北京修飾蛋白組學研究方法

⑴ 蛋白質組學常用的研究方法

酵母雙雜交系統、抗體晶元、LCM技術、mic Solution Inc、SPR技術、色譜分離技術、雙相電泳技術、有機質譜等等。
LCM技術獲得的細胞可以用於蛋白質樣品的制備。
蛋白質樣品中的不同類型的蛋白質可以通過二維電泳進行分離。
膠染色後可以利用凝膠圖象分析系統成像，然後通過分析軟體對蛋白質點進行定量分析，並且對感興趣的蛋白質點進行定位。
Genomic Solution可以為研究者提供除質譜外的所有蛋白質組學研究工具，包括二維電泳系統，成像系統及分析軟體，膠切割系統，蛋白質消化濃縮工作站，點樣工作站等；同時還可以提供相關試劑和消耗品。
蛋白質相互作用的研究，酵母雙雜交和噬菌體展示技術無疑是很好的研究方法。
LCM-二維電泳-質譜的技術路線是典型的一條蛋白質組學研究的技術路線，除此以外，LCM-抗體晶元也是一條重要的蛋白質組學研究的技術路線。

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詳細資料請參考：on
http://proct.bio1000.com/101969/

⑵ 蛋白質組學的研究手段有哪些

比較多：最基本的
1、雙向電泳技術（理想目的：將細胞（或組織）內所有蛋白質都分離開來）
2、質譜技術及一系列派生技術 （測蛋白質序列）
3 、蛋白質互相作用研究：
酵母雙雜交，細菌雙雜交，免疫共沉澱技術，pull-down，FRET,BiFC等
4、蛋白質定位：
熒游標記技術，共聚焦熒光顯微鏡技術，免疫熒光，免疫化學等技術。

⑶ 蛋白質組學的研究手段有哪些原來這里已經有回答了，還不滿意，希望詳盡點。

一 雙向電泳。雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)與質譜(mass spectrum, MS)的結合是最常見的蛋白質組學的研究手段。雙向電泳包括第一向等電聚焦(Isoelectric focusing, IEF)和第二向SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)。雙向電泳可以提供包含有分子量和等電點信息的二維圖譜
二 多維色譜法。在多維色譜法中，蛋白樣品通常先被消化成肽段，然後經過離子交換、反相HPLC(high-performance liquid chromatography)而被分離。該方法的中HPLC可以直接和質譜偶聯，可有效的分析極酸或極鹼、高度疏水等傳統2-DE方法難以分析的蛋白質，而且易於實現分析的自動化。
三 熒光差異凝膠電泳技術(differential in-gel electrophoresis, DIGE)。DIGE可用三種不同的熒光染料來分別對樣品進行標記，熒光染料可以通過醯胺鍵與蛋白質的賴氨酸ε-氨基共價結合。將標記的樣品混合然後在同一塊雙向電泳凝膠上分離。這樣在一塊雙向電泳凝膠上可獲得三幅圖像，即在一塊凝膠內分析不同的蛋白樣品。DIGE有效地改善了傳統2-DE的重復性。
四 定量蛋白質組學方法：
⑴ ICAT(isotope-coded affinity tags)方法。ICAT是用於定量蛋白質組學研究的穩定同位素標簽法的一種。在穩定同位素標簽法中，質譜可以通過識別標記的肽段和未標記的肽段之間的信號強度差異來達到定量的目的。在ICAT方法中，帶有生物素半分子的同位素標簽對樣品中蛋白質的半胱氨酸殘基進行標記，標記的蛋白樣品經過消化成為肽段後，經陽離子交換色譜和親和素親和純化，然後進入質譜鑒定。相同肽段在質譜上會表現為雙峰，峰的強度直接反應了該肽段對應的蛋白質在兩種樣品中的相對強度。ICAT的缺點是無法標記缺乏半胱氨酸殘基的蛋白質、會丟失轉錄後修飾信息、相同肽段由於標記上的差異在HPLC中會產生不一致的洗脫表現以及增加的生物素基團會增加質譜解析的復雜性[47][48]。

