、橡膠、海綿）或化學的（如酒石酸）等方法剌激，使在短時間內得到大量的唾液。但另一方面，這樣做往往使唾液中的葯物濃度受到影響。特殊需要時，可以採集腮腺、頜下腺及舌下腺分泌的單一唾液。這種單一唾液的採集必須採用特殊的唾液採集器來收集。 ~6["b\}iY\
唾液中含有粘蛋白，唾液的粘度由粘蛋白的含量多少而定。粘蛋白是在唾液分泌後，受唾液中酶催化而生成的。為阻止粘蛋白的生成，應將唾液在4℃以下保存。如果分析時沒有影響，則可用鹼處理唾液，使粘蛋白溶解而降低粘度。唾液在保存過程中，會放出二氧化碳而使pH值升高，因此，需要測定唾液的pH值時，應在取樣的當時為好。冷藏保存唾液時，解凍後有必要將容器內唾液充分攪勻後再用，不然測定結果會產生誤差。
用唾液作為樣品測定葯物濃度有幾個優點：與採取血樣不同，患者自己可以不受時間和地點的限制，很容易地反復採集；採集時無痛苦無危險；有些唾液中葯物濃度可以反映血漿中游離型葯物濃度。但另一方面，由於唾液是由腮腺、頜下腺及舌下腺等各腺體分泌的組成不同的混合液體，其組成也會發生經時變動；因此，唾液中的葯物濃度與血漿中的游離型葯物濃度相比就容易變動；而且唾液中葯物濃度與血漿中葯物濃度的比值〈S／P）只有少數葯物是恆定值；有些與蛋白結合率較高的葯物，葯物在唾液中的濃度比血漿濃度低得多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測；對有些患者（如癲癇、昏迷）不能採集唾液樣品。最後應該指出的是：目前所指的血漿或血清濃度的治療范圍，都是指血漿或血清中的總濃度（游離型和結合型），因此，只有知道唾液中葯物濃度與血漿中葯物濃度有－定的比值時，唾液中葯物濃度的監測才有意義，並且應該先求出具體患者的比值（S/P）。
（三）尿液
採用尿樣測定葯物濃度的目的與血液、唾液樣品不同。尿葯測定主要用於葯物劑量回收研究、尿清除率、生物利用度的研究，並可推斷患者是否違反醫囑用葯，同時根據葯物劑量回收研究可以預測葯物的代謝過程及測定葯物的代謝類型（代謝速率，MR）等。
體內葯物清除主要是通過尿液排出，葯物可以原型（母體葯物）或代謝物及其綴合物（conjugete）等形式排出。尿液中葯物濃度較高，收集量可以很大，收集也方便。但尿液濃度通常變化很大。尿液主要成分是水、含氮化合物（其中大部分是尿素）及鹽類。
健康人排出的尿液是淡黃色或黃褐色的，成人一日排尿量為1~5L，尿液相對密度1.015~1.020，pH值在4.8~8.0之間。放置後會析出鹽類，並有細菌繁殖、固體成分的崩解，因而使尿液變混濁。由於這些原因，必須加入防腐劑保存。採集的尿是自然排尿。尿包括隨時尿、晨尿、白天尿、夜間尿及時間尿幾種。測定尿中葯物濃度時應採用時間尿，時間尿以外的尿不可能推斷全尿中葯物的排泄濃度和葯物總量。因此，測定尿中葯物的總量時，將一定時間內（如8h、12h或24h等）排泄的尿液全部儲在起來，並記錄其體積，取其一部分測定葯物濃度，然後乘以尿量求得排泄總量。如採集24h的尿液時，一般在上午8點讓患者排尿並棄去不要，之後排出的尿液全部儲存於干凈的容器，中，直到次日上午8點再讓患者排尿，並加入容器中。將此容器中盛的尿液做為檢液。採集24h尿液時，常用2L容量的帶蓋的廣口玻璃瓶，其體和可能會有士100ml的誤差，因此，需再用量筒准確地測量儲尿量。採集一定時間內的時間尿液時，常用塗蠟的一次性紙杯或用玻璃杯，並用量筒准確量好體積放入儲尿瓶，並做好記錄。
尿液中葯物濃度的改變不能直接反映血葯濃度，即P與血葯濃度相關性差；受二試者的腎功能正常與否直接影響葯物排泄，因而腎功能不良者不宜採用尿樣；嬰兒的排尿時間難於掌握；尿液不易採集完全並不易保存。這些是尿樣的缺點。
採集的尿樣應立即測定。若收集24h的尿液不能立即測定時，應加入防腐劑置冰箱中保存。常用防腐劑有：甲苯、二甲苯、氯仿、麝香草酚以及醋酸、濃鹽酸等。利用甲苯等可以在尿液的表面形成薄膜，醋酸等可以改變尿液的酸鹼性來抑制細菌的生長。保存時間為24～36h，可置冰箱（4℃）中，長時間保存時，應冰凍（－20℃）。
本回答

5. 目前進行體內葯物分析的方法有哪些何種方法是應用最多的方法為什麼

目前進行體內葯物分析的方法有哪些？何種方法是應用最多的方法？為什麼
體內樣品的預處理方法的選擇需要綜合考慮多種因素，包括體內樣品的種類、被測葯物的性質和濃度、以及所採用的測定方法等三方面。
如血漿或血清需除蛋白，使葯物從蛋白結合物中釋出；尿液樣品則常採用酸或酶水解使葯物從綴合物中釋出；唾液樣品主要採用離心去除黏蛋白沉澱。
被測定葯物的結構、性質、存在形式與濃度范圍等，均直接影響到樣品前處理方法的選擇與應用。例如，葯物的酸鹼性（pKa）與溶解性影響到葯物的萃取分離條件的選擇，葯物的極性、穩定性、官能團性質和光譜特性影響到其色譜測定條件的優化選擇。不同葯物在樣品中的濃度相差懸殊，濃度大的樣品對前處理要求稍低，濃度越低則樣品前處理要求越高。