高效液相色譜儀的分析方法

㈠ 高效液相色譜怎麼分析

計算含量的方法很多：
面積歸一化法，外標法，內標法
常用的：
面積歸一化法那很簡單，配製一個供試品，進樣分析。一個色譜峰代表一個物質，最大的那個通常是你的主峰，其餘的基本都是雜質。
雜質（%）=雜質的峰面積/主峰峰面積*100%（這個數值在你的分析報告中應該可以看到）

如果是外標法或者內標法，你需要有對照品。
計算方法比較復雜，我就說個外標法，不需要校正因子的計算方法：
將對照品和樣品配製相同濃度，分別進樣分析。
含量（%）=樣品峰面積/對照品峰面積*對照品濃度/樣品濃度*100%

計算時你就記住，樣品的峰面積和濃度呈正比。寫完公式上下單位一致就完了。

㈡ 楂樻晥娑茬浉鑹茶氨浠瀹氶噺鏄涓縐嶄粈涔堝垎鏋愭柟寮忥紵

楂樻晥娑茬浉鑹茶氨浠瀹氶噺鍒嗘瀽鏄涓縐嶇浉瀵瑰垎鏋愶紝鏄閫氳繃瀵瑰凡鐭ュ惈閲忕殑鐗╄川鍜屽緟嫻嬫牱鍝佸湪鐩稿悓鏉′歡涓嬭繘琛屽垎鏋愶紝寰楀埌鏁版嵁鍚庤繘琛屽圭収璁＄畻錛屾帹綆楀嚭鍚閲忕殑銆

棰樹腑宸茬粡鐭ラ亾鏈鐭ュ惈閲忕墿璐ㄧ殑宄伴潰縐鍚庯紝榪樻棤娉曞緱鍒板惈閲忥紝濡傛灉闇瑕佸緱鍒扮粷瀵瑰惈閲忔暟鎹錛岃繕闇瑕佸皢涓涓宸茬煡鍚閲忕殑鏍峰搧錛堟爣鍑嗘牱鍝侊級鍦ㄥ悓涓鏉′歡涓嬭繘琛屼竴嬈″垎鏋愶紝寰楀埌鐩稿悓鐗╄川緇勪喚鐨勫嘲闈㈢Н銆

鐒跺悗鏍規嵁鍙屾柟闈㈢Н姣斾緥璁＄畻鍑哄緟嫻嬫牱鍝佺殑緇濆瑰惈閲忥紱濡傛灉鏄鐩稿瑰惈閲忥紙寰呮祴緇勪喚鍦ㄦ繪牱鍝侀噺涓鐨勬瘮渚嬶級錛屼篃闇瑕侀氳繃涓涓鐭ラ亾鐩稿瑰惈閲忕殑鏍囧噯鏍峰搧鏉ュ圭収璁＄畻銆

鎵╁睍璧勬枡錛

鍌ㄦ恫鍣ㄤ腑鐨勬祦鍔ㄧ浉琚楂樺帇娉墊墦鍏ユ嫻嬬郴緇燂紝鏍峰搧婧舵恫緇忚繘鏍峰櫒榪涘叆嫻佸姩鐩革紝琚嫻佸姩鐩歌澆鍏ヨ壊璋辨熅錛堝滻瀹氱浉錛夊唴錛岀敱浜庢牱鏈婧舵恫涓鐨勫悇緇勫垎鍦ㄤ袱鐩鎬腑鍏鋒湁涓嶅悓鐨勫垎閰嶇郴鏁般

鍦ㄤ袱鐩鎬腑浣滅浉瀵硅繍鍔ㄦ椂錛岀粡榪囧弽澶嶅氭＄殑鈥滃惛闄-瑙ｅ惛鈥濈殑鍒嗛厤榪囩▼錛屽悇緇勫垎鍦ㄧЩ鍔ㄩ熷害涓婁駭鐢熻緝澶х殑宸鍒錛岃鍒嗙繪垚鍗曚釜緇勫垎渚濇′粠鏌卞唴嫻佸嚭錛岄氳繃媯嫻嬪櫒鏃訛紝鏍鋒湰嫻撳害琚杞鎹㈡垚鐢典俊鍙蜂紶閫佸埌璁板綍浠錛屾暟鎹浠ュ浘璋卞艦寮忚緭鍑烘嫻嬬粨鏋溿