⑵ cICAT (cleavable isotope-coded affinity tags)。也是穩定同位素標簽法，基於ICAT。cICAT採用了13C和酸性可裂解生物素而克服了ICAT的部分缺點。

⑶ iTRAQ 。iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)法可同時分析多達四個不同樣品的，該方法不會丟失轉錄後修飾信息，因而可以用於信號轉導中的蛋白質磷酸化修飾的研究。

⑷ 蛋白質組學的研究方法

蛋白質組學的研究方法有蛋白質鑒定、翻譯後修飾、蛋白質功能確定、蛋白質靶向定量技術。

4.對人類而言，蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康，主要指促進分子醫學的發展。如尋找葯物的靶分子。很多葯物本身就是蛋白質，而很多葯物的靶分子也是蛋白質。葯物也可鉛薯扒以干預蛋白質－蛋白手斗質相互作用。

⑸ 六，蛋白組學的概念和研究方法有哪些

概念
蛋白質組學（Proteomics）一詞,源於蛋白質（protein）與 基因組學（genomics）兩個詞的組合,意指「一種基因組所表達的全套蛋白質」,即包括一種細胞乃至一種生物所表達的全部蛋白質.蛋白質組本質上指的是在大規模水平上研究蛋白質的特徵,包括蛋白質的表達水平,翻譯後的修飾,蛋白與蛋白相互作用等,由此獲得蛋白質水平上的關於疾病發生,細胞代謝等過程的整體而全面的認識
研究技術
二維電泳和質譜技術
應用
1.蛋白質鑒定：可以利用一維電泳和二維電泳並結合Western等技術,利用蛋白質晶元和抗體晶元及免疫共沉澱等技術對蛋白質進行鑒定研究.
2.翻譯後修飾：很多mRNA表達產生的蛋白質要經歷翻譯後修飾如磷酸化,糖基化,酶原激活等.翻譯後修飾是蛋白質調節功能的重要方式,因此對蛋白質翻譯後修飾的研究對闡明蛋白質的功能具有重要作用.
3.蛋白質功能確定：如分析酶活性和確定酶底物,細胞因子的生物分析/配基-受體結合分析.可以利用基因敲除和反義技術分析基因表達產物-蛋白質的功能.另外對蛋白質表達出來後在細胞內的定位研究也在一定程度上有助於蛋白質功能的了解.Clontech的熒光蛋白表達系統就是研究蛋白質在細胞內定位的一個很好的工具.
4.對人類而言,蛋白質組學的研究最終要服務於人類的健康,主要指促進分子醫學的發展.如尋找葯物的靶分子.很多葯物本身就是蛋白質,而很多葯物的靶分子也是蛋白質.葯物也可以干預蛋白質-蛋白質相互作用.
在基礎醫學和疾病機理研究中,了解人不同發育、生長期和不同生理、病理條件下及不同細胞類型的基因表達的特點具有特別重要的意義.這些研究可能找到直接與特定生理或病理狀態相關的分子,進一步為設計作用於特定靶分子的葯物奠定基礎.

⑹ 1. 蛋白質組學研究方法概述（上）

說明：此篇筆記系2016-2017年由克里克學院與康昱盛主辦的蛋白質組學網路大課堂整理而成，侵刪。該課程由上海交通大學系統生物醫學研究院助理研究員庫鑫博士所授。

大夥兒都知道，蛋白質組學（proteomics），是研究一種細胞或者一種生物體所表達的全部蛋白質。雖說現在基因組測序火得一塌糊塗，但是，我們不要忽略了，蛋白質才是執行生命體功能的基本單元，而且蛋白質都是通過形成各種復合物，組成通路網路，去行使各種生物學功能的！所以，有很多生物學問題只能在蛋白質層面上去研究去探索，而且需要站在系統的層面去考察，比如說：蛋白-蛋白相互作用、蛋白的細胞定位、翻譯後修飾、信號通路及代謝通路的調控和功能等。這就是為啥蛋白質組學如此重要啦！

既然重要，科學家們自然是想盡辦法來研究了！最開始使用的技術就是傳說中的雙向凝膠電泳（2-DE），由於解析度低、蛋白質重疊等各種問題，無論是通量還是准確度，都不盡如人意。當質譜技術興起以後，就迅速被替代了。

