㈠ DNA含量的測定方法
那要看你用什麼方法測定DNA和RNA:
(1)紫外吸收法也就是測量OD(260)和OD(280)的吸收值,這樣的方法其它的雜質對測量結果影響大一點,因為其它雜質在這兩個吸收波長也有吸收。
(2)熒光法,用PicoGreen熒光染料,測定DNA,RNA濃度比較靈敏,並且適合測量低濃度和微量DNA和RNA,並且受其它雜質的影響不大,缺點要有專門的熒光檢測儀器,試劑比較昂貴。
純化DNA可以買試劑盒,主要有膜吸附法,磁珠分離法,都很方便。
㈡ 測定DNA含量可以用什麼方法
外分光光度計 OD260/280比值,如果濃度夠大的話可以適當稀釋,是OD260在0.1到1之間最好。
OD260值為1時,雙鏈DNA一般為50ng/ul.單鏈DNA一般為40ng/ul,需要具體測的話還是用熒光定量DNA檢測試劑盒,用多功能酶標儀檢測。
還有一種就是跑電泳,根據已知濃度條帶的亮度對比你提的DNA亮度,這個需要分析軟體,肉眼是無法正確比較的。
㈢ dna測量方法
DNA檢測
技術有很多,主要分為定性和定量方法。給你舉幾個:1,分子雜交技術,(包括southern雜交,northern雜交,基因晶元等)分子雜交分析的基本原理是基於DNA探針檢測變性而且固定在硝酸纖維素膜上的宿主細胞DNA。這些探針可以不依賴宿主細胞DNA來制備,例如用隨機引物制備探針。探針上標記酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛(Dig)等。由於地高辛標記核酸探針,操作方便、靈敏度高,已標記的探針在4℃貯存可達兩年之久,方便隨時應用,所以現在常採用地高辛標記核酸探針,用游標記法將光敏Dig標記到探針上,製成光敏-Dig-核酸探針,再與固定在硝酸膜上的靶核酸進行靶DNA分子雜交,使之與抗Dig-鹼性磷酸酶結合,最後可用不同的檢測方式進行檢測,
發光檢測
和顯色檢測均可,靈敏度可達10pg以下2,基於DNA結合蛋白的方法Threshold®
Immunoassay分析系統是基於兩種DNA序列非特異性蛋白,單鏈DNA(ssDNA)結合蛋白(SSB)和抗ssDNA
的單抗。檢測的基本過程是當生物素—DNA單鏈結合蛋白和尿素酶—抗ssDNA
的單抗與變性的宿主細胞DNA結合最終形成復合物,通過親合素將此復合物連接到生物素—硝酸纖維素膜,在通過洗滌所有非特異性的被洗脫掉,最後放於有
尿素溶液
的讀數儀,尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2
導致PH值發生變化,讀數儀根據PH值的變化換算成DNA的量,從而達到檢測殘余DNA含量的目的。3,PCR法,其中以實時定量PCR法最為突出熒光定量
PCR是基於PCR擴增時,在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,產物的增加可以通過熒光信號指示,通過實時監控PCR體系中的熒光信號,對樣本中初始模板進行定量分析。定量PCR可實時檢測產物量,通過加入已知濃度的
標准樣品
繪制標准曲線,然後根據待測樣品在標准曲線中的位置推算初始模板的濃度,從而達到檢測殘余DNA含量的目的。此外,對DNA的定量技術也有很多,可以看下這篇文章《核酸定量技術及其在生物檢測中的應用》
㈣ 在dna水平上分析基因一級結構,拷貝數變化及在染色體上位置可以採用哪些方法
基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列測序,解析一級結構最精確的技術就是DNA測序,第一代測序技術為Sanger測序法(雙脫氧測序法),第二代測速技術是循環晶元測序技術,第三代測序技術是單分子測序技術;分析某種基因的種類及拷貝數,實質上就是對基因進行定性和定量分析,常用的技術包括DNA印跡技術(Southern印記)和實時定量PCR技術;基因在染色體上位置的檢測可以通過熒光分子標記法。
該答案由本人查閱資料整理歸納,如有異議,歡迎批評指正。
㈤ 科普講堂|實時熒光定量PCR檢測方法
聚合酶鏈式反應(PCR)是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。目前,PCR成為分子生物學研究必不可少的一部分。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技術,是指在PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程,最後通過標准曲線對模板進行定量分析的方法。該項技術可以對DNA、RNA樣品進行相對定量、絕對定量和定性分析,提高了普通PCR技術的特異性和准確性,被廣泛應用於基礎研究、疾病診斷、農業檢測和法醫調查等領域。
一、常規PCR
利用DNA分子會在體外95°高溫時會發生變性解旋變成單鏈,然後降溫到60°C左右時引物會與單鏈DNA按鹼基互補配對原則結合,接著再升高溫度到72°C左右,即DNA聚合酶最適反應溫度,DNA聚合酶會沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成相應的互補鏈,如此循環往復以達到DNA分子擴增的目的,常規PCR技術無法實現精確定量。
二、實時熒光定量PCR
如要對DNA、RNA樣品進行精確定量研究,就需要採用實時熒光定量PCR,根據檢測實時熒光PCR產物的方式不同,實時熒光定量PCR主要有DNA結合染料法、基於探針的化學法、淬滅染料引物法等類型。
1. DNA 結合染料法
原理 :應用一種帶有熒光的、非特異的DNA結合染料檢測PCR過程中積累的擴增產物。
應用於核算定量和基因表達驗證。
優缺點: 它們的優點是可以對任何雙鏈DNA 進行定量,不需要探針,具有相對高的靈敏度和可靠性,並且成本低,簡單易用,缺點是它們能在反應中結合所有的DNA雙鏈,其中包括在PCR過程中產生的引物二聚體或其他非特異產物。
染料法一般使用的是SYBR Green I染料,這是一種可以與雙鏈DNA小溝結合的熒光染料,不會與單鏈DNA結合,並且在游離狀態下幾乎無熒光,只有與雙鏈DNA結合才會發出熒光,因此將PCR擴增產生的雙鏈DNA數量與熒光強度直接關聯,產生實時監測的效果。
2. 基於探針的化學法
原理: 應用一個或多個熒游標記的寡核苷酸探針檢測PCR擴增產物;依賴熒光能量共振傳遞檢測特異性擴增產物。
應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR。
優缺點: 探針法的鑒別能力遠遠大於DNA結合染料法,因為它們只與目的產物結合,從不與引物二聚體或其他非特異產物結合,缺點是它的合成價格高。
探針法中最常用的TaqMan探針是一種寡核苷酸探針,熒光基團連接在探針的5』末端,而淬滅基團則在3』末端,PCR擴增時在加入引物的同時加入探針,探針完整時,熒光信號被淬滅基團吸收,PCR擴增時,5』→3』外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團和淬滅基團分離,從而檢測器可以接收到熒光信號。
3. 淬滅染料引物法
原理: 採用熒游標記引物擴增,從而使熒游標記基團直接摻入PCR擴增產物中,依賴熒光能量共振傳遞。
應用於核酸定量、基因表達驗證、等位基因鑒別、SNP分型、病原體和病毒檢測、多重PCR
優缺點:探針和目標片段的特異性結合產生熒光信號,因此減少了背景熒光和假陽性,還可進行多重PCR擴增,缺點是原料成本價格高
三、實時熒光PCR儀
實時熒光PCR系統包括熱循環儀,用於熒光激發的光學系統以及用於收集熒光數據和管理分析的計算機軟體,數據通過實時分析軟體以圖表的形式顯示。