鏍規嵁鍒嗙繪満鍒剁殑涓嶅悓錛孒PLC鍘熺悊鍙鍒嗕負娑插滻鍚擱檮鑹茶氨娉曘佹恫娑插垎閰嶈壊璋辨硶錛堟ｇ浉涓庡弽鐩革級銆佺誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨娉曞強鍒嗗瓙鎺掗樆鑹茶氨娉曘

鍥哄畾鐩鎬負娑蹭綋錛屾牴鎹琚鍒嗙葷殑緇勫垎鍦ㄦ祦鍔ㄧ浉鍜屽滻瀹氱浉涓鐨勬憾瑙ｅ害涓嶅悓鑰屽垎紱匯備緷鍥哄畾鐩稿拰嫻佸姩鐩哥殑鏋佹т笉鍚屽彲鍒嗕負姝ｇ浉鑹茶氨娉曞拰鍙嶇浉鑹茶氨娉曘

姝ｇ浉鑹茶氨娉曢噰鐢ㄦ瀬鎬у滻瀹氱浉錛屾祦鍔ㄧ浉涓虹浉瀵歸潪鏋佹х殑鐤忔按鎬ф憾鍓傦紝甯哥敤浜庡垎紱諱腑絳夋瀬鎬у拰鏋佹ц緝寮虹殑鍖栧悎鐗╋紱鍙嶇浉鑹茶氨娉曚竴鑸鐢ㄩ潪鏋佹у滻瀹氱浉錛屾祦鍔ㄧ浉涓烘按鎴栫紦鍐叉憾娑詫紝閫傜敤浜庡垎紱婚潪鏋佹у拰鏋佹ц緝寮辯殑鍖栧悎鐗┿

鍙傝冭祫鏂欐潵婧愶細鐧懼害鐧劇--楂樻晥娑茬浉鑹茶氨浠

㈢ 如何分析高效液相色譜圖

分析色譜圖的方法：

手動進樣步驟 配置好流動相，將濾嘴洗頭放入流動相頁面內，打開泵和檢測器，快跑排除氣泡，設置既定流速，穩定一段時間，讓基線跑平，用液相針吸取稱量融配脫氣後的對照（含量已標定）。

打開定量環將液相針里的液體勻速注入定量環中，拔出針頭好立刻關閉六通閥，一般隨六通閥關閉電腦自動采樣，等主峰跑完整後記錄其峰面積，一般跑兩個對照，每個對照跑兩針，共四針。

①高壓：流動相為液體，流經色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓。

②高速：分析速度快、載液流速快，較經典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鍾，有些樣品甚至在5分鍾內即可完成，一般小於1小時。

③高效：分離效能高。可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍。

④高靈敏度：紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數量級。

⑤應用范圍廣：百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差化合物的分離分析，顯示出優勢。

⑥柱子可反復使用：用一根柱子可分離不同化合物

⑦樣品量少、容易回收：樣品經過色譜柱後不被破壞，可以收集單一組分或做制備。

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復使用、樣品不被破壞、易回收等優點，但也有缺點，與氣相色譜相比各有所長，相互補充。高效液相色譜的缺點是有「柱外效應」。在從進樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動相的流型有變化，被分離物質的任何擴散和滯留都會顯著地導致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜。

㈣ 高效液相色譜常用什麼色譜法

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜

根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）

根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同

根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜

氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。

一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。

分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。

固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。

流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。

二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。

反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。

三、鍵合相色譜

考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物

反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。

四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。

根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。

SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。

五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離

㈤ 高效液相色譜有幾種定量方法其中那種是比較精確的定量方法並簡述

峰面積法、峰高法、歸一法、外標法。峰面積法是比較精確的定量方法