說起質譜技術的誕生，估計很多小夥伴都聽過那個著名的diao絲逆襲的段子，講的就是2002年諾貝爾化學獎得主田中耕一，作為蛋白質譜發明人之一，由於一個不小心在實驗時錯加了甘油，結果神奇地將質譜技術引入到鑒定生物大分子的應用領域。想想，大到整個人類的科技發展史，小到每個個體的人生，都充滿了多少不可思議~

當質譜技術與蛋白質組學碰到了一起，真是天雷引了地火，產生出強烈的化學反應，迅速引爆整個學科的發展！也就十幾年的時間吧，蛋白質組學的研究目標從細胞模型、動物模型，到人的體液、組織等人體樣本，應用范圍的生物復雜度越來越高。研究目的呢，也從最初的肽段序列推導，到多肽和蛋白質的定性定量分析，翻譯後修飾，再到如今成為新熱點的靶向蛋白質組學，總之，勢不可擋啊！

說到靶向蛋白質組學，咱們都知道，一直以來蛋白質組學的應用領域主要是針對基礎生物學，比如研究通路、蛋白復合物、互作網路，表徵細胞和組織的類型，觀察細胞周期內蛋白質的表達等。近年來，由於技術的飛速發展，蛋白質組學開始被用於醫學研究和葯物研究。比如說葯物研究，國內可能用得還不多，但在歐美已經開始越來越廣泛。以肝毒性為例，蛋白質組學可以為葯物研發前期的肝毒性評估提供研究手段。

那麼，怎麼將蛋白質組學應用到臨床及葯物研發中呢？就是需要靶向蛋白質組學技術了！以前，蛋白質組學技術主要用於發現新的未知物，比如肽段、蛋白復合物、蛋白的翻譯後修飾等。這部分的應用很廣，技術門檻比較低，方法比較通用。但問題是，這種方法思路沒辦法應對大量的臨床樣本，可重復性和准確性達不到要求。

於是，靶向分析開始興起，就是說，分析之前我們就明確知道需要分析的物質是什麼，然後把它挑出來，進行一個精確的定量和分析！我們不需要一次性驗證成千上萬的蛋白，但我們需要在成百上午的樣本中驗證十幾種或者幾十種我們關心的蛋白質，而且這些蛋白質常常都是濃度很低的蛋白，用傳統的方法基本上只有被遺漏的命（後面我會詳細講為什麼會遺漏）。有了靶向技術，對於研究臨床診斷的生物標志物，就有了更大的可能和更強的支撐了！

那麼接下來，根據老師講課的思路，我就從定性檢測、定量檢測和靶向蛋白質組學三個方面來分享下聽課的收獲。

無論是定性還是定量檢測，樣品制備是跑不掉的准備工作。用於質譜的蛋白質樣品，來源非常廣泛，只要你是包含了蛋白質的東西，都可以作為來源。對於復雜的樣品，比如人體體液或組織樣本，蛋白質的提取及去高峰度，常常需要復雜的精細的處理，而且處理流程根據樣本和研究目的的不同而不同。這部分內容呢，第二講「樣品前處理」會詳扒，感興趣的小夥伴可以期待我的下一篇聽課筆記吧~

話說，蛋白質的定性檢測有兩種思路：Bottom-up和Top down。Top down是指從一個完整的蛋白出發，在質譜中進行碎片化處理，通過對碎片分子的檢測，推導出蛋白的序列。而在使用中真正占絕大多數是Bottom-up方法，也就是我們常說的shotgun方法，它充分利用了蛋白質自身的特點：可以被特定的酶在特定的位點切斷。基本思路是，先用蛋白酶把蛋白序列進行酶切，再針對酶切後的肽段進行鑒定，所以進入質譜的檢測對象永遠是肽段，再根據肽段序列再推導出蛋白序列。

1. 樣本處理 ：拿到蛋白來源的各種樣本，進行前處理和優化。

2. 蛋白分離 ：根據研究需要，用凝膠分離，提取所需的蛋白，或者不分離，全部拿來檢測，需要注意去雜質；

3. 酶切 ：用序列特異性的酶，對蛋白進行酶切；

4. 肽段分離 ：酶切後的肽段進入HPLC（高壓液相色譜），這也就是我們常說的LC-MS中的LC，肽段會因為在色譜柱填料上的保留時間的不同，得到預分離；

5. 電離 ：分離後的肽段，加電壓使其離子化（ESI）；或者用MALDI基質輔助的激光解離，就不需要HPLC的過程；

6. 質譜解析 ：將帶上電荷的肽段送入質譜，肽段會在磁場中發生偏轉（質譜儀的基本原理），在質譜里收集信號，得到譜圖。

7. 搜庫 ：用搜索軟體對質譜圖進行自動化的分析，得到肽段及蛋白序列信息。

換個角度，對Shotgun方法的流程，我們可以這樣來總結：

這裡面最關鍵的一個指標，我們叫Peptide-Spectrum matching（PSM），就是指譜圖與肽段的匹配。匹配得越好，則反推出的蛋白就越准確。這個匹配的過程，也就是我們常說的搜庫。那麼接下來我就來分享一下從課程中學習到的搜庫背景知識、搜庫工具和演算法，以及對搜索結果的評估。

質譜，聽上去很高大上，無論有多貴重，都是由三部分組成的：離子源+質量分析器+檢測器。

一台質譜可以不止一個離子源＼分析器＼檢測器，可以把幾種串聯起來，針對不同分析需要來使用。

離子源

我們先來說說離子源。蛋白質譜所使用的ESI（Electrospray ionization）電噴霧離子化，對蛋白質組學來說是一個標志性的發明！因為是直接從液相進行離子化，使它與LC（液相色譜）的聯用變得更加容易了，我們可以先用LC將非常復雜的肽段混合物進行預分離，減少每次分析物的復雜度，然後分離的肽段可以直接進入ESI，形成電離噴霧。

那麼，ESI噴霧是怎麼形成的呢？簡單來說，分離柱前端有一個小開口，被分析物根據質量及電荷的不同，依次通過前端的小開口。小開口處加了電壓，剛開始，靜電力與表面張力相同，當加大靜電力使它大於表面張力的時候，液膜破裂，形成無數帶電的小液滴，就形成噴霧了。像現在比較新的nanoESI技術，LC的流速就更加慢，離子化的效果也更好。覺得以上描述還不夠形象的童鞋，直接看圖吧：

質量分析器

說完了離子源，接下來我們來說質量分析器，這是質譜儀里最重要的一部分。我們通常聽到的各種質譜儀的名字，就是根據質量分析器的類型來命名的。我們樣品中各組分在離子源中發生電離，並經加速電場的作用後，形成離子束，進入質量分析器中。質量分析器將帶電離子根據其質荷比加以分離，記錄各種離子的質量數和豐度，用於後續定性與定量的分析。

質量分析器有兩個主要的技術參數：質量范圍和解析度。質量范圍是指是所能測定的質荷比的范圍，它決定了咱們能檢測到的離子的范圍。比如，ESI離子源能產生許多m/z大於3000的離子，如果你選的質量分析器的上限達不到3000，那麼3000以上的離子你就檢測不出來了。

然而，另一個更為重要的指標，就是質量分析器的解析度！先上個公式描述：

解析度=觀測的一個質譜峰的質荷比/半峰高處的峰寬（FWHM）

啥意思呢？比如下圖中最左邊的那個峰，它的質荷比是1,085.55，峰高一半的地方的峰寬值是0.217，於是：

解析度=1,085.55/0.217=5,000

如果這么講還是不太明白，那你可以簡單理解為，質譜解析度越高，我們將得到越尖越細的譜峰。你可能會問：譜峰又尖又細的好處是什麼？這是個好問題！事實上，解析度可以表徵兩個相鄰的譜峰在質譜中被區分開的能力。大家通過下圖感受一下不同解析度的質譜儀能給我們多麼不同的譜峰圖。

圖中以Glucagon（胰高血糖素）為例，展示了不同解析度的質譜儀給出的譜峰。當解析度是1000時，只能看一個很寬的峰（藍色）；解析度增加到3000時，峰窄一些（紅色），但還感受不到明顯的差別；當提高到10000時，很明顯能看到，其實這里包含了8個峰（綠色）；再提高到30000的時候，半峰寬更窄，兩個相鄰的峰可以徹底地被分開（黑色）。顯然，我們在解析度為1000或3000，不能准確的檢測被分析肽段的精確分子量， 從而導致譜圖無法匹配或者發生錯配。

不同的質量分析器有不同的解析度，通常的順序是：傅里葉變換質譜解析度最高，但造價太貴；其次是Orbitrap（軌道阱系列），解析度遠遠高於其它質譜；再次是TOF（時間飛行質譜）；然後是離子阱（Ion Trap）；最後是四級桿質譜（Quadrupole）。

這里我多說一句，解析度高固然好，但價格肯定就貴，選擇質譜儀的時候要根據咱們自己的研究目的以及預算范圍啦！

二級質譜

然而，要對肽段進行鑒定，一級質譜顯然是辦不到的，我們沒法根據肽段離子m/z的值就推斷出這個肽段由哪些氨基酸殘基組成（可能的組合非常多），以及序列順序是怎麼樣的，對吧？所以，鑒定肽段還需要二級質譜。

什麼是二級質譜呢？簡單來說，肽段混合物通過一級質譜得到了一級譜圖，然後從中選擇一個肽段，通過一些方法，比如，與隨性氣體進行碰撞，把肽段碰碎，得到碎片離子，再形成二級譜圖。我們通過觀察碎片離子的質量分布來推斷肽斷的殘基組成，最後再反推出蛋白質是什麼。上個圖，幫助大家理解一下二級質譜是怎麼來的。

在上一段，我提到是從一級質譜中「選擇」一個肽段進入二級質譜。這里看似講得雲淡風輕，事實上怎麼選卻是一個很關鍵的問題！通常選擇的方法我們可以叫做「TOP」法（這是我自己起的名字），比如TOP15就是指從一級譜里選前15個高度的峰，每一次分離一個肽段，然後對這個肽段進行掃描，得到二級譜圖。

大家發現了沒有？如果一個肽段在一級譜圖中沒有進入TOP15，那它連打二級譜圖的資格都沒有！原來質譜的世界競爭也是如何殘酷！二級質譜能掃描哪些肽段是由一級質譜決定的，所以我們將這種方法稱為「數據依賴性採集（DDA, data dependent acquisition）！

明白了吧，DDA這個名字就是這么來的！下次大夥兒再聽到有人說DDA，心裡不會再一百個問號飛過了吧？

咱們細想一下就不難發現，如果一個蛋白的濃度不夠高，也就是說，它的肽段在一級譜圖中很難成為那些TOPs，那麼它能進入二級質譜的可能性基本上沒有。這就是為什麼低峰度蛋白很難被鑒定到！這也就是為什麼我們在做比如血液這種樣品的時候，一定要去除血紅蛋白等高峰度蛋白（如果你想鑒定的蛋白不是血紅蛋白的話）！

很顯然，DDA方法的局限性就擺在那裡！這叫想要研究低峰度蛋白的科學家們怎麼忍？於是，一種叫做數據非依賴性採集（DIA）的新方法就應運而生了！關於這種方法的原理，下一篇推文會詳扒。

我們再通過以下這個圖來感受一下一級譜圖與二級譜圖之間的關系：

比如，第一個時間點，我們先進行MS1掃描，然後選一個峰高的肽段進行MS2掃描，依次類推。在一些掃描速度比較快的質譜儀里，一個MS1譜圖可以進行80張MS2的掃描。

鑒定碎片離子

好，我們搞清楚了二級質譜是怎麼來的，那麼我們怎麼根據檢測到的離子信息來推測這是什麼氨基酸呢？可能你會說，這還不簡單么？根據分子量呀！

沒錯，不同的氨基酸，它的分子量不就是一個簡單的值嗎？然而，這件事卻並沒有這么簡單，因為這個世界上還存在一個神奇的東西，它的名字叫同位素！

比如說碳元素，最常見的是原子量12的這種，我們叫C12，然而它還有一個同樣很穩定的好基友，C13（多一個中子）。於是，我們得考慮到這兩種穩定同位素的含量（網路說C13占 1.11%，C12佔98.89%），對於一個氨基酸而言，我們就會得到兩個不同的分子量：

為啥說平均呢？因為當肽段分子量越大，含有各種同位素的可能性及不同組合就越多，我們如果把每一種組合都算一遍分子量，這樣會得到一個長長的list，到時候做譜圖匹配時用哪一個值呢？也沒譜。所以乾脆用一個平均值來表示。

我們通過下表來感受一下各種不同的氨基酸殘基的單同位素分子量與平均分子量有多大的區別：

可能你又會問，這兩個不同的分子量分別在什麼情況下用呢？這里又要說到解析度了，如果咱們用的是高解析度質譜儀，不同的同位素峰會被明顯地分開，也就是說，譜圖里我們能看幾個同位素峰，這時我們就可以使用單同位素分子量，可以與相應的單同位素峰准確對應。但在低解析度質譜儀里，這些峰很可能混在一起，看上去只是一個峰，這種情況下，也沒辦法，只能用平均分子量去近似一下了。

下面這個圖可以很形象地展示出，單同位素分子量與平均分子量在質譜圖上差別有多大。在高分辨質譜看來，這完全就是兩種不同的離子了。上面我們也說了，根據平均分子量來計算，結果並不準確，但用單同位素分子量來計算，就可以准確對應了。

除了同位素，還有一個因素我們也需要考慮，那就是肽段碎裂進入二級質譜時，可能會形成三種不同的離子類型，這就是我們通常所說的by離子，ax離子和cz離子。

之所以會形成不同的離子對，是因為不同的碎裂方法，造成肽段斷裂的位置不同。大夥兒看看上面這個圖就明白了。當我們使用CID（碰撞誘導解離）或HCD（High-energy C-trap Dissociation）碎裂時，與惰性氣體碰撞的是C-N鍵這里，C端生成y離子，N端生成b離子，這是二級質譜產生的最常見的離子對了。當我們使用ETD（電子轉移解離）碎裂時，因為有一個電子反應的過程，在加上電子後才產生的碎裂，它的斷裂位置可能出現在N-C鍵這里，形成cz離子，而TOF類儀器可能會產生ax離子。

離子類型的信息需要傳遞給後續的搜庫步驟（通常我們在搜庫軟體中指定了儀器類型，軟體就會自動匹配離子類型），計算機需要模擬最可能的碎裂位置，生成對應的理論譜圖，然後拿來與實際譜圖比對。我們以by離子為例，來看看對一個肽段來說，它可能碎裂成哪些碎片離子：

那麼它可能會生成如下這樣的譜圖：

從譜圖上看，這個肽段所有的by離子都檢測到了。通常來說，對於豐度不錯，長短合適的肽段，在高精度質譜儀上被完整捕獲到的情況是很常見的。通常情況下50%-80%的by離子都能被捕獲到。

下篇繼續講定性檢測里的搜庫工具、結果評估，以及定量檢測的各種背景知識。

⑺ 蛋白質組學研究的主要步驟

蛋白質組學研究的主要步驟如下：

1、蛋白質樣品的制談喊備：蛋白質樣品的制備是蛋白質組學研究的首要環節，也是最為重要的部分。蛋白質樣品的質量直接影響到科學研究的真實性和可信度。

2、蛋白質的分離：雙向凝膠電泳技術是目前最基礎和常用的蛋白質分離方法，它能將數千種蛋白質同時分離與展示的分離技術。雙向電泳分為等電聚焦電泳和SDS-PAGE兩個步驟，即先進行等電聚焦電泳，按照pI的不同將蛋白分離，然後再進行SDS-PAGE 按照分子量的大小不同對蛋白進行分離。

蛋白質的用處：

1、蛋白質是建造和修復身體的重要原料，人體的發育以及受損細胞的修復和更新，都離不開蛋白質。

2、蛋白質也能被分解為人體的生命活動提供能